专利名称：鱼类基因原位修饰育种的方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程育种的方法，尤其是涉及一种鱼类基因原位修饰育种的方法。
背景技术：
遗传育种过程是一个基因组操作的过程，基因工程育种基于对基因功能和调控机制的认识，在分子水平上对基因组实施修饰和改造，从而获得定向遗传改良的遗传品种，摆脱了物种间遗传堡垒的桎梏，从遗传资源的被动利用转向积极的改造创新。1982年，Palmiter等将大鼠生长激素基因转移到小鼠受精卵中，培育出了快速生长的“超级小鼠”，这一突破性成果开创了转基因动物研究的新纪元。1985年，中国科学院水生生物研究所在世界上率先开展了鱼类基因工程定向育种研究，建立了完整的转基因鱼理论模型和完善的实验技术体系，揭示了外源基因整合的动力学过程，提出了转基因鱼形成的模型理论和培育纯合转基因鱼品系对策，为转基因鱼育种奠定了理论基础。目前，全世界有数十个实验室开展了鱼类基因转移研究，建立了显微注射、电融合及精子携带法等多种基因转移方法，获得了快速生长的转基因鲤、大马哈鱼、虹鳟、大西洋鲑和罗非鱼等，规模化养殖试验在进行中。虽然基因工程定向育种技术已取得突破，但是，基因工程育种的目的还未能达到，外源基因的随机整合、外源基因非可控表达、转基因鱼生物安全性等问题严重影响了这一基因工程育种技术在鱼类育种上的有效应用，成为制约转基因鱼研究进一步发展和推广应用的瓶颈。因此，现有技术的缺陷是它是采用外源基因随机整合来完成基因工程育种的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用同源重组来进行鱼类基因原位修饰育种的方法。
本发明所采用的技术方案是，本发明包括下述步骤1)分离鱼的β-肌动蛋白基因启动调控序列、生长激素基因启动调控序列及其侧翼序列；2)以鱼的基因中的所述生长激素基因启动调控序列作为同源重组的靶DNA片段；3)通过同源重组将所述β-肌动蛋白基因启动调控序列替代所述生长激素基因启动调控序列；4)构建同源重组载体A)所述同源重组载体包括生长激素启动调控序列5′侧翼序列、生长激素启动调控序列3′侧翼序列、β-肌动蛋白基因启动调控序列、绿色荧光蛋白正向标记基因及两个同向的Cre/loxP序列、红色荧光蛋白负向标记基因；B)所述生长激素启动调控序列5′侧翼序列作为同源长臂，所述生长激素启动调控序列3′侧翼序列作为同源短臂；C)将所述两个同向的Cre/loxP序列分别置于所述绿色荧光蛋白正向标记基因的两侧，然后将所述绿色荧光蛋白正向标记基因置于所述同源长臂与所述同源短臂的内侧；D)将所述红色荧光蛋白负向标记基因置于所述同源长臂与所述同源短臂的外侧；E)经限制性内切酶消化，得到线性重组DNA片段；5)鱼进行人工授精后，在第一次卵裂前，采用显微注射方法，将所述同源重组载体导入受精卵，随后受精卵在实验室26℃～30℃的无菌环境中孵化；6)在荧光解剖镜下筛选仅出现绿色荧光的胚胎，获得同源重组的嵌合体；
7)PCR法和Southern杂交法检测确认发生同源重组的细胞或胚胎。
本发明的有益效果是由于本发明利用同源重组进行鱼类基因原位修饰来进行育种，避免了外源基因的转移，将极大地消除人们对转基因生物安全性的疑虑；又由于本发明通过构建同源重组载体，建立高效的基因同源重组技术，使人类按设计对鱼类的基因结构进行定点、定量地改变，从而定向改变细胞或整体本身的遗传结构和特征。本发明实施内源基因原位修饰及内源基因的可控表达，建立了一种鱼类基因工程育种技术平台，对鱼类基因工程育种、生物反应器研制以及基因功能、表达调控和发育生物学研究都具有重大理论指导意义和潜在应用价值。
图1是本鱼类基因组的结构示意图；图2是本发明同源重组载体的结构示意图；图3是本发明同源重组筛选后的重组体的结构示意图；图4是本发明同源重组载体的构建过程示意图。
具体实施例方式
以斑马鱼为例，在图1、图2、图3中，1代表斑马鱼生长激素基因(GH)启动调控序列5′侧翼序列(作为同源长臂)片段，2代表GH启动调控序列(GH-promoter)片段，3代表生长激素基因(GH)启动调控序列3′侧翼序列(作为同源短臂)片段，4代表β-肌动蛋白基因(β-actin)启动调控序列片段，5代表两个同向的Cre/loxP序列片段，6代表绿色荧光蛋白(GFP)正向标记基因片段，7代表红色荧光蛋白(RFP)负向标记基因片段，8代表正向PCR检测引物，9代表反向PCR检测引物，10代表同源短臂3′侧翼序列非靶位DNA序列片段。
下面结合附图对本发明的实施方式作具体说明
1.获取目的基因用PCR法扩增斑马鱼的β-肌动蛋白基因(β-actin)启动调控序列、生长激素基因启动调控序列及其侧翼序列。
2.同源重组载体构建(A)同源重组技术说明本发明采用一种基因同源重组的双重荧光筛选方法，在胚胎中利用双重荧光筛选发生同源重组的细胞，不需要胚胎干细胞和胚胎嵌合体操作。本发明采取以下技术措施基于正向选择和负向选择原理，构建双重荧光筛选同源重组载体，其步骤是(1)以斑马鱼基因中生长激素启动调控序列(GH-promoter)作为同源重组的靶DNA片段；(2)绿色荧光蛋白(GFP)基因为正向选择基因，置于同源DNA片断内侧；(3)红色荧光蛋白(RFP)基因为负向选择基因，置于同源DNA片断外侧。(4)同源重组载体中将β-肌动蛋白的启动调控序列(β-actin promoter)与绿色荧光蛋白(GFP)连接，再通过同源臂与红色荧光蛋白(RFP)连接。经限制性内切酶消化，得到线性重组DNA片断，采用显微注射方法将同源重组载体导入斑马鱼受精卵中。在非同源重组的细胞中，将可同时观察到绿色荧光和红色荧光；在发生同源重组的细胞中，由于置于同源DNA片断外侧的红色荧光蛋白(RFP)基因在DNA分子同源重组过程中被切除，只能观察到绿色荧光(GFP)。在荧光解剖镜下筛选仅出现绿色荧光的胚胎，即可获得同源重组的嵌合体。
(B)如图2所示，本发明同源重组载体的构建过程是同源重组载体所用的正负标记基因分别为绿色荧光蛋白基因(GFP)和红色荧光蛋白基因(RFP)。为了方便把GFP和RFP连接到质粒pBluescript IISK(-)(pBSK)多克隆酶切位点(MCS)中，首先用分别从pEGFP和pDSRFP中PCR出强启动子CMV、GFP/RFP、SV40加尾信号及其polyA，再用融合引物PCR出剔除MCS的完整GFP/RFP基因片断(PCMV-GFP/RFP-SV40-polyA)。同时通过PCR，在RFP的5′端引入Apa I和Sph I酶切位点，在其3′端引入ApaI酶切位点。Apa I单酶切插入pBSK中并通过测序调出方向正确(逆时针)的克隆(pBSK-RFP)，Sph I的引入是为了下一步定点生长激素(GH)同源短臂的亚克隆。为了实现“全鱼基因”，从定点同源重组整合的阳性鱼中剔除外源的GFP基因序列，PCR时在GFP片断的两末端引入同方向的Cre/loxp序列。在GFP扩增引物的5′端加上BamH I酶切位点，在其3′端加上EcoR I酶切位点以便通过BamH I和EcoR I双酶切定向克隆到pBSK-RFP中(pBSK-GFP-RFP)。
从斑马鱼基因组中PCR出β-actin的启动调控序列(2251bp)，利用PCR上下游引物中携带的EcoR I和Sal I酶切位点用双酶切定向克隆到pBSK-RFP-GFP中(pBSK-GRP)。通过基因组步行的方法PCR出GH启动调控序列3′侧翼序列(1.7kb、2.8kb)和其启动调控序列上游序列即5′侧翼序列(2.5kb)并分别直接连接到pGEM-T vector中(pGEM-T-GH和pGEM-T-Pgh)，GH同源短臂通过Sal I和Sph I其同源长臂即启动调控序列上游序列(5′侧翼序列)通过用Sac II和BamH I分别从pGEM-T-GH和pGEM-T-Pgh中切出并依次通过双酶切定向连接到pBSK-GRP上，最后利用pBSK上MCS两侧的BssHII酶切位点，用BssH II单酶切消化释放出所需的线性DNA片段。
3.同源重组载体显微注射至斑马鱼受精卵斑马鱼人工授精后，在第一次卵裂前，采用显微注射方法，将同源重组载体导入受精卵，随后受精卵在实验室26℃～30℃无菌环境中孵化。受精卵的最佳孵化温度为28℃4.荧光观察和同源重组阳性胚胎筛选在非同源重组的细胞中，将可同时观察到绿色荧光和红色荧光；在发生同源重组的细胞中，由于置于同源DNA片断外侧的红色荧光蛋白(RFP)基因在DNA分子同源重组过程中被切除，只能观察到绿色荧光(GFP)。在荧光解剖镜下筛选仅出现绿色荧光的胚胎，即可获得同源重组的嵌合体。
5.阳性同源重组细胞的PCR检测正向检测引物设在载体的正向选择基因绿色荧光蛋白(GFP)基因上，反向检测引物设在基因组同源短臂非靶位DNA顺序上，发生同源重组的细胞或胚胎经PCR和Southern杂交法来进行检测确认。
本发明的同源重组效率为4/1600，将同源重组载体显微注射5000个受精卵，正常发育到鱼苗期1600尾，其中有4尾为阳性同源重组鱼。经过基因原位修饰的斑马鱼，其生长发育速度比对照组快一倍，即对照组鱼生长至性成熟需3个月左右，而本发明获得的基因修饰鱼只需1个半月左右。
斑马鱼β-actin的启动调控序列1 tgtgcgcaca gattctgtgt gggcctagtc attacctata ctcaacgttt51 actctgagaa acttccatat tttagaggta aaatgctcag aattgtaaaa101 agtcttgtca aaatacttgg aatttgccaa aaacaaaata aaagtcacat151 cacctcattg tccttggtat cagcaagcac ttttaacaca atcagctgtt201 tttgtttata actcccactg aaggccatgt gcattactcc caagttacac251 agtaaaaagt cacatgtagt ttatcatgat cactgctgct caagcacagc301 tttatctgtt attcagtgtg gcaatatctg aaatgtgtgc aaaatattat351 ttattgtagc tgatcaccaa cactttcagt gttttttttt tctactttta401 atgagaatta tgttcttagg atttatcctt ataaacctct ttaaaaagaa451 atgttatgtc tgcatagaca cgacatgaaa ttatgaacag aaaatttaac501 tatttaagat caagacttga catataacat ttctaatgaa cattaaacct551 gaggtaggcc cacttgcaaa aatgtaactg ctatcactca ctttatacat601 cattgtgtaa cttgtacaca caaaaatagt gaagcaatgt ggcatggaat651 gcaggtccca ttcattcaaa gttattaaag cactttctta aagtgcatta701 ctactgagct aagaccagct agttgctcat acaacatact acaagtagtg751 tcatcctaat ttggataaaa aaaatgtcca ttttatacat ggaaaagtac801 tcattagatc ccccattgtt tgtattacgg tatttcgtga acacaagagg851 taaatgacct acagagctgc tgttgtgtta gattgaaaac acaacacagg901 atcatggagg catccatcat tatgacgcat tctgccactt gtaactctgc951 acagactttt tgaaaagttt aattgagtct tggcgttgtc gcagaaaaat1001 acgaaaaatt ctgtgttaaa atttgcaaat aaaaattcca gttttatagg1051 aaatcgccat ggccttgttc tttaaccagt taagcttccc cttctttcac1101 tctcaagttg caagaagcaa gtgtagcaat gtgcacgcga cagccgggtg1151 tgtgacgctg gaccaatcag agcacagagc tccgaaagtt taccttttat1201 ggctagagcc gggtatgtgc cgtcatataa aagagcgcgc ccagcttttc
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权利要求
1.一种鱼类基因原位修饰育种的方法，其特征在于，它包括下述步骤1)分离鱼的β-肌动蛋白基因启动调控序列、生长激素基因启动调控序列及其侧翼序列；2)以鱼的基因中的所述生长激素基因启动调控序列作为同源重组的靶DNA片段；3)通过同源重组将所述β-肌动蛋白基因启动调控序列替代所述生长激素基因启动调控序列；4)构建同源重组载体A)所述同源重组载体包括生长激素启动调控序列5′侧翼序列、生长激素启动调控序列3′侧翼序列、β-肌动蛋白基因启动调控序列、绿色荧光蛋白正向标记基因及两个同向的Cre/loxP序列、红色荧光蛋白负向标记基因；B)所述生长激素启动调控序列5′侧翼序列作为同源长臂，所述生长激素启动调控序列3′侧翼序列作为同源短臂；C)将所述两个同向的Cre/loxP序列分别置于所述绿色荧光蛋白正向标记基因的两侧，然后将所述绿色荧光蛋白正向标记基因置于所述同源长臂与所述同源短臂的内侧；D)将所述红色荧光蛋白负向标记基因置于所述同源长臂与所述同源短臂的外侧；E)经限制性内切酶消化，得到线性重组DNA片段；5)鱼进行人工授精后，在第一次卵裂前，采用显微注射方法，将所述同源重组载体导入受精卵，随后受精卵在实验室26℃～30℃的无菌环境中孵化；6)在荧光解剖镜下筛选仅出现绿色荧光的胚胎，获得同源重组的嵌合体；7)PCR法和Southern杂交法检测确认发生同源重组的细胞或胚胎。
全文摘要
本发明提供一种鱼类基因育种的方法，旨在提供一种利用同源重组来进行鱼类基因原位修饰育种的方法。该鱼类基因原位修饰育种的方法是按下述步骤进行的(1)分离鱼的特定基因(如生长激素基因/肌动蛋白基因等)侧翼序列/启动调控序列DNA片段，构建以肌动蛋白基因启动调控序列置换生长激素基因启动调控序列的同源重组载体；(2)将上述同源重组载体显微注射到斑马鱼胚胎，筛选阳性同源重组置换鱼苗；(3)分析内源基因修饰鱼类的相关基因表达水平和遗传表型。本发明可用于鱼类育种。
文档编号C12N15/85GK1647624SQ20041001524
公开日2005年8月3日 申请日期2004年1月21日 优先权日2004年1月21日
发明者吴玉萍, 朱作言, 胡炜, 徐安龙 申请人:中山大学, 中国科学院水生生物研究所