专利名称：中枢神经系统干细胞的原位修饰和处理的制作方法
技术领域：
本发明涉及经遗传或后生方式对哺乳动物中枢神经系统(CNS)内源性前体细胞的原位(体内)修饰和处理以及用于诱导CNS前体细胞原位修饰和处理的组合物。更具体地说，本发明涉及直接原位(体内)处理内源性前体细胞以达到使用它们作为向CNS释放药剂的载体或诱导其分裂、分化和迁移以取代机能障碍细胞或因损伤或疾病而丢失的细胞的目的的方法。
哺乳动物神经系统的发育在胚胎发育的早期开始并持续到出生后的早期。哺乳动物中枢神经系统(CNS)由三种类型的细胞组成神经元，星形胶质细胞和少突神经胶质细胞。而神经元首先在胚胎期产生，少突神经胶质细胞和星形胶质细胞在出生后的早期产生。到出生后晚期时，CNS具有全套神经细胞。
不象在不同组织发现的许多其它细胞，成年哺乳动物CNS的分化细胞具有很少或没有进入有丝分裂周期和产生新神经细胞的能力。而据信星形胶质细胞具有有限而缓慢的更新[Korr et al.，J.Comp.Neurol.150169，(1971)]并存在有少突神经胶质细胞的始祖细胞[wolsgijk and Noble，Development 105386，(1989)]，但不存在新神经元的产生。一些哺乳动物种类(例如大鼠)在有限的成年大脑区(如齿状回和嗅球)表现出有限的产生新神经元的能力[kaplan，J.Comp.Neurol.195323，(1981)；Bayer，N.Y.Acad.Sci.457163，(1985)]，但这不适用于所有哺乳动物；在成年灵长类中不发生新CNS细胞的产生[Rakic，Science 2271054，(1985)]。在大多数哺乳动物(且特别是灵长类)中这种不具备产生新神经细胞的能力对长期记忆保持可能有利，然而当需要取代由于损伤或疾病产生的损失的神经元细胞时它明显是一种缺点。
CNS紊乱包括许多疾病，如神经退化疾病(例如Alzheimer氏病和Parkinson氏病)，急性脑损伤(例如，中风，头损伤，大脑麻痹)和大量CNS机能障碍(例如抑郁，癫痫和精神分裂症)。在最近几年里，神经退化疾病成了一个重要的问题，因为大量的老年人极有可能发这些疾病。这些疾病(包括Alzheimer氏疾病，多发性硬化，Huntington氏疾病，肌萎缩性侧索硬化和Parkinson氏疾病)与CNS特定位置的神经细胞退化有关，导致这些细胞或大脑区域不能完成其应有的功能。除了神经退化疾病外，急性大脑损伤常导致神经细胞的丧失，使受影响的大脑区功能丧失并从而导致行为反常。很可能大多数CNS功能障碍的特点(对于受影响的人数)不是神经细胞的丢失，而是现存神经细胞的功能反常。这可能是由于神经元的不合适的发放，神经递质的反常合成、释放和加工。一些这种机能障碍已被充分研究和表征(如抑郁和癫痫)，而对其它的则所知较少(如神经机能症和精神病)。
目前，对CNS紊乱的治疗主要是通过施用药用化合物。不幸的是，这类治疗充满了许多复杂的情况，包括有限的运输药物通过血脑屏障的能力和长期施用这些药物的病人获得的药物耐受性。例如，用左旋多巴已实现了对Parkinson氏病人产多巴胺活性的部分恢复，左旋多巴是能穿过脑血屏障的多巴胺前体。然而，病人变得对左施多巴作用具有耐受性。因此，为了维持其效力需要不断增加剂量。而且有许多与左旋多巴有关的副作用，如增加的且不能控制的动作。
最近，神经组织移植的概念被应用于治疗神经退化疾病如Parkinson氏疾病。
正在出现的治疗神经紊乱的技术需要将细胞移植进CNS以取代或补偿宿主神经细胞丧失或功能反常。尽管在人类试验中胚胎CNS细胞产生了最佳结果[Winderet al.，New Eng.J.Med.3271556，(1992)]且是优选的供体组织，但由于论理的和政治方面的考虑限制了这些细胞的使用，从而正在开发其它类型的供体组织。这些包括遗传修饰的神经细胞系[Renfranz et al.，Cell 66173，(1991)]；Synder et al.，Cell681，(1992)]，成纤维细胞[Kawaja，et al.，J.Neurosci.，122849，(1992)]，肌肉细胞[Jiaoet al.，Nature 363456，(1993)]，胶质祖先细胞[Groves，et al.，Nature 362453，(1993)]和被囊细胞[Hoffman et al.，Exp.Neurol.132100(1993)]。
尽管目前现有的神经紊乱治疗方法中移植方法代表了一种显著的进步，但它们存在许多明显的缺陷。例如，移植时，一些细胞类型不能与宿主组织整合。另一缺陷是供体和宿主间的免疫不相容性可能导致植入细胞的排异作用。还存在移植细胞导致肿瘤形成或将感染性病原体从供体组织传给宿主的潜在可能性。移植方法的另一明显的缺陷是由于该方法是侵入性的，与任何大的神经外科手术一样，可能发生损伤健康大脑的危险。
Leblond[NCI Monograph，1419，(1963)]根据群体中细胞更新率将成年哺乳动物组织分成三类。它们是1.静态群体，如神经系统，很少或不分裂，在发育期间形成的细胞保持到动物死亡。
2.具有有条件更新的细胞群体之组织，如肝脏，其中在正常状态下很少有细胞分裂，但对合适的刺激作出反应时产生新细胞。
3.连续更新群体，如血液和扁平上皮，其中分化的细胞寿命短并且不断被称为干细胞的细胞亚群体取代。
干细胞的重要鉴定特征是其表现出自我更新或产生更多自身细胞的能力。干细胞最简单的定义是具有自我维持能力的细胞。Potten和Loeffler[Development1101001，(1990)]提供了干细胞更严格(但仍是简单化的)的定义，他们将干细胞定义为“未分化的细胞能够a)增生，b)自我维持，c)产生大量分化的功能性后代，d)损伤后再生组织，e)在这些任选的用途中具有灵活性”。
干细胞的作用是代替自然细胞死亡、损伤或疾病中丧失的细胞。在特定组织类型中干细胞的存在通常与具有高细胞更新的组织相关。然而，这种联系可能不会一直保持，因为认为干细胞在不具有高细胞更新的组织中也存在[例如，肝脏；Travis，Science，2591829，(1993)]。
哺乳动物CNS细胞的更新率低以及成年哺乳动物CNS缺乏对损伤或疾病后的细胞丧失作出反应而产生新细胞的能力导致产生了成年哺乳动物CNS不含干细胞的假设。然而，最近以CNS中分离出了表现出体外干细胞特征的细胞。该细胞在胚胎[Reynolds et al.，J.Neurosci.124565，(1992)]到成年[Reynolds and Weiss，Science2551707，(1992)]期一直存在，表明尽管成年CNS不能对损伤或疾病作出反应而产生新细胞，但具有通过干细胞和其后代以与造血系统相似的方式进行的增生和分化产生新细胞和自我修复的能力。
考虑到在现有技术中关于治疗CNS紊乱的疗法存在的局限和缺陷，很明显在本领域中存在对治疗CNS疾病的方法的需要，用该方法可取代因损伤或疾病丧失的细胞，但不涉及侵入性移植程序和在该程序中存在的缺陷。另外，由于与药用化合物相关的问题，在本领域中需要一种治疗CNS紊乱的方法，该方法涉及由其它CNS细胞直接将化合物传送给CNS，从而避开使用注入泵和避开血脑屏障。
本发明的目的是提供一种通过诱导内源性前体细胞增生/分化和/或在CNS内迁移来取代因损伤、疾病或机能障碍而丧失的细胞的方法。
本发明的另一目的是提供一种经过对内源性前体细胞的遗传的或后生的处理而将药剂传送给CNS的方法。
本发明的再一个目的是提供用于诱导内源性CNS前体细胞增生，分化和/或迁移和/或用于原位遗传修饰CNS前体细胞的组合物。
本发明的还一个目的是提供通过对内源性前体细胞的后生处理用于增加干细胞的体外产率的方法。
用下面公开的方法实现这些目的。与附图结合在一起，从下面的详细描述和所附的权利要求，对本领域的技术人员而言本发明的其它目的和特征是显而易见的。
本文描述了用于原位增生神经前体细胞的方法，其中将一种或多种生长因子施用到中枢神经系统的室中以诱导前体细胞的增生。
本文还描述了用于原位遗传修饰神经前体细胞的方法，其中将遗传物质施用到CNS室中以感染前体细胞。该遗传物质编码的神经药剂选自由生长因子，生长因子受体，神经递质，神经递质受体，神经肽，生长因子合成酶和神经递质合成酶组成的组中。
本文还公开了一种体外增生前体细胞的方法，包含的步骤有将一种或多种生长因子施用到活哺乳动物的CNS室中，取出CNS室中衬里组织，游离该组织以分离前体细胞，将该前体细胞与含有诱导细胞增生的生长因子的培养基接触。
本文还描述了治疗患有由神经细胞丧失或损伤引起的神经紊乱的方法，其中将一种或多种生长因子施用给哺乳动物CNS室以诱导室中衬里的前体细胞之原位增生、迁移和分化以便取代丢失的或损伤的神经细胞。附图的简要描述
图1a-1c显示了从成年脊髓圆锥分离的干细胞产生的分化细胞。从成年小鼠解剖出含脊髓圆锥的组织。分离干细胞并在20ng/ml EGF和bFGF存在的条件下进行培养。用抗MAP-2(图1A)，GFAP(图1B)和O4(图1c)的抗血清经三重标记间接免疫细胞化学分别显示它们产生的神经元，星形细胞和少突神经胶质细胞。
图2显示了各种胸苷杀伤处理后室管膜下(subependyma)增生的细胞数。对照小鼠未接受氚标记的胸苷(3H-胸苷)并认为具有100％的室管膜下细胞群体增生。在第0天接受一系列注射以杀死组成型增生的细胞群体的动物在第8天为对照值的85％。在第0天和第2天接受一系列3H-胸苷注射的动物在最后注射后8天(第10天)为对照值的45％。在第0天和第4天接受一系列3H-胸苷注射的动物在第12天为对照值的85％。这表明在开始杀伤2天后干细胞补充到增生的形式中且到第4天时大多数又变成静止的形式。
图3显示从接受各种3H-胸苷体内处理的动物体外形成的神经团数目。接受相同系列注射的动物如图2所示。对照动物接受盐水注射。最后一次3H-胸苷注射16-20小时后处死小鼠，取出大脑并培养以估测每次胸苷杀伤处理后形成的神经团数目。在第0天接受3H-胸苷(它杀死正常增生的室管膜下细胞)的动物形成的神经团数与对照动物相同，表明在组成型增生的室管膜下细胞不是体外分离的干细胞来源。在第2天接受第二系列注射的动物形成相对于对照值为45％的神经团数。在第4天接受第二系列注射的动物形成几乎与对照动物相同的神经团数，表明形成神经团的多功能干细胞(在诸如表皮生长因子的生长因子存在的条件下体外分离出)来自体内室管膜下相对静止的干细胞群体。
图4a和4b显示对在体内将EGF注入侧室作出反应的室管膜下逆转录病毒标记的前体细胞的增生和迁移。对于图4a和4b的动物，将含有β-半乳糖苷酶基因的复制无能型逆转录病毒注射到其前脑的侧室。另外，图4b的动物具有在注射的相同位置植入的充满33μg/ml EGF的渗透微型泵。6天后固定该两种动物的大脑并进行β-gal组织化学处理。对于对照动物(图4a)，逆转录病毒标记的细胞(空心箭头)的位置紧靠侧室壁。接受EGF注入的动物具有更多标记的细胞。另外，EGF注入过的动物的增生细胞从侧室壁迁移开(线段代表200μm)。
图5显示将EGF体内注入侧室显著增加了体外形成的神经团数目。处死前用33μg/ml EGF充满的注入泵处理动物6天。随后在20ng/ml EGF存在的条件下培养侧室壁，9天后与接受盐水注入同样6天的对照动物相比，体外形成的神经团数目增加4倍。
图6a和6b描绘了单系列的3H-胸苷注射后(图6a)和第一系列2天后进行的第二系列3H-胸苷注射后(图6b)室管膜下重建增生细胞数目所需的时间。如图6a所示，单系列注射1天后相对于对照值(未注射3H-胸苷)仅增生10％的室管膜下细胞。增生细胞数随着时间连续增加，到第8天为止，增生的室管膜下细胞数返回到对照值。当在第一系列2天后进行第二系列注射时，如图6b(空心环)所示，干细胞数减少且增生的群体减少到对照值的50％。当在第一系列4天后进行第二系列注射时(空心方块)，补充恢复室管膜下群体的干细胞数从细胞周期中走出并不再增生。因此它们未被第4天的第二系列注射杀死。在这种情况下，第二系列注射8天后增生的室管膜下细胞数恢复到对照值的85％。
图7显示了在施用生长因子1天和21天时，在CD1小鼠处理的和未处理的腹面带(Subventricular Zone，SVZ)和黑质区(SN)酪氨酸羟化酶(TH)mRNA的相对量。CMF＝来自大鼠B49胶质细胞系+FGF(25μg/ml)+硫酸乙酰肝素(10IU/ml)的条件培养基。E+F+FBS＝EGF(25μg/ml)+bFGF(25μg/ml)+硫酸乙酰肝素(10IU/ml)+25％胎牛血清。SAL＝盐水。NCSVZ＝无插套管的腹面带。本发明的详细描述定义术语“干细胞”指相对静止的未分化细胞，它能增生和产生更多具有产生大量祖先细胞的能力的干细胞，该祖先细胞又可产生分化的或可分化的子代细胞。
术语“神经干细胞”指能产生子代细胞的多功能干细胞，该子代细胞能分化成神经元，星形胶质细胞和少突神经胶质细胞。
术语“祖先细胞”指来自CNS干细胞的未分化细胞。祖先细胞具有有限的增生能力且不能自我更新。它遵循特定的分化途径，并在合适的条件下最终分化成神经元，星形胶质细胞或少突神经胶质细胞。
术语“少突神经胶质细胞”指分化的胶质细胞，它形成围绕中枢神经系统(CNS)轴突的髓鞘质。少突神经胶质细胞的表型是半乳糖脑苷脂(+)，髓鞘质碱性蛋白质(myelin basic protein)(+)和胶质纤维酸性蛋白质(-)[Gal C(+)，MBP(+)，GFAP(-)]。
术语“神经元”指分化的神经元细胞，它具有表型神经元特异性烯醇化酶(+)，神经丝(+)，微管相关性蛋白质(+)或Tau-1(+)[NSE(+)，NF(+)，MAP-2(+)或Tau-1(+)]。
术语“星形神经胶质细胞”指分化的胶质细胞，它是GFAP(+)，GalC(-)和MBP(-)。
术语“神经团”指来自神经干细胞和体外培养的细胞团。至少一些细胞是nestin(+)表型。这种细胞团含有干细胞和/或祖先细胞，可包括或不包括分化的细胞。
术语“前体细胞”指用本发明的方法修饰或处理的活细胞，它来自体内或体外的神经干细胞并包括祖先细胞和干细胞。体外的前体细胞一般以神经团的形式生长，但根据培养条件可能表现出不同的生长方式。前体细胞发现于室管膜下但并不局限于该CNS区。
术语“生长因子”指对前体细胞具有生长，增生，分化，营养或调节效应(单独或与其它生长因子结合)的生物学因子(如蛋白质、肽或其它分子)。
生长因子的例子包括酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF，bFGF)，活化素，双调蛋白，Bcl-2基因产物，骨成形蛋白质(BMP-2)，脑源性神经营养因子(BDNF)，纤毛状神经营养因子(CNTF)，表皮生长因子(EGF)，EGF类配体，来源于胶质的神经营养因子(GDNF)，肝素类分子(如硫酸乙酰肝素)，胰岛素样生长因子(IGF-1)，白细胞介素，巨噬细胞发炎蛋白(MIP-1α，MIP-1β和MIP-2)，神经生长因子(NGF)，来源于血小板的生长因子(PDGF)，视黄酸，促甲状腺激素释放激素(TRH)，转化生长因子α和β(TGFα，TGFβ)，肿瘤坏死因子α(TNFα)和类似物。
术语“神经学药剂”指任何对CNS细胞的功能有用的生物活性物质。例如该术语包括神经递质、神经递质受体、生长因子、生长因子受体和类似物以及用于这些药剂合成的酶。
术语“室”指在中枢神经系统内脑脊髓液流过的任何腔或通道。因此，该术语不仅包含侧室、第三和第四室，还包含中央管和脑导水管。
术语“室组织”指CNS室的衬里组织且包括室管膜下组织，它含有包括CNS干细胞和祖先细胞的未分化细胞的集合。
术语“组成型增生群体”指位于成年哺乳动物前脑侧室室管膜下的分裂细胞群体[见Smart；J.Comp.Neurol.116325，(1961)]，在室管膜下的一些区域它大约占细胞的33％[Morshead and Van der Kooy，J.Neurosci.，12249，(1992)]。
术语“遗传物质”指编码神经药剂的RNA和DNA，该神经药剂选自由生长因子，生长因子受体，神经递质，神经递质受体，神经肽，生长因子合成酶和神经递质合成酶组成的组中。使用本领域已知的遗传修饰技术将遗传物质用于体内或体外感染前体细胞。成年哺乳动物CNS干细胞的体外分离和鉴定已报道了CNS干细胞并描述了其潜在用途[Reynolds and Weiss，Science2551707(1992)；Reynolds et al.，J.Neurosci 124565(1992)；Reynolds and Weiss，Restorative Neurology and Neuroscience 4208(1992)；Reynolds and Weiss，NeuronalCell Death and Repair，ed.Cuello(1993)]。另外，在公开的PCT申请号WO 93/01275，WO 94/16718，WO 94/10292和WO 94/09119中描述了这些细胞的用途。与在其它哺乳动物组织中发现的干细胞一样，CNS干细胞能自我维持并产生大量的后代(包括神经元，星形胶质细胞和少突神经胶质细胞)。
用下面实施例2和上面提及的Reynolds和Weiss的文献及PCT申请中所述的方法可从成年哺乳动物CNS中分离和培养CNS前体细胞。简单地说，上皮生长因子(EGF)反应性干细胞在至少存在一种生长因子的培养基中生长。该培养基优选明确的无血清培养基。用于诱导增生的生长因子包括任何使前体细胞增生的营养因子，包括与细胞表面的受体结合以对细胞产生营养或生长诱导效应的任何分子。优选的具有增生效应的生长因子包括EGF，双调蛋白，aFGF，bFGF和TGFα。也可使用生长因子的各种组合。优选的组合是EGF与aFGF或bFGF。
某些生长因子对前体细胞的增生具有调节效应。这些生长因子可与上述增生诱导性生长因子结合使用以调节增生，例如通过增强或减缓增生或通过改变前体细胞后代的表型来调节增生。对增生具有调节效应的生长因子包括硫酸乙酰肝素，转化生长因子β(TGFβ)，活化素，骨成形蛋白(BMP-2)，纤毛状神经营养因子(CNTF)，视黄酸，肿瘤坏死因子α(TNFα)，巨噬细胞发炎蛋白(MIP-1α，MIP-1β和MIP-2)，神经生长因子(NGF)，来源于血小板的生长因子(PDGF)，白细胞介素和Bcl-2基因产物。
诱导增生的生长因子或生长因子的组合诱导CNS干细胞的增生，干细胞分裂产生未分化的前体细胞团。该细胞团对GFAP，神经纤丝(NF)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)或MBP无免疫反应性。然而，细胞团内的前体细胞对在未分化的CNS细胞中发现的nestin，一种中等丝状蛋白质有免疫反应性。Lehndahl等[Cell 60585-595(1990)]鉴定了nestin标记。可从前体细胞后代分化的与四种细胞类型相关的成熟表型主要是nestin阴性表型。
在分裂素(如EGF或类似物)持续存在的条件下，神经团内的前体细胞继续分裂导致神经团的大小和未分化细胞[nestin(+)，GFAP(-)，NF(-)，NSE(-)，MBP(-)]的数目增加。在该阶段，细胞不贴壁并倾向于形成自由漂浮块特征的神经团。然而，可改变培养条件以便尽管前体细胞仍表达nestin表型，但它们不形成特征性神经团。去除分裂素后，细胞贴壁(多鸟氨酸处理的塑料或玻璃)，变成扁平状并开始分化成神经元和胶质细胞。在该阶段培养基可含血清，如0.5-1.0％的胎牛血清(FBS)。在2-3天内，大多数或全部前体细胞开始对nestin失去免疫反应性并开始表达神经元，星形胶质细胞或少突神经胶质细胞特异性的抗原，分别表现为对MAP-2，GFAP和GalC具有免疫反应性。
使用对神经元特异性烯醇化酶(NSE)，神经纤丝和神经元特异性蛋白质tau-1的免疫反应性也完成了对神经元的鉴定。由于这些标记可信度高，它们对神经元的初级鉴定仍是有用的，尽管神经元也可根据其特异性神经递质表型来鉴定。
使用双重标记的免疫荧光和免疫过氧化物酶方法可分析分化的神经团培养物对神经递质或在某些情况下是负责神经递质合成的酶的表达。作为选择，可使用对肽类神经递质或神经递质合成酶mRNA具有特异性的cDNA或RNA探针进行原位杂交组织化学分析。这些技术可与免疫细胞化学方法相结合以增强对特异性表型的鉴定。如果需要的话，可对上面讨论的抗体和分子探针分别进行Western和northern印迹方法以辅助细胞鉴定。
不表达神经元或星形胶质细胞特异性中等纤丝的细胞以正确的时间方式开始表达少突神经胶质细胞特异性标记。这就是说，细胞首先变成对O4(一种细胞表面抗原)，半乳糖脑苷脂(GalC，一种髓鞘质糖脂)具有免疫反应性，最后变成对髓鞘质碱性蛋白(MBP)具有免疫反应性。这些细胞也具有少突神经胶质细胞特异性形态。
CNS干细胞已从各种成年CNS区域分离，这些区域包括脊髓圆锥(见图1a-1c)，颈和胸脊髓，脑干和下丘脑。在这些各种情况下分离的CNS干细胞表现出自我维持力且产生大量后代。其后代包括神经元，星形胶质细胞和少突神经胶质细胞。因此干细胞存在于成年哺乳动物CNS的多个区域。成年哺乳动物CNS干细胞的体内鉴定和处理上面描述的体外分离，增生和分化CNS干细胞的技术可按下面所述改成体内技术以获得相似的结果。这些细胞的这种体内处理和修饰使因损伤或疾病丢失的细胞被内源性取代，从而避免了将外源细胞移植到病人身上的必要。另外，可通过体内修饰或遗传加工该细胞使它们表达在神经紊乱的治疗中有用的各种生物学药剂。
正常情况下，除了前脑侧室室管膜下区域衬里外，成年哺乳动物CNS在体内处于有丝分裂静止期。这一例外的区域含有细胞周期为12.7小时的组成型增生细胞的亚群体。增生细胞的BrdU和逆转录病毒标记表明这些新产生的细胞既不分化成成熟的神经元或神经胶质也不迁移到其它CNS区域(Morshead and Van derKooy，文献同上)。
以两种机制解释室管膜下的连续增生和细胞恒定数目的维持。每次分裂后一个子代细胞死亡维持了增生群体的恒定数目。这种组成型分裂的群体最终消失且室管膜下相对静止细胞的亚群体可重新构成这种组成型分裂的群体。这种维持增生的室管膜下群体的干细胞类方式与其它组织相似，其中细胞具有较短的寿命且由称作干细胞的相对静止细胞的亚群体重新形成。
正如实施例1的详细描述，使用对这些增生细胞的体内逆转录病毒感染和随后的作为非稀释标记的β-半乳糖苷酶(β-gal)报道基因表达的实验表明随着成年小鼠存活时间的增加(逆转录病毒感染后达28天)，β-gal阳性室管膜下细胞逐渐减少。相对于成活1天的动物，逆转录病毒注射6天后β-gal阳性细胞减少45％，逆转录病毒感染28天后减少97％。使用鉴定含逆转录病毒DNA的单一细胞的嵌套式聚合酶链式反应(PCR)测定了表达β-gal的细胞的减少是因细胞死亡而导致逆转录病毒感染细胞减少，而不是因为β-gal表达的关闭。
BrdU(一种胸苷类似物，它掺入分裂细胞的DNA中)的腹膜内注射揭示了在室管膜下的一些区域内33％的细胞构成正常的分裂群体(见下面实施例9)。BrdU标记的细胞数目随时间减少。BrdU标记后到第30天时，仅3％的分裂细胞仍被标记。BrdU注射30天后少数细胞的重标记证实这些标记的细胞在注射时分裂，且表明在30天的期间内它们是相对静止的。这表明这些细胞是干细胞而不是组成型增生群体的细胞。
上面的两个实施例支持了在整个成年生活期所见的增生的室管膜下细胞恒定数目的维持需要存在偶尔增生以补充组成型增生的群体和自我更新的相对静止的干细胞这一假设。
如实施例5的详细描述，可通过以小于S期时间的间隔在细胞周期时间内注射高剂量的放射性胸苷来杀死组成型分裂的室管膜下细胞。杀死1天后，增生群体为对照的10％。到第8天为止，增生群体恢复到对照水平。如果补充的群体是由正常静态细胞补充进增生形式中，那么在干细胞产生后代重新形成室管膜下群体时第二次杀死将改变组成型增生的群体内的细胞数。当在首次杀死2天后第二次杀死时，8天后组成型增生的群体仅为对照值(未接受胸苷杀死处理的动物)或仅第0天接受过一次杀死的动物(首次杀死的时间)的45％(见图6b)。第二次杀死后即使在第31天室管膜下增生细胞数的减少维持在63％。当在第4天进行第二次杀死时，8天后增生群体恢复到对照值的85％。这些结果表明正常静止干细胞在首次杀死后头两天内补充进增生群体中且到第4天为止不再需要干细胞补充以重新形成室管膜下群体(见图2)。
正如下面实施例6的详细描述，为测室体外干细胞是来自组成型增生的群体，还是来自静止群体而进行了一个实验。以下列方式之一处理动物1组对照给下列各组施用高剂量的放射性胸苷2组第0天3组第0天和第2天4组第0天和第4天最后一次注射后处死动物，以下面实施例2所述的方法从纹状体(包括室管膜下区域)分离干细胞。
在2-4组中杀死了组成型增生的群体。在第3组中也杀死了补充进细胞周期以重新形成室管膜下增生细胞的干细胞。
体外产生的神经团数目1组100％(对照)；2组100％3组45％； 4组85％这些结果证实了当几乎全部消除了室管膜下组成型增生的细胞时不影响可体外分离和增生的干细胞数(1组对2组和4组)。然而，当正常的静止细胞在补充以重新形成室管膜下群体时被杀死(如3组)时，可体外分离的干细胞数明显减少(3组对1、2组)。第一次杀死后到第4天为止大多数干细胞本身不再更新，因此不会被第二系列的氚标记的胸苷注射杀死(因此，与55％的减少[3组]相比仅减少15％[4组])。
上面的结果表明体外干细胞来自体内室管膜下细胞的静止群体(见图3)。这也解释了为什么干细胞可衍生于CNS室区而不是前脑，前脑不具有组成型增生细胞的亚群体。因此，由于确定了室管膜下细胞组成型增生的群体与侧室相对静止干细胞之间的关系，人们可利用这些细胞群体的特征更有效地对它们进行体内处理。该技术使人们能够对内源性细胞进行使用和处理以治疗各种神经紊乱。在体外影响细胞增生和分化的一些因子在体内也产生相同的效应。因此，例如可通过施用生长因子和生长因子的组合物原位处理细胞，从而产生经体外试验测定的特定的结果。例如，对WO 94/10292公开的体外分化方法(其中细胞被引导入特定的分化途径)可使用本文所述的方法进行修改以在体内获得相似的结果。可经过空间定位注射，渗透泵植入或任何其它合适的方法施用生长因子。
静止的神经干细胞位于靠近室区的整个CNS内。位于前脑内的是侧(第一和第二)室。第三室是前脑下部的空腔。中脑腔是管状的脑导水管，将第三室与后脑腔(第四室)连接起来。中央管是脑脊髓液在脊髓内的通道。
CNS干细胞位于室衬里组织的事实对这些细胞的原位修饰和处理以及对影响CNS不同区域的各种神经疾病、紊乱和损伤的最终治疗提供了一些便利。对特定疾病的治疗可进行相应的修改以便对围绕靠近感染区域各室的干细胞使用本文所述的方法进行原位处理或修饰。在几乎所有大脑区域均发现室系统，因此可以较容易地进入受影响的区域。如果需要将干细胞与包含生长因子或病毒载体的组合物接触来修饰干细胞，可较容易地植入一个将组合物释放到室中的装置。例如，可用连接于渗透泵上的插管来释放该组合物。或者，将组合物直接注射进室中。这可使得CNS干细胞的子代迁移到因受伤或疾病损伤的区域。而且，各室与许多大脑区靠得很近使干细胞或其后代分泌的神经药剂得以扩散。
为了治疗Huntington氏疾病，Alzheimer氏疾病，Parkinson氏疾病和主要影响前脑的其它神经紊乱，可将生长因子或其它神经药剂释放到前脑室中以进行干细胞的原位修饰和处理。例如，Parkinson氏疾病是大脑，特别是纹状体多巴胺水平低造成的。因此诱导病人自身的静止干细胞开始进行体内分裂并诱导这些细胞的后代在纹状体受损区分化成产多巴胺细胞，从而局部升高多巴胺的水平将很有利。正常情况下产多巴胺神经元的细胞体位于黑质和中脑相邻区，其轴突伸向纹状体。现有技术中有关大脑产多巴胺神经元的诱导集中在对中脑组织的处理上。现有技术治疗Parkinson氏疾病的方法通常涉及药品L-多巴的使用以升高纹状体中的多巴胺水平。然而，这类治疗的缺陷包括药物耐受性和副作用。另外，将产生多巴胺的胚胎组织移植到Parkinson疾病病人的纹状体中取得了适当的成功。然而，除了治疗方法有争议外，也有与外源组织植入有关的包括组织排异和感染的危险。
本发明的方法和组合物提供了对治疗Parkinson氏疾病所使用的药物和有争议的应用胚胎组织的方法提供了可供选择的其它的途径。通过将含生长因子的组合物施用到侧室上从而增加纹状体多巴胺细胞的水平。特别优选的组合物包含EGF，bFGF和硫酸乙酰肝素的组合。
优选的组合物还包含血清。施用该组合物后，纹状体亚室区酪氨酸羟化酶(TH)(多巴胺细胞标记)信使RNA(mRNA)的转录明显增加，该区域在正常情况下不含产多巴胺细胞体。在实施例11中详细描述了这些方法及结果。在实施例12的详细描述中，显示BrdU+和TH+细胞分布的双重标记组织表明，作为对体内施用生长因子的反应，在纹状组织中出现TH+细胞体。这些新产生的TH+细胞中有许多也是BrdU+。
为了治疗多发性硬化和其它脱髓鞘或髓鞘减少紊乱以及为了治疗肌萎缩性侧索硬化或其它运动神经元疾病，可将生长因子或其它神经药剂释放到中央管中。可用本发明的方法治疗的其它疾病和紊乱公开于PCT申请WO 93/01275中。
除了治疗紧绕室的CNS组织外，可较容易地将病毒载体，DNA，生长因子或其它神经药剂施用到腰池上以便通过循环系统通过CNS。
在正常情况下，室管膜下前体细胞不分化也不迁移，而是经过不确定次数的细胞分裂后，其命运似乎是细胞死亡(Morshead and Van der kooy，文献同上)。这一解释也被上面所述的PCR证据所支持。将生长因子注射到侧室后改变了这一命运。正如在下面实施例1中所作的更详细的描述，连续6天将逆转录病毒注射进侧室。将连接于充满EGF的渗透泵上的插管在逆转录病毒注射的同一天(随后的1或6天)植入侧室6天后导致RV-β-gal标记的细胞总数增加(从20个细胞/大脑的平均值增加到150个细胞/大脑)。
从上面所述的PCR实验已知逆转录病毒注射6天后不存在不表达逆转录病毒DNA的细胞。因此，这些结果表明EGF诱导的β-gal阳性细胞数的增加是由于逆转录病毒标记的组成型增生群体克隆大小的增大引起的。也可能这一增加部分是由于EGF对相对静止的干细胞激活引起的。
令人感兴趣的是，β-gal标记的细胞数的增加伴随着这些细胞从室管膜下经中央和经侧面(且可能是经头部和经尾部)迁移到大约400μm远处(见图4)，并接着进行分化。因此，EGF或相似生长因子的注入诱导体内神经干细胞和祖先细胞的增生、迁移和分化，并在治疗上可用于取代因损伤或疾病丧失的神经细胞。在优选的实施方案中，同时或依次施用EGF和FGF。
通过施用Bcl-2或用bcl-2基因遗传修饰细胞可改变组成型增生的细胞群体的正常命运(即细胞死亡)。在各种细胞类型中已知该基因产物阻止正常的细胞死亡(细胞程序死亡)。与EGF实验相似，获得了组成型增生的细胞群体的克隆增大。
本文描述的体内技术可用于遗传修饰CNS干细胞和祖先细胞。对该细胞任何有用的遗传修饰方法均在本发明的范围内。例如，可修饰细胞以产生或增加神经药剂(例如神经递质，生长因子或类似物)的产生。遗传修饰的进行可通过用重组逆转录病毒感染CNS室区的衬里细胞或使用本领域已知的方法转染[见Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1982)]。可使用任何遗传修饰方法，现在已知的或将来发展的方法均可。至于直接DNA转染，可用粒子轰击，受体介导的释放和阳离子脂质体来修饰细胞。当使用嵌合的基因构建体时，它们一般含有病毒、例如逆转录病毒长末端重复(LTR)，猴病毒40(SV40)，巨细胞病毒(CMV)；或哺乳动物细胞特异性启动子，如酪氨酸羟化酶(TH)，多巴胺β-羟化酶(DBH)，苯基乙醇胺N-甲基转移酶(PNMT)，胆碱乙酰转移酶(ChAT)，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)，神经纤丝(NF)蛋白质(NF-L，NF-M，NF-H和类似物)，它们指导编码所述蛋白质的结构基因的表达。
如果使用逆转录病毒构建体遗传修饰正常的静态干细胞，那么优选使用本文所述的方法诱导这些细胞的增生。例如，可在用逆转录病毒感染前几天使用渗透注入泵将生长因子释放给中央管。这保证了存在易于被逆转录病毒感染的分裂活跃的神经干细胞。
当遗传修饰的目的在于产生物学活性物质质时，该物质一般是对治疗给定CNS紊乱有用的一种活性物质。例如，需要遗传修饰细胞以便它们分泌某种生长因子产物。在治疗CNS紊乱中有用的生长因子产物包括(但不局限于)神经生长因子(NGF)，来自脑的神经营养因子(BDNF)，神经营养素(neurotrophin)(NT-3，NT-4/NT-5)，纤毛神经营养因子(CNTF)和其它细胞因子，双调蛋白，bFGF，aFGF，EGF，TGFα，TGFβ，PDGF，IGFs和白细胞介素。
也可体内修饰细胞以表达某些生长因子受体(r)，包括(但不限于)p75低亲和性NGFr，CNTFr，神经营养素受体的trk家族(trkA，trkB，trkC)，EGFr，FGFr，和双调蛋白受体。
这些细胞可通过设计加工以产生各种神经递质或其受体，如血清紧张素，L-多巴，多巴胺，去甲肾上腺素，肾上腺素，连激肽(tachykinin)，物质P，内啡肽，脑啡肽，组胺，N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)，甘氨酸，谷氨酸，γ-氨基丁酸(GABA)，乙酰胆碱和类似物。有用的神经递质合成基因包括TH，多巴脱羧酶(DDC)，DBH，PNMT，谷氨酸脱羧酶(GAD)，色氨酸羟化酶，ChAT和组氨酸脱羧酶。编码各种可在CNS紊乱的治疗中有用的神经肽类的基因包括物质P，神经肽Y(NP-Y)，脑啡肽，加压素，血管活性肠肽(VIP)，胰高血糖素，铃蟾肽，缩胆囊肽(CCK)，促生长素抑制素，降钙素基因相关肽(CGRP)和类似物。对CNS干细胞增生的体外技术的改进通过如上面所述将生长因子或生长因子的组合(例如EGF，FGF，或EGF与FGF一起)原位注射进室中可显著增加从哺乳动物CNS体外分离的前体细胞数目的绝对产量。如下面实施例10的详细描述，将EGF注入到小鼠前脑侧室6天后，取出室壁并收获干细胞。将EGF注入侧室增加了增生形成神经团的干细胞的产率。
用于CNS干细胞增生的体外技术在技术上的改进对于收获干细胞用于后来移植到病人体内具有无法估量的价值，从而使得初次的手术1)外伤较小，因为要取出较少的组织，2)效率更高，因为每次手术可体外增生更大产量的干细胞。另外，病人的干细胞一旦在体外增生后，也可使用PCT申请WO 94/16718描述的技术进行体外遗传修饰。当需要对用遗传物质的感染进行更好控制时，在某些情况下体外遗传修饰可能比原位技术更必要。
为了更好地理解本文所述的发明，提供了下列实施例。这些实施例仅用于解释的目的而不以任何方式对本发明范围进行限制。
实施例实施例1将含有β-半乳糖苷酶基因的无复制能力的逆转录病毒[见Walsh and Cepko，Science 2411342，(1988)]注射进CD1成年雄性小鼠(25-30g，来自Charles River)的前脑侧室中。根据Walsh和Cepko(文献同上)的方法从BAG细胞系(ATCC CRL-9560)收获注射的逆转录病毒。使用65mg/kg腹膜内注射戊巴比妥钠麻醉小鼠。使用1μl Hamilton注射器将0.2-1.0μl逆转录病毒用单侧空间定位注射方法注射到侧室中。注射的坐标为AP+4.2mm，人字形缝尖前端，L±0.7mm，DV-2.3mm，硬脑膜下，口棒在两耳线下-2mm。
在与逆转录病毒注射后第一天或第6天相同的一天，以上述相同的空间定位坐标将连接于充满3.3-330μg/ml EGF的0.5μl/小时ALZET渗透微型泵上的注入插管以手术方法植入侧室。注入插管全套产品从ALZA获得。将注入插管切成基座下为2.7mm。通过在注射位点对侧和尾侧使用丙烯胶合和颅骨螺丝将泵牢固安装在小鼠颅骨上。渗透微型泵装于左前爪腋窝下面和后面的皮下并以聚乙烯管装置与注入管相连。
EGF初次注入动物6天后用过量的戊巴比妥钠处死动物。用2％缓冲的多聚甲醛经心脏灌注小鼠，摘除大脑并用含20％蔗糖的2％缓冲的多聚甲醛后固定过夜。用-20摄氏温度的恒冷切片机以30μm切片制备冠状切片。按Morshead和Vander Kooy(文献同上)的β-gal组织化学方法处理切片。
在这些条件下，不管逆转录病毒注射后的天数，EGF的注入导致β-gal标记细胞的群体从平均每只大脑20个细胞扩大到平均每个大脑150个细胞并且这些细胞从侧室衬里迁移(见图4)。注入33μg/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)导致β-gal标记的细胞数增加，但这种增加并不伴随着任何其它的迁移。一起注入EGF和FGF导致β-gal标记的细胞群体更大的扩增，从每大脑20个细胞增加到平均每大脑350个细胞。
这些结果表明，FGF可能是室管膜下层相对静止的干细胞的存活因子(Survival factor)，而EGF可能充当组成型增生群体的正常死亡后代的存活因子。一起注入EGF和FGF时β-半乳糖苷酶细胞数的协同增加进一步反映了相对静止干细胞和组成型增生的祖先细胞之间的直接联系。实施例2解剖雌性不含病原体的CD1白化小鼠[3到18个月龄；Charles River(CF1和CF2品种产生相同的结果)]纹状体，包括室管膜下区域，用剪刀徒手切成1mm的冠状缝切面并转移到含124mM NaCl，5mM CK1，1.3mM MgCl2，2mM CaCl2，26mM NaHCO3和10mM D-葡萄糖(pH7.35，大约180mOsmol)的人工脑脊髓液(aCSF)中，在室温下通95％O2-5％ CO2的气体。15分钟后，将组织切片转移进带磁力搅拌器的转瓶(Bellco Glass)中，瓶内装有含124mM NaCl，5mM KCl，3.2mM MgCl2，0.1mM CaCl2，26mM NaHCO3和10mM D-葡萄糖(pH7.35，大约180mOsmol)，在32到35℃通有95％O2-5％ CO2的气体且含1.33mg/ml胰蛋白酶(9000 BAEE单位/mg)，0.67mg/ml透明质酸酶(2000单位/mg)和0.2mg/ml犬尿喹啉酸的低Ca2+aCSF。90分钟后，将组织切片转移到正常aCSF中在研磨前处理5分钟。将组织转移到含0.7mg/ml卵类粘蛋白(Sigma)的DMEM/F-12(A1，Gibco)培养基中，用加热变窄的巴斯德管机械研磨。将细胞涂布到含无血清培养基[包含的确的激素混合物和盐混合物，包括胰岛素(25μg/ml)，运铁蛋白(100μg/ml)，孕酮(20nM)，腐胺(60μM)，和氯化硒(30nM)；葡萄糖(0.6/％)；谷氨酰胺(2mM)；重碳酸钠(3mM)；HEPES缓冲液(5mM)]和EGF[20ng/ml，从小鼠颌下腺纯化(Collaborative Research)]或人重组体(Gibco/BRL)的未覆盖的35mm培养皿(coster)(每板1000个活细胞)。使细胞贴壁3-10分钟，然后吸出培养基，加入新鲜的DMEM/F-12/激素混合物/EGF。体外培养5-10天后在每个35mm培养皿中计数细胞团(神经团)数目。实施例3含人bcl-2基因和β-半乳糖苷酶基因的逆转录病毒构建体显微注射进成年小鼠侧室中。用仅含β-半乳糖苷酶基因的逆转录病毒构建体注射对照小鼠。每个成年侧室组成型增生的室管膜下细胞的两个后代之一在正常情况下在分裂后几小时内死亡。在几个其它组织中bcl-2基因产物阻止细胞的程序死亡。在成年室管膜下，用β-半乳糖苷酶和bcl-2基因感染的单个细胞由于表达这些基因产物而被标记。用抗β-半乳糖苷酶和人Bcl-2特异性抗体在大脑组织切片中鉴别这些细胞。这样感染的增生感染室管膜下细胞相对于对照每克隆产生更大数目的细胞。因此，Bcl-2诱导组成型增生的成年室管膜下细胞每次分裂的正常死亡后代的存活。而且bcl-2感染的后代迁移到纹状体和隔膜组织以产生新神经元和胶质细胞。这表明EGF和Bcl-2充当体内产生新神经元和胶质细胞的组成型增生成年室管膜下细胞正常死亡后代的存活因子。实施例4显微注射含神经生长因子基因的逆转录病毒构建体(按实施例1所述的构建体)以感染侧室的组成型增生的成年室管膜下细胞。因此，这些细胞用于在成年大脑中产生内源性生长因子。感染的细胞产生的神经生长因子水平直接由放射免疫检测和(从直接功能性试验)由Gage和其合作者(P.N.A.S.839231，1986)形成的模型中轴突切断损伤后体内前脑基部胆碱能神经元的挽救来检测。实施例5在第0天使成年雄性CD1小鼠接受一系列3H-胸苷(每次注射0.8ml，比放45-55mCi/mmole，ICN Biomedical)腹膜内注射(每4小时一次，注射3次)以杀死组成型增生的室管膜下细胞。在第0.5，1，2，4，6，8或12天，动物接受2次BrdU注射。其中间隔1小时(见实施例9)，最后一次注射0.5小时后处死动物。
观察到在杀死1天后10％的细胞增生，到第8天为止，增生细胞数达到85％(见图6a)，这与对照值在统计上没有显著的差异。处死动物并按实施例9所述摘取和处理大脑。
在第二组动物中，在第0天进行3H-胸苷注射(注射3次，每4小时1次)，接着在第2天或第4天进行相同的系列注射。第二系列注射后(分别在第9，10和12天)使动物存活8天，在这段时间内它们接受2次BrdU注射并在0.5小时后处死。处死动物并按实施例9所述摘取和处理大脑。
在第2天进行第二系列的注射后相对于对照值仅45％的增生群体恢复。这表明在第2天进行的第二系列注射，当干细胞补充到增生形式中时杀死了干细胞(见图6b)。在第4天进行的第二系列注射导致到第8天时恢复到对照值，这表明到该时间为止，干细胞不再增生，因此第4天的注射系列不杀死它们(图6b)。实施例6成年雄性CD1小鼠被分成4组，A组动物在第0天接受一系列的3H-胸苷注射(注射3次，每4小时1次)。B组和C组动物在第0天接受一系列的3H-胸苷注射，接着在第2或4天进行第二系列的注射。D组动物在与A组动物相同的时间过程中用生理盐水代替3H-胸苷进行注射。最后系列注射16-20小时后以折断颈椎处死各组动物。取出大脑，解剖前脑侧室周围的室管膜下组织并按实施例2所述进行培养以便评价每个注射示例后形成的细胞团数目。将每个大脑的细胞涂布到2个35mm的孔中。体外培养6和8时，在每个35mm孔中计数细胞团总数(见图3)。
接受一系列盐水注射的对照动物形成的细胞团数目与在第0天接受3H-胸苷的动物(杀死正常增生的室管膜下细胞)相同。这表明组成型增生的室管膜下细胞不是体外分离的干细胞来源。在第2天接受第二系列注射的动物形成45％的细胞团数(与体内观察到的增生室管膜下细胞数相似)。当在第4天进行第二系列注射时，体外形成的细胞团数与对照值没有显著的差别，也与体内结果相关。总之，这些资料表明在EGF存在下体外分离的多功能细胞团是从体内室管膜下相对静止的干细胞群体形成的。实施例7将含β-半乳糖苷酶基因的逆转录病毒构建体显微注射(按实施例1所述)进间脑III室，脑干IV室和脊髓中央管中。然后使用含EGF和FGF的微型泵在6天内将生长因子连续施加到施用逆转录病毒构建体的室系统相同部分中(按实施例1所述)。这导致产生β-半乳糖苷酶的细胞数目增加，它存活并迁移进靠近III室，IV室和脊髓中央管的组织中，形成新的神经元和神经胶质细胞。实施例8按实施例1将含酪氨酸羟化酶(TH)基因及β-半乳糖苷酶基因的逆转录病毒构建体显微注射进成年侧室中。然后按实施例1使用含EGF，FGF或同时含EGF和FGF的微型泵在6天内将生长因子连续施用到侧室中。随着感染的室管膜下细胞迁移进纹状体，它们分化成神经元细胞，以使用抗体的免疫荧光和(以直接功能试验)以克服由单侧6-羟基多巴胺病灶产生的旋转偏压(rotational bias)之能力直接测量为该神经细胞产生多巴胺。实施例9用溴脱氧尿嘧啶(BrdU，Sigma，65mg/kg)腹膜内(i.p.)注射成年雄性CD1小鼠(25-30g，Charles River)，每2小时注射一次，共注射5次以便全部标记前脑侧室室管膜下衬里的组成型增生的细胞。1个月后，使用过量的戊巴比妥钠处死动物并使用4％多聚甲醛经心脏灌注。取出大脑并在含20％蔗糖的4％多聚甲醛中后固定(post-fixed)过夜。在恒冷切片机(30μm)上做大脑切片并收集于洗涤缓冲液
中。切片在1M HCl中60℃保温0.5小时，然后在洗涤缓冲液中洗涤3次(每次10分钟)。最后一次洗涤后，切片在anti-BrdU(Becton Dickinson，1∶25)中4℃保温45小时。在第一抗体中保温后，洗涤切片3次并在生物素标记的马抗小鼠第二抗体(Dimension Lab，1∶50)中室温下保温1小时，接着再洗涤3次。然后将切片在抗生物素蛋白连接的FITC(Dimension Lab，1∶50)中室温下保温1小时并洗涤最后3次。在明胶覆盖的玻片上封固切片，空气干燥并用Fluoromount盖上玻片。用NIKON荧光显微镜检查玻片中的BrdU阳性细胞。在靠近胼胝体吻端和通过前连合尾端之间的切片的8个样品中，在围绕侧室的室管膜下计数到BrdU阳性细胞数。发现系列BrdU注射31天后，与系列注射后立即处死的对照动物(对照为100％)相比仍标记3％的室管膜下细胞。实施例10按实施例1所述植入EGF泵。泵植入6天后以折断颈椎处死动物。取出大脑并按实施例2所述分离和计数干细胞。
如图5所示，处死前用EGF注入侧室6天的动物和培养的大脑体外培养9天后与接受相同的6天期盐水泵的对照动物相比形成的细胞团数目多4倍。因此，取出前体细胞前将EGF体内注入侧室极大地增加了体外增生并形成神经团的干细胞产量。实施例11麻醉成年雄性CD1小鼠并放在空间定位装置中。将一个附着于ALZET微型泵上的插管植入每只动物的侧室中。微型泵被植入皮下并用于释放a)加有bFGF(R& D Systems，5μg/ml)及硫酸乙酰肝素(Sigma，10 IU/ml)的条件培养基(来自大鼠B49胶质细胞系，从D Schubert，Salk Institute获得)(CMF)或(b)EGF(Chiron，25μg/ml)加bFGF(25μg/ml)加硫酸乙酰肝素(10IU/ml)加25％胎牛血清(E+F+FBs)或(c)作为对照的无菌盐水(SAL)到侧室中。完成释放计划后一天内一次性处死一批动物，其它动物在20天后处死。将这些小鼠的室管膜下区(SVZs)切出，从未插管的对照侧分离出插管的因而受到处理的一侧。还回收了这些小鼠的黑质(SN)区。使用硫氰酸胍酚方法[Chomzynski and Sacchi，Annal，Biochem.162156-159，(1987)]从这些组织中提取总RNA。然后反转录该RNA产生cDNA。使用设计覆盖酪氨酸羟化酶(TH)信使RNA(mRNA)254核苷酸区的一套引物和定量扩增所需的热循环条件对这些cDNA进行聚合酶链式反应(PCR)。在2％琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳并毛细印迹到带正电荷的尼龙膜上。针对TH的放射性标记的cDNA探计与滤膜杂交并经放射自显影检测。以光密度测定法扫描和分析放射自显影照片以获得的对治疗作出反应的插管侧SVZ中及非插管对照SVZ和SN中的TH mRNA的水平。结果描述于图7的柱状图中。在治疗一天后分析的动物中，施用E+F+FBS在SVZ中获得的TH mRNA水平与应答CMF所获得的相比增加了11倍，应答CMF的水平又比在SAL中所见的水平多2倍。治疗21天后，在F+F+FBS治疗中检测的TH mRNA量与1天后所检测的近似相同，而CMF和SAL处理的SVZ THmRNA水平位于可检测的极限以下并与未插管的SVZ对照无区别。在所有的治疗中，SN具有可测定量的TH mRNA。实施例12对雄性CD1小鼠(Charles River，大约4到6周龄)进行腹膜内注射BrdU(Sigma，120mg/kg)，在24小时期间内每间隔2小时注射一次认标记具有丝分裂活性的细胞。然后将连接于ALZET微型泵上的插管植入每只动物单侧的侧室中以释放实施例11所述的组合物a-c(CMF，E+F+FBS，或无菌盐水)。
施用生长因子24小时后使用致死剂量的戊巴比妥麻醉剂处死动物。然后通过心脏用10ml冷冻的4％多聚甲醛溶液灌注动物。取出大脑，切出从嗅球到第三室，包括纹状体区域的组织，在30％蔗糖/4％多聚甲醛溶液中4℃贮存过夜。然后在干冰上冷冻该组织并在-70℃保存备用。使用恒冷切片机切成30μm的冠状缝切面并将切片放入12孔瓷盘中，其中已加有400μl PBS。用新鲜PBS洗涤切片并与下述第一抗体保温过夜抗TH(兔多克隆抗体，1∶1000，Eugene TechInternational Inc.；或1∶100，Pel-freeze)和小鼠抗BrdU(1∶55，Amersham)，在PBS/10％正常山羊血清/0.3 Triton X-100中配制。在PBS中洗3次后，加入溶于PBS的山羊抗兔若丹明和山羊抗小鼠荧光素(Jackson)并在室温下处理50分钟。然后在PBS中洗涤切片3次(每次10分钟)，放于玻璃片上，干燥并用Fluorsave(Calbiochem#345789)盖盖玻片。
通过定位TH免疫反应性(TH+)细胞，或TH+和BrdU+细胞相对于室的位置测定产多巴胺神经元的位置。应答注入侧室的盐水时，在纹状体中检测到TH+纤维的正常群体，但在该区域检测不到TH+细胞体。CMF处理导致在纹状体和第三室区域中除了TH+纤维的正常群体外，还检测到TH+细胞体。E+F+FBS处理具有最深远的影响，导致检测到大多数TH+细胞体。一些TH+细胞体也是BrdU阳性。实施例13Parkinson疾病的6-羟基-多巴胺(6-OHDA)损伤大鼠模型用于测量将生长因子的各种组合施用到侧室产生的影响。在大鼠模型中进行单侧6-OHDA损伤并观察施转行为。按实施例11所述将微型泵经皮下植入到动物上。将EGF(Chiron，25μg/ml)加bFGF(25μg/ml)加硫酸乙酰肝素(10IU/ml)加25％胎牛血清连续施用给侧室。给对照动物施用盐水。观察克服由单侧6-OHDA损伤产生的旋转偏压的能力。实施例14来自Charles River的成年雄性CD1白化小鼠(30-35g)用戊巴比妥钠(0.40mL 10％的溶液)麻醉并放在空间定位装置上。纵切暴露颅骨背面。将插管插入第四室(空间定位坐标A/P-7.0，L±0.3 D/V-5.8)，大脑导水管(A/P-4.8L±D/V-2.6)或中央管(D/V-1.5)。插管以无菌管连接于位于皮下的含25μg/ml EGF(Becton40001)和/或25μg/mL bFGF(R & D Systems 233-FB)的ALZET渗透微型泵上。含无菌盐水加0.1％小鼠白蛋白(Sigma A3134)的泵用作对照。用牙齿粘固粉封闭切口。
手术6天后用0.15ml BrdU(Sigma B5002；18mg/ml溶于0.007％ NaOH/0.1MPBS)注射小鼠，每隔2小时一次，共8小时。最后一次注射0.5小时后用过量麻醉剂杀死动物，用10ml冰冻无菌盐水及随后用10mL冰冻Bouin氏固定液(5％冰乙酸，9％甲醛，70％苦味酸)经心脏灌注。切下颈脊髓区并在4℃下在Bouin氏后固定(post-fixative)液(9％甲醛，70％苦味酸)中后固定过夜。第二天通过将组织浸入10％蔗糖中2小时，20％蔗糖中2小时，30％的蔗糖中过夜进行低温保护。在粉状干冰中冷冻组织，在Tissue-Tek(Miles 4583)中在-18℃下装片，30μm的系列矢形切片封固到涂有凝胶的载玻片上。每块玻片上还含有1个或多个来自相同动物大脑通过侧室的30μm冠状缝切面作为阳性对照。玻片在-80℃保存备用。免疫组织化学在室温下在0.1PBS中洗涤玻片3×15分钟，用1N HCl在37℃水解60分钟，在0.1M PBS中室温下漂洗3×15分钟，在室温下放入6％ H2O2甲醇中30分钟，在0.1M PBS中室温下漂洗3×15分钟，在溶于0.1M PBS的10％正常马血清(Sigma H-0146)中室温下保温20分钟。在用含1.5％正常马血清和0.3％ Triton的0.1M PBS中1∶50稀释的抗BrdU单克隆抗体(Becton 7580)中室温下将玻片保温过夜。第二天将玻片在室温下在0.1M PBS中漂洗3×10分钟，与生物素标记的马抗小鼠IgG(Vector BA-2000)在室温下保温2小时，在0.1M PBS中室温下漂洗3×15分钟，在ABC试剂(Vector PK-6100)中室温下保温2小时，在0.1M PBS中室温下漂洗3×15分钟，用DAB试剂显影2到4分钟。用AquaPolymount(Polysciences 18606)覆盖玻片。计数每个颈脊髓切片中BrdU阳性细胞数。在盐水对照切片中发现一些BrdU标记的细胞。用EGF或bFGF处理导致BrdU标记的细胞数与对照相比明显增加。EGF加bFGF的组合在每个切片上产生更大量的BrdU阳性细胞。实施例15将EGF和FGF注入侧室中(见实施例1)(或其它含静止干细胞的CNS室区)。然后分离CNS干细胞并使用诸如实施例2所述的增生方法进行体外增生。该程序导致产生的干细胞数增加及神经团数目的增加(见图5)。以该方法产生的神经团用作供体细胞的来源，用于随后移植进入成年CNS退化区。当然，也可从病人自身的CNS干细胞增生神经团并移植回病人体内。
全部参考文献引入本文以供参考。
权利要求
1.一种用于原位增生和任选地分化位于哺乳动物CNS室衬里组织的CNS前体细胞的方法，所说的方法包括给所说的CNS室施用至少一种生长因子以诱导所说的细胞进行增生和/或分化。
2.权利要求1的方法，其中所说的至少一种生长因子是表皮生长因子。
3.权利要求2的方法，进一步包括给所说的室施用成纤维细胞生长因子。
4.权利要求1至3中任意一项的方法，其中所说的生长因子通过渗透泵释放到所说的室中。
5.权利要求1至4中任意一项的方法，其中所说的CNS室是前脑侧室。
6.权利要求1至4中任意一项的方法，其中所说的CNS室是中央管。
7.权利要求1至6中任意一项的方法，进一步包括给所说的室施用Bc1-2。
8.一种用于原位遗传修饰位于哺乳动物CNS室衬里组织的CNS前体细胞的方法，所说的方法包括给所说的CNS室施用遗传物质以感染所说的细胞，所说的遗传物质能编码至少一种神经药剂。
9.权利要求8的方法，其中所说的CNS室是前脑侧室。
10.权利要求8的方法，其中所说的CNS室是中央管。
11.权利要求8至10中任意一项的方法，其中所说的遗传物质包含在逆转录病毒构建体内。
12.权利要求8到11中任意一项的方法，进一步包括给所说的室施用至少一种生长因子以诱导所说的细胞增生和/或分化。
13.权利要求12的方法，其中所说的生长因子是表皮生长因子。
14.权利要求13的方法，进一步包括给所说的室施用成纤维细胞生长因子。
15.权利要求8至14中任意一项的方法，其中所说的神经药剂选自由生长因子，生长因子受体，神经递质，神经递质受体，神经肽，生长因子合成酶和神经递质合成酶组成的组中。
16.前体细胞体外增生的方法，包括下列步骤(a)给活哺乳动物CNS室施用至少一种第一生长因子，所说的CNS室由包含至少一个前体细胞的组织作衬里；(b)从所说的哺乳动物中取出所说的组织；(c)解离所说的神经组织以便从组织中分离所说的前体细胞；(d)在包含至少一种与所说的第一生长因子相同或不同的第二生长因子的培养基中培养所说的前体细胞并增生所说的细胞。
17.权利要求16的方法，其中所说的第一生长因子是表皮生长因子。
18.权利要求17的方法，其中步骤(a)进一步包括给所说的室施用成纤维细胞生长因子。
19.权利要求16到18中任意一项的方法，其中所说的第二生长因子是表皮生长因子。
20.权利要求19的方法，其中步骤(d)所说的培养基进一步包含成纤维细胞生长因子。
21.权利要求16至20中任意一项的方法，其中所说的室是所说的哺乳动物前脑侧室。
22.权利要求16到20中任意一项的方法，其中所说的室是中央管。
23.一种治疗哺乳动物神经紊乱的方法，包括给所说的哺乳动物中枢神经系统室施用包含至少一种第一生长因子的组合物，所说的室由包含至少一种前体细胞的组织作衬里，所说的生长因子诱导所说的前体细胞原位增生和任选地分化以形成包含增生的前体细胞的组织。
24.权利要求23的方法，其中所说的组合物经渗透泵施用到所说的室中。
25.权利要求23或24的方法，其中所说的神经紊乱影响大脑，所说的室位于所说的大脑中。
26.权利要求25的方法，其中所说的组合物包含EGF，bFGF和硫酸乙酰肝素，所说的神经紊乱是Parkison氏疾病。
27.权利要求23的方法，其中所说的神经紊乱影响脊髓，所说的室是中央管。
28.权利要求23的方法，其中所说的第一生长因子是表皮生长因子。
29.权利要求28的方法，进一步包括给所说的室施用成纤维细胞生长因子。
30.权利要求23的方法，进一步包括附加的步骤取出所说的包含增生的前体细胞的组织，解离所说的组织以分离所说的增生的前体细胞，在包含至少一种第二生长因子的培养基中体外培养所说的增生的前体细胞以便进一步增生和任选地分化所说的前体细胞，将所说的增生的和/或分化的前体细胞植入所说的哺乳动物的所说的室中。
31.权利要求30的方法，其中所说的第二生长因子是表皮生长因子。
32.权利要求31的方法，其中所说的培养基进一步包含成纤维细胞生长因子。
33.权利要求23的方法，进一步包括附加的步骤取出所说的包含增生的前体细胞的组织，解离所说的组织以分离所说的增生的前体细胞，在包含至少一种与所说的第一生长因子相同或不同的第二生长因子的培养基中体外培养所说的增生的前体细胞以进一步增生所说的前体细胞，用能编码至少一种神经药剂的遗传物质遗传修饰所说的增生前体细胞，将所说的遗传修饰的前体细胞植入所说的哺乳动物的所说的室中。
34.权利要求33的方法，其中所说的第二生长因子是表皮生长因子。
35.权利要求33的方法，其中所说的培养基进一步包含成纤维细胞生长因子。
36.一种治疗哺乳动物神经紊乱的方法，包括将遗传物质施用到哺乳动物CNS室中，所说的室以包含至少一种前体细胞的组织作衬里，所说的前体细胞以所说的遗传物质进行原位遗传修饰，所说的遗传物质能编码至少一种神经药剂。
37.权利要求36的方法，其中所说的遗传物质包含在逆转录病毒构建体内。
38.权利要求36或37的方法，进一步包括给所说的室施用至少一种生长因子以诱导所说的细胞增生和/或分化。
39.权利要求38的方法，其中所说的生长因子是表皮生长因子。
40.权利要求39的方法，进一步包括给所说的室施用成纤维细胞生长因子。
41.权利要求38到40中任意一项的方法，其中所说的至少一种生长因子经渗透泵施用到所说的室中。
42.权利要求36到41中任意一项的方法，其中所说的神经药剂选自由生长因子，生长因子受体，神经递质，神经递质受体，神经肽，生长因子合成酶和神经递质合成酶组成的组中。
43.权利要求36到42中任意一项的方法，其中所说的神经紊乱影响大脑且所说的室位于所说的大脑内。
44.权利要求36到42中任意一项的方法，其中所说的神经紊乱影响脊髓且所说的室是中央管。
45.一种组合物在制备诱导位于哺乳动物CNS室衬里组织中的CNS前体细胞的原位增生和/或分化的药物中的应用，所说的组合物适于释放给所说的室并包含至少一种诱导所说的CNS前体细胞增生和任选地进行分化的生长因子。
46.根据权利要求45的用途，其中所说的生长因子选自由EGF，双调蛋白，aFGF，bFGF和TGFα组成的组中。
47.根据权利要求45的用途，其中所说的组合物包含EGF与aFGF或EGF与bFGF的组合。
48.根据权利要求45到47中任意一项的用途，其中所说的组合物进一步包含调节前体细胞增生的生长因子。
49.根据权利要求48的应用，其中所说的调节增生的生长因子选自由硫酸乙酰肝素，TGFβ，活化素，BMP-2，CNTF，视黄酸，TNFα，MIP-1α，MIP-1β，MIP-2，NGF，PDGF，白细胞介素和Bc1-2基因产物组成的组中。
50.根据权利要求45的用途，其中所说的组合物包含EGF，bFGF和硫酸乙酰肝素。
51.根据权利要求50的用途，其中所说的药物用于治疗Parkinson氏疾病。
52.根据权利要求45到51中任意一项的用途，其中所说的组合物包含在适于将所说组合物释放给所说的室中的渗透泵中。
53.一种组合物在制备用于对位于哺乳动物CNS室衬里组织的CNS前体细胞进行原位遗传修饰的药物中的应用，所说的组合物适于释放到所说的室中并包含能编码至少一种神经药剂的遗传物质。
54.根据权利要求53的用途，其中所说的遗传物质包含在逆转录病毒构建体中。
55.根据权利要求53或54的用途，其中所说的组合物进一步包含至少一种生长因子，它诱导所说的CNS前体细胞增生和/或分化。
56.根据权利要求55的用途，其中所说的生长因子选自由EGF，双调蛋白，aFGF，bFGF和TGFα组成的组中。
57.根据权利要求53到56中任意一项的用途，其中所说的组合物进一步包含调节前体细胞增生的生长因子。
58.根据权利要求57的用途，其中所说的调节前体细胞增生的生长因子选自由硫酸乙酰肝素，TGFβ，活化素，BMP-2，CNTF，视黄酸，TNFα，MIP-1α，MIP-1β，MIP-2，NGF，PDGF，白细胞介素和Bc1-2基因产物组成的组中。
59.根据权利要求53到59中任意一项的用途，其中所说的神经药剂选自由生长因子，生长因子受体，神经递质，神经递质受体，神经肽，生长因子合成酶和神经递质合成酶组成的组中。
全文摘要
通过应用一种或多种生长因子或相似化合物原位处理/修饰由内源性前体细胞以诱导细胞增生、分化和在CNS内迁移，以便取代丧失或无功能的细胞。该前体细胞也可以进行原位(体内)处理，使其分泌一种可改变其它分化的CNS细胞的功能的化合物。也可用一种或多种生长因子原位处理内源性前体细胞以便增加可从成人CNS分离的和体外增生的干细胞产量。
文档编号C07K14/82GK1141058SQ94194785
公开日1997年1月22日 申请日期1994年11月8日 优先权日1993年11月9日
发明者斯穆尔·韦斯, 布伦特·A·雷诺兹, 德里克·冯德科伊, 辛迪·莫斯黑德, 康斯坦斯·克雷格 申请人:纽罗斯菲里斯控股有限公司