专利名称：Sars冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体、产生该抗体的杂交瘤和含此抗体的检测试剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及以杂交瘤技术生产的单克隆抗体，特别是涉及产生SARS冠状病毒核衣壳(N)蛋白的特异性单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤及此单抗在诊断SARS中的应用。
背景技术：
传染性非典型肺炎，又称严重急性呼吸道综合症(Severe AcuteRespiratory Syndrome，SARS)，是一种新出现的传染病。SARS的致病原已于2003年4月10日，由世界卫生组织确定为一种新的冠状病毒，命名为SARS-CoV。自2002年11月首先在我国广东地区发生后，已在30多个国家和地区传播流行，该病的死亡率为6.4～16.5％。根据现有资料，该病主要通过呼吸道飞沫、体液及污物等方式近距离转播，有家庭聚集性和医院聚集性的特点。其主要的临床特征为起病急，发烧、咳嗽、肺部阴影、外周血白细胞不升高或者降低。尽管在病原体的发现取得了很大进展，但在病原生物学特性，发病机制，早期有效的诊断试剂、特异性治疗等方面的研究尚未获得突破性的进展，尚有一系列的问题需要解决。尤其是SARS早期诊断是困扰临床医生对该病及早发现、隔离及防治等一系列困难，因为同一种病毒感染不同个体可表现出不同的临床特征，而不同的病毒感染又会出现相同的临床特征，所以，仅靠临床症状和流行病学资料很难确定病毒感染真正病原，最终的确诊往往需要实验室的诊断，目前尚未有成熟的客观实验室诊断标准。由于大多数病毒性疾病尚没有特效治疗药物，实验室诊断已成为控制病毒性疾病流行和蔓延的重要手段。当务之急是尽快研究有效的诊断试剂，早诊断、早隔离、切断传播途径，控制疫情蔓延。
对于SARS冠状病毒感染的实验室诊断，目前主要包括以下几种方法以PCR和基因芯片技术为基础的分子诊断；以抗体监测为基础的血清学诊断；以体外病毒培养为基础的病原生物学诊断。
目前，对SARS冠状病毒感染的实验室早期诊断主要是以PCR为基础的病毒核酸测定。现有的实验数据显示在发病14天左右病毒核酸的敏感性大约为70％，由于病毒RNA容易降解，检测结果易受样品收集和处理的影响，而且样品污染可以造成假阳性，因此，需要严格的质量控制和经培训的技术人员熟练操作。另外需要专门的检测仪器并且价格昂贵，鉴于以上这些因素，有很多医院尚不能开展。
以抗体监测为基础的免疫学诊断，根据已知抗原检测抗体的存在是否，进一步推测病原体是否存在。不同类型的抗体产生的时间和水平变化的动态过程不同，在疾病的早期检查不出抗体，IgM要在感染后的10天左右才检测出，而I gG要在感染后的21天左右才可靠地检测出来。目前所采用的方法有两种酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbant assay，ELISA)和免疫荧光法(immunofluroescence assay，IFA)。ELISA所检测的是受试者血清中的IgM和IgG抗体。IFA通常用于检测IgM，但也可用于检测IgG，此法需要把SARS-CoV固定在玻片上，然后经荧光分子标记的第二抗体处理后，再用荧光显微镜观察。阳性结果表示先前有过SARS-CoV感染，血清抗体由阴性转为阳性以及从急性期到恢复期抗体滴度增加4倍以上表示感染是在近期发生的。发病后21天都检测不出抗体表示没有SARS-CoV感染。由于特异性抗体在发病7～10开始出现，因此，抗体血清学检测不能用于SARS的早期诊断。
以体外病毒培养为基础的病原生物学诊断，从患者标本中分离到SARS-CoV是实验室诊断的“金标准”，但由于试验条件等的限制，一般不作为常规的方法。而且技术难度高，操作复杂，所需时间长，对设备要求高，不适于临床医院使用。
以特异性抗体为基础的病原学诊断，是对SARS实验室早期诊断的方法，是用已知的特异性抗体检测样品中病毒抗原。目前尚未有商品化SARS冠状病毒抗原诊断试剂盒。用特异性抗体建立病毒抗原诊断试剂盒的技术难度是需要特异性很高单克隆抗体或多克隆抗体，成熟杂交瘤技术在多种疾病的免疫学诊断中已起到了巨大的作用，由于单克隆抗体具有高度特异的免疫学性质，可以构建高敏感特异的抗原检测试剂，这已被以往多种病毒抗原检测试剂所证实，具有特异性强、重复性好、易操作及成本低等优点。
通过对SARS-CoV基因组结构的分析，SARS-CoV基因编码结构蛋白由钉子糖蛋白(spike glycoprotein，S)、包膜小蛋白(small envelope，E)、膜蛋白(membrane，M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)组成。尽管对这些结构蛋白的功能目前尚不清楚，但从动物冠状病毒感染的细胞中发现，由于病毒包膜上的蛋白很容易发生变异，而核衣壳蛋白却相对稳定，其抗原性比其他结构蛋白强，而且是病毒主要的抗原部分。为此，本发明提供一组产生能与SARS-CoV N蛋白特异性结合的新的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。并发展相关的快速诊断试剂盒，用于早期诊断SARS感染提供一种快速、敏感性高、特异性强的方法，同时为SARS-CoV生物学性状、蛋白组学及发病机制的研究奠定基础。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一组可特异性结合SARS-CoV N蛋白的单克隆抗体；本发明的第二个目的是提供可产生该组单克隆抗体的杂交瘤；本发明的第三个目的是提供该组单克隆抗体所组成检测SARS-CoV抗原的试剂及用该试剂建立的试剂盒。
本发明的第四个目的是提供该组单克隆抗体用于检测SARS-CoV抗原试剂中的应用。
为了达到上述的目的，本发明是通过以下的技术方案实现的。
本发明提供一组单克隆抗体，其可特异性结合SARS-CoV N蛋白，并涉及以下的技术特征
1、免疫印迹方法测定表明该组单克隆抗体特异性识别SARS-CoV N蛋白抗原分子量为46千道尔顿。
2、所述单克隆抗体，是由具有保存号包括杂交瘤1E8A11CCTCC-C200401，杂交瘤8E1A17CCTCC-C200402，杂交瘤10E4A4CCTCC-C200403，杂交瘤14A3A3A19CCTCC-C200404的细胞系分泌产生。
3、所述单克隆抗体属于免疫球蛋白类型IgG1或IgG2b。
4、免疫印迹法表明可特异性与SARS冠状病毒裂解产物中核衣壳蛋白分子量为46千道尔顿发生反应。
5、免疫印迹法表明可特异性与基因重组的核衣壳蛋白分子量为46千道尔顿发生反应。
6、用感染SARS-CoV的Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)作为抗原涂在特定的载体上，用间接免疫荧光方法检测表明该组单克隆抗体可特异性与被SARS-CoV感染的细胞上的SARS-CoV抗原特异性结合。
7、在免疫荧光分析法中用于识别细胞或组织中SARS冠状病毒核壳蛋白核心抗原。
8、在免疫组化分析法中用于识别细胞或组织中SARS冠状病毒核壳蛋白核心抗原。
9、所述的单克隆抗体对人的冠状病毒229E和OC43的核衣壳蛋白不具有反应性；且与其他动物冠状病毒及呼吸道病毒没有交叉反应。因此，本发明涉及的这组单克隆抗体能用于诊断由SARS-CoV感染的疾病，从中可以区分由其他与SARS-CoV相关的人和冠状病毒所造成的疾病。
本发明还提供了产生上述单抗的杂交瘤，是具有保藏号为CCTCC-C200401、CCTCC-C200402、CCTCC-C200403和CCTCC-C200404的杂交瘤细胞株。
本发明提供这一组杂交瘤细胞株3个杂交瘤株为免疫球蛋白G1阳性(1E8A11、8E1A17、10E4A4)，1个杂交瘤株为免疫球蛋白G2b阳性(14A3A3A19)。
上述杂交瘤细胞株的制备方法，其中包括给动物交叉免疫接种基因重组的蛋白和天然的病毒蛋白，从而获得高效的产生特异性针对SARS-CoV N蛋白抗体的免疫脾细胞，用常规细胞融合技术，将该免疫的脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合，成功获得产生该组单克隆抗体特异性针对SARS-CoV N蛋白的杂交瘤。通过杂交瘤细胞株在小鼠体内获得高效价的腹水，经用辛酸—硫酸铵沉淀法纯化获得高活性的特异性针对SARS-CoV N蛋白的单克隆抗体。
具体的说本发明利用细胞融合技术的方式，制备获得一组针对SARS-CoV N蛋白具有特异性的杂交瘤细胞株包括10E4A4、8E1A17、1E8A11及14A3A3A19。其方法为利用公认的细胞融合剂，例如聚乙二醇(PEG)，将骨髓瘤细胞株与产生抗SARS-CoV N蛋白抗体的B淋巴细胞融合，以HAT筛选杂交瘤细胞株，再利用ELISA、间接免疫荧光法及免疫印迹法分析杂交瘤培养上清中抗体的特异性，再挑选对SARS-CoV N蛋白具有特异性的单株杂交瘤细胞株，将这一组单株杂交瘤细胞株注入小鼠的腹腔中以产生腹水。将这组单克隆抗体纯化后标记酶或荧光素在免疫学技术中可用于检测体液或组织中SARS-CoV抗原。本发明所使用的免疫原，是用基因工程方法制备的融合N蛋白抗原和已灭活天然的病毒抗原。
本发明还提供一种在免疫酶试验中的抗体对，其特征在于分别组合上述单克隆抗体进行捕获的抗体和标记的抗体的配对，用1E8A11、8E1A17和10E4A4组合作为捕获的单克隆抗体，用14A3A3A19抗体作为标记的单克隆抗体，本发明通过将每一株单克隆抗体标记后，通过交叉组合试验确定各单克隆抗体的抗原识别位点，以及通过SARS感染者血液中的抗N蛋白抗体阳性的血清对单克隆抗体的阻断抑制分析，并从中筛选获得捕获及检测抗体最佳抗体对用于试剂盒的构建。
此外本发明涉及通过上述一组对SARS-CoV N蛋白具有特异性反应的单克隆抗体可以被标记，即在单克隆抗体上结合一种标记试剂，如酶包括过氧化物酶、碱性磷酸酶等，胶体金及荧光素等，用这些标记试剂可单独或相互结合，或与多克隆抗体结合在免疫学技术(各种酶联免疫吸附试验、免疫荧光、免疫化学发光等等)作为诊断SARS-CoV感染疾病的试剂。
因此本发明还提供一种SARS冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试剂，其特征在于包括上述的可被标记的单克隆抗体。
本发明也涉及一种SARS冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试剂盒，其特征在于包括上述的试剂。
本发明涉及通过上述描述可提供一种定性或定量检测咽试子、漱口液、粪便、痰液及血清、血浆或其他体液、生物液中的SARS-CoV N蛋白的酶免疫方法，该测定方法是将一组针对SARS-CoV N蛋白不同抗原位点的单克隆抗体固相在微孔板上，配合一种酶标记的单克隆抗体或多克隆抗体，通过抗体夹心法原理，测定样品中的SARS-CoV抗原，采用该测定方法测定SARS-CoV N蛋白含量灵敏性为10-50pg/ml，病毒的滴度测定灵敏性小于1.3×102PFU/ml。通过对灵敏性测定，该测定方法灵敏性能检测到样品中微量的病毒抗原。
本发明的单克隆抗体也可单独或相互结合，或与多克隆抗体结合在免疫学技术(各种酶联免疫吸附试验、化学发光免疫分析等等)中用于检测SARS-CoV抗原。
本发明的单克隆抗体在免疫学技术中可用于从天然或重组来源的材料中亲和纯化和分离出SARS-CoV N蛋白抗原，经纯化的N蛋白可用于血清学诊断和蛋白质功能的研究。
本发明所提供的杂交瘤细胞株、抗SARS-CoV N蛋白抗原的单克隆抗体，除了可应用于上述的检测试剂盒外，也可应用在其他相关的免疫学领域中，例如，快速免疫层析法(one-step strip)、免疫印迹法(Western blot)、免疫沉淀、免疫荧光染色、免疫组组织化学染色、原位标定(in situ labeling)等，都是在本发明的范畴之内。
所述本发明的有益效果在于所制备的特异性针对SARS-CoV N蛋白抗原的单克隆抗体，包括该抗体的试剂及以此试剂建立的检测试剂盒，可简易、方便、快速且准确检测SARS-CoV抗原，与目前用于早期诊断病毒核酸检测方法相比具有特异性强、重复性好、易操作、成本低、适合基层单位使用等优点。
单克隆抗体的研制成功对研究SARS-CoV感染的早期诊断、疫源动物的筛查以及SARS-CoV蛋白组学的研究具有非常重要的科学价值，还可以用于SARS发病机制、SARS-CoV生物学活性。
由本发明涉及的杂交瘤已于2004年1月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号分别为杂交瘤1E8A11CCTCC-C200401，杂交瘤8E1A17CCTCC-C200402，杂交瘤10E4A4CCTCC-C200403，杂交瘤14A3A3A19CCTCC-C200404。
图1为免疫印迹结果，显示本发明杂交瘤细胞培养上清特异性结合基因重组SARS-CoV N蛋白。
图2为免疫印迹结果，显示本发明杂交瘤细胞培养上清特异性结合全SARS-CoV病毒中的N蛋白。
图3间接免疫荧光染色结果，显示本发明杂交瘤细胞培养上清特异性结合被SARS-CoV感染Vero E6细胞上的病毒抗原。
图4为显示本发明的单克隆抗体建立的双单克隆抗体夹心ELISA法检测试剂盒检测N蛋白的标准曲线。采用该测定方法测定SARS-CoV N蛋白含量灵敏性为10-50pg/ml。
图5为显示本发明的单克隆抗体建立的双单克隆抗体夹心ELISA法检测试剂盒检测细胞培养中的SARS-CoV的N抗原。病毒的滴度测定灵敏性小于1.3×102PFU/ml。
图6为显示本发明的单克隆抗体检测SARS病人肺组织中SARS-CoV抗原肺单核巨噬细胞病毒包涵体SARS-CoV染色阳性。
图7为显示本发明的单克隆抗体检测SARS病人肺组织中SARS-CoV抗原支气管-浆液腺上皮细胞SARS-CoV染色阳性。
图8为显示本发明的单克隆抗体建立的双单克隆抗体夹心ELISA法检测试剂盒检测SARS病人血清中的SARS-CoV的N抗原。大于临界线为测定阳性的样品。
具体实施例方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步的详细描述，但这些实施例仅是作为举例说明，并非用以限定本发明的范围。
实施例1SARS-CoV核衣壳蛋白(以下简称N蛋白)单克隆抗体的制备方法。
1、免疫抗原的制备本发明用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组SARS-CoV N蛋白和已灭活天然的病毒抗原，基因重组SARS-CoV N蛋是用携带SARS-CoV N蛋白基因的工程菌株为一种大肠杆菌菌株进行制备的。经测序证实菌种携带的SARS冠状病毒核壳基因序列与PUBMED公布SARS冠状病毒HKU-39849株(或其他株)核壳基因序列一致。重组SARS-CoV N蛋白制备按常规方法进行，经用镍-次氮基三醋酸金属亲和层析的方法进行纯化获得N融合蛋白抗原，详细地制备方法可参照使用手册。将N融合蛋白纯化后，以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERC，Cat，No.ED62976)定量。已灭活天然的病毒抗原，是从SARS-CoV感染的病毒宿主细胞(Vero，一种猴胚肾细胞)获得。
2、免疫小鼠取6周龄BALB/c小鼠，采用RIBI佐剂(MPL+TDM Adjuvant System，SigmaM6536)与等体积抗原混匀乳化，第一次于小鼠腹腔注射免疫，21天后于颈背部皮下及双后足垫部免疫，12天后再次于腹腔及双后足垫部注射加强免疫，每次抗原注射量均为每只小鼠50微克的抗原，共免疫10只小鼠。
3、免疫血清效价测定建立间接ELISA法测定免疫血清效价。配制1微克/毫升重组N蛋白的50mM pH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，0.1毫升/孔，4℃过夜。次日，含1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的封闭液0.3毫升/孔4℃过夜，次日再用10mM磷酸盐缓冲液含10％蔗糖处理包被板条，真空干燥2～12小时，用铝膜袋真空包装4℃保存，用于鼠免疫血清效价测定。于第三次免疫后10天眼眶采血，鼠免疫血清用含1％BSA10mM PBS以103～106倍稀释，加入96孔板，0.1毫升/孔37℃30分钟，10mM PBS含0.1％ Tween-20洗涤液洗板五次后，加入1∶2000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(美国ZYMEDLABORATORIES，INC.)，0.1毫升/孔37℃30分钟，同上洗板后，加入含有0.05％(W/V)TMB和0.06％(W/V)双氧pH5.0柠檬酸缓冲液，0.1毫升/孔，室温避光10分钟，加0.1毫升/孔2M H2SO2终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。
4、杂交瘤制备选择血清抗体效价达1×106的小鼠，于融合前3天尾静脉注射10微克抗原。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1按10∶1的比例混合，用50％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma目录号，批号)作用下进行融合。按下述步骤将聚乙二醇溶液加入细胞。在37℃下，在第1分半钟内加入1.5毫升50％聚乙二醇溶液；在第2分钟内，加入1.5毫升无血清RPMI-1640培养基(GIBCO)，在第3分钟，加入3毫升无血清RPMI-1640培养基，在第4分钟里再加入8毫升上述溶液。在第5和第6分钟里再加入10毫升上相同的溶液。此混合液用离心机以每分钟800转的速度离心5分钟，吸出离心管中的上清，再用50到60毫升含15％胎牛血清的培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块96孔培养板上，在二氧化碳培养箱中温度为37℃、二氧化碳含量为5％的二氧化碳培养箱中。一天以后，于每孔加入100微升含次黄嘌呤、氨基喋呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT，Sigma)筛选培养基。。以后每3天用此筛选培养基给培养物换液一次，直到克隆细胞形成。
实施例2筛选分泌SARS-CoV核壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤为检测产生抗体克隆的存在，用实施例1测免疫血清效价的方法即间接ELISA法检测细胞培养上清，简述如下将杂交瘤培养上清加入包被好的孔中，0.1毫升/孔37℃30分钟，洗涤液洗板五次后，加入1∶2000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(美国ZYMED LABORATORIES，INC.)，0.1毫升/孔37℃30分钟，同上洗板后，加入底物TMB，0.1毫升/孔，室温避光10分钟，加0.1毫升/孔2M H2SO2终止反应，测450nm吸收值。选择强阳性克隆杂交瘤细胞进行了正式的克隆化，用有限稀释法连续克隆化2～3次，共获得4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。分别命名为8E1A17、1E8A11、10E4A4及14A3A3A19。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。
实施例3SARS-CoV核壳蛋白单克隆抗体亚类检测用实施例1中描述的间接ELISA法检测在本实施例中获得的4个克隆以确定其产生的抗体亚类。将杂交瘤培养上清加入包被好的孔中，0.1毫升/孔37℃30分钟，洗涤液洗板五次后，加入1∶1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠不同亚类特异性免疫球蛋白这些抗体包括兔抗小鼠IgG1(美国ZYMED LABORATORIES，INC，目录号61-0120)，兔抗小鼠IgG2a(同上，目录号61-0220)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目录号61-0320)，兔抗小鼠IgG3(同上，目录号61-0420)，兔抗小鼠IgM(同上，目录号61-6820)，0.1毫升/孔37℃30分钟，同上洗板后，加入底物TMB，0.1毫升/孔，室温避光10分钟，加0.1毫升/孔2M H2SO2终止反应，测450nm吸收值。检测结果1E8A11、8E1A17、10E4A4个杂交瘤细胞株为免疫球蛋白G1阳性，14A3A3A19 1个杂交瘤为IgG2b阳性。
实施例4抗SARS-CoV核壳蛋白单克隆抗体腹水的制备和纯化及活性测定采用体内诱生法制备本发明中单克隆抗体，即在小鼠体内接种杂交瘤细胞，制备腹水，用25或27号标准针头向每只小鼠腹腔内注射0.5毫升降植烷(2，6，10，10-四甲基十五烷，获自Aldrich化学品公司)。降植烷的处理使瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长。大约1～2周后，106个左右悬浮于无血清RPMI1460培养基的杂交瘤细胞注入用降植烷处理的小鼠腹腔。每个克隆都按上述程序注射入小鼠腹腔。注射杂交瘤细胞大约1～2周后，用16号针头放腹水，可反复收集数次。腹水经离心澄清后冻存。腹水效价测定采用实施例1所描述间接ELISA法测定免疫血清效价的方法进行，腹水作倍比稀释。结果本发明的4株单克隆抗体的腹水效价见表1。
表1抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的免疫学特性
腹水抗体的纯化采用辛酸-硫酸铵沉淀法，腹水用60mmol/毫升、pH5.0醋酸缓冲液稀释2倍，用0.1N盐酸调pH值至4.8，液体由清亮变混浊，室温下边搅拌边逐滴缓慢30分钟内加入辛酸，为每毫升稀释前腹水加33微升辛酸，出现大量沉淀，4℃静置2小时，10000g，4℃离心30分钟，取上清，加入1/10体积的pH7.4 10mmol/毫升磷酸盐缓冲液，并用0.1N氢氧化钠调pH值至7.4，冰浴搅拌下缓慢加入0.277克/毫升硫酸铵，即为45％饱和度，或者直接加入PH值7.4饱和硫酸铵达终浓度45％，4℃静置过夜，10000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀溶于适量10mmol/毫升磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析过夜，换液三次。以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERC，Cat，No.ED62976)定量。测定蛋白浓度后-80℃保存。单克隆抗体活性测定采用实施例1所描述间接ELISA法测定免疫血清效价的方法进行，纯化的抗体作倍比稀释至0.1微微克/ml，结果本发明的4株单克隆抗体的活性见表1。
实施例5单克隆抗体亲和常数测定抗体亲和常数测定选用间接ELISA方法测定，该法参照Beatey等人在JImmunol Methods，100173-179(1983)中有全面的描述。按照这一方法，用50mM pH9.6碳酸盐缓冲液将抗原分别以1微克/毫升和10微壳/毫升包被聚苯乙烯微96孔板，0.1毫升/孔，4℃过夜。次日，含1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的封闭液0.3毫升/孔4℃过夜，加入不同稀释浓度的单克隆抗体，0.1毫升/孔37℃30分钟，10mM PBS含0.1％ Tween-20洗涤液洗板五次后，加入1∶2000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(美国ZYMEDLABORATORIES，INC.)，0.1毫升/孔37℃30分钟，同上洗板后，TMB显色测OD值。以抗体浓度的对数为横座标，以OD值为纵座标，每种单克隆抗体得出2条反应曲线，以每条曲线上部平坦段的OD值作为100％，在曲线上查出50％OD值时相对应的抗体浓度，按Beatty推导公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)计算亲和常数。结果本发明的4株单克隆抗体亲和常数见表1。
实施例6辣根过氧化物酶-单克隆抗体结合物制备辣根过氧化物酶标记抗体制备采用改良过碘酸钠法，将5mg辣根过氧化物酶搅拌溶解于1毫升蒸馏水中，加入0.2毫升新配0.1M过碘酸钠30分钟，置1mM pH4.4醋酸钠缓冲液中，4℃透析过夜，次日加入20μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液后加预先在0.01M碳酸盐缓冲液中pH 9.5透析平衡的10mg抗体，在室温避光轻轻搅拌2～3小时，加入0.1毫升新配4mg/毫升硼氢化钠，4℃避光过夜，冰浴上避光搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵(硫酸铵用前先用氨水调pH至7.0-7.2)，置4℃6小时。10000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀溶于适量10mM磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析过夜，换液三次。收集结合物加入2％BSA PBS 50％甘油保护剂，分装置-70℃保存并进行酶标抗体工作浓度测定。酶标抗体效价测定采用实施例1所描述间接ELISA法测定免疫血清效价的方法进行，酶标抗体作倍比稀释。结果本发明的4株单克隆抗体的酶标抗体的工作浓度见表1。
实施例7鉴定SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性1、间接ELISA法进行单克隆抗体特异性分析用纯化SARS-CoV全病毒裂解液抗原包被微孔板，按实施例1建立测定免疫血清效价的间接ELISA法的步骤进行，在包被的微孔板中加入本专利发明的杂交瘤细胞培养上清液，37℃再孵育1小时，加入1∶2000稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(美国ZYMED LABORATORIES，INC.)，0.1毫升/孔37℃30分钟，加TMB显色液室温避光10分钟，加0.2M H2SO2终止反应，测450nm吸收值。表2结果显示本专利发明的SARS-CoV单克隆抗体与SARS-CoV抗原产生很强的特异性的免疫反应。
表2SARS-CoV单克隆抗体与SARS冠状病毒全病毒裂解液抗原反应间接ELISA结果
2、用间接免疫荧光法进行单克隆抗体特异性分析用SARS-CoV感染Vero-E6细胞，当有2/3细胞出现病变时，收集细胞，用预冷的1×PBS洗细胞二遍，然后将细胞滴于无菌干燥的玻片上，干燥后，制备成涂片，充分干燥，用冷丙酮固定30分钟，用PBS和去离子水各洗3次，吹干，将杂交瘤细胞培养上清按不同的稀释度分别用10μl滴在不同的孔中，同时设阴性和阳性对照血清，置37℃水浴箱中，作用45分钟后，取出将抗原片放于染色缸中用0.01mM pH7.2 PBS和蒸馏水各洗3次，吹干，加入荧光标记羊抗小鼠IgG抗体，置37℃水浴箱中，45分钟后作用，取出将抗原片放于染色缸中用0.01mmol/LpH7.2PBS和蒸馏水各洗3次，吹干，荧光显微镜下观察荧光图像，以荧光的强度和染色形态进行结果判定，检测抗体强度以(+～++++)计为阳性，抗体强度(±)和(-)计为阴性。如附图中图3和表3结果显色SARS-CoV单克隆抗体与固定在玻片上SARS-CoV抗原特异性结合。
表3、单克隆抗体的免疫荧光检测结果
3、免疫印迹分析法进行单克隆抗体特异性分析将灭活SARS-CoV培养液或重组的N蛋白，用2×SDS加样缓冲液稀释一倍，将样品加到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离蛋白质，通过电洗脱使在凝胶上分离出来的蛋白质转印到硝酸纤维膜上，转印膜用1×PBS含7％脱脂奶和3％BSA，4℃封闭6小时，将转印膜剪成数根小条，分别加入杂交瘤细胞培养上清中，4℃反应过夜，用含有0.5％Tween 20的1×PBS洗涤膜后，加入1∶500倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，置室温反应1小时，用同样的洗涤液洗涤膜后，AEC显色后，用去离子水终止显色。
免疫印迹结果如附图的图1和图2显示本发明的4株单克隆抗体与N蛋白特异性结合，结合蛋白相对分子质量为46千道尔顿。SARS-CoV液在分子量为46千道尔顿可见一条单一的蛋白质免疫结合带，特异性蛋白质结合带与预测分子量为46千道尔顿相一致。说明获得的单克隆抗体能够特异性识别SARS-CoV抗原。
实施例8单克隆抗体识别自然抗原位点的分析采用固相抗原的间接竞争抑制法，主要步骤如下(1)1微克/毫升重组N蛋白0.1毫升的50mM pH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，4℃过夜。次日，含1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的封闭液0.3毫升/孔4℃过夜后，(2)A50微升杂交瘤细胞的培养上清和50微升SARS-CoV N区阳性病人的血清，37℃共同孵育1小时，此步骤称为相互竞争抑制，B100微升SARS-CoV N区阳性病人的血清37℃孵育1小时后，将血清吸出，然后加100微升杂交瘤细胞的培养上清，37℃再孵育1小时，此步骤称为先后竞争抑制。(3)加入1∶2000稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(美国ZYMED LABORATORIES，INC.)，0.1毫升/孔37℃30分钟，加TMB显色液室温避光10分钟，加0.2M H2S02终止反应，测450nm吸收值，以正常人血清作为抑制阴性对照，以SARS-CoV N区阳性病人的血清OD测定值/正常人血清OD测定值≤05判断为抑制阳性。表4结果显示12份SARS-CoV抗体阳性病人的血清相互竞争抑制试验时对本发明4株单抗没有产生抑制作用，而在先后竞争抑制试验时对这4株细胞产生明显的抑制作用，由此显示自然感染后产生的抗体可抑制单抗与重组抗原的反应，说明这组单抗所识别的位点存在于自然抗原上，同时也提示本发明的4株单抗由于亲和力高，能够与病人的血清相互竞争固相抗原。
表4SARS阳性血清分别对4株单抗的抑制作用
实施例9单克隆抗体识别位点分析5微克/毫升重组N蛋白0.1毫升的50mM pH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，4℃过夜。次日，含1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的封闭液0.3毫升/孔4℃过夜后，先加单抗10毫克/毫升50微升及后加系列稀释HRP标记单抗1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶2000 50微升，37℃，封闭1小时；PBST洗涤五次后加底物100微升/孔，10～20分钟，OD450测定吸收值。以单抗对同一HRP标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率。即抑制率为(1-测定值OD/阴性对照值OD)×100。抑制率＞75％为相关，＞50％为不完全相关，＜50％为不相关，＜25％为完全不相关。表5结果显示4株单抗识别4个不完全相同的抗原位点。
表5抗SARS冠状病毒核壳蛋白单克隆抗体识别位点测定
实施例10双抗体夹心ELISA法单克隆抗体最佳配对的筛选和ELISA参数的优化从实施例4的腹水纯化的单克隆抗体用于进行一组矩阵格式实验以选出最适合于下面实施例11所述的夹心ELISA法中用作捕获和标记的单克隆抗体对。简单地说，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化的4株杂交瘤细胞(编号为1E8A11、8E1A17、10E4A4、14A3A3A19)衍生而来的腹水包被96孔板，以实施例获得的重组N蛋白作为抗原筛选抗体对。用实施例6中所述的4株辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，采用矩阵格式，也就是上述4株单克隆抗体将每株进行包被作为捕获或混合包被作为捕获，分别与每一株酶标记单克隆抗体进行配对，以快速筛选夹心ELISA中捕获和标记的单克隆抗体对。初步实验显示单克隆抗体1E8A11、8E1A17、10A4A1和10E4A4分别作为捕获抗体，与酶标记14A3A3A19单克隆抗体配对时，可产生较强的信号。而在此基础上，分别组合上述4株单克隆抗体进行捕获的抗体和标记的抗体的配对，以信号强度和特异性而言，用1E8A11、8E1A17和10E4A4组合作为捕获的单克隆抗体，用14A3A3A19抗体作为标记的单克隆抗体，产生最强的信号。
实施例11用抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体检测SARS-CoV抗原的双抗体夹心ELISA法试剂盒建立本发明的检测SARS-CoV抗原试剂盒建立的操作流程描述如下1、将本发明单克隆抗体1E8A11、8E1A17和10E4A4用50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至10微克/毫升，用0.1毫升/孔包被聚苯乙烯96微孔板，于4℃过夜。以0.05％Tween 20/10mMPBS冲洗1次，然后拍干。每孔加入0.3毫升的1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的封闭液，于4℃过夜以封闭非特异性结合位点。用10mM磷酸盐缓冲液含10％蔗糖处理包被板条，真空干燥2～12小时，用铝膜袋真空包装4℃保存备用。
2、将各种待测的样品用样品稀释液稀释后，各加入100微升于聚苯乙烯96孔微量测试板中，每份样品设复孔，37℃温育1小时，用10mM PBS含0.1％Tween-20洗涤液洗板五次后，用酶稀释液稀释对辣根过氧化物酶标记14A3A3A19单克隆抗体作1∶1000倍稀释，每孔加入100微升，37℃1小时，同上洗板后，加入含有0.05％(W/V)TMB和0.06％(W/V)双氧水pH5.0柠檬酸缓冲液，每孔加入100微升，37℃避光10～15分钟，每孔加入100微升2MH2SO2终止反应。
3、结果判定以空白孔调零，于450nm波长测定A值。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0.10，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性。反之为阴性。
本发明双抗体夹心ELISA法检测SARS-CoV抗原试剂盒结果的分析描述如下1、抗体夹心ELISA法试剂盒对不同来源的SARS-CoV株和不同病毒的特异性测定分析取从广州、北京和香港地区分离的SARS-CoV株、动物冠状病毒以及其他病毒的培养物，用上述的双抗体夹心ELISA法分别进行检测。表6结果显示，对不同地区的分离SARS-CoV株均有特异性反应，对人冠状病毒(OC43和229E)、其他动物冠状病毒(禽冠状病毒IBV和犬冠状病毒CCV)、呼吸道病毒(流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒)以及肺炎衣原体、肺炎支原体均无交叉反应。说明用本发明的单克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA法对SARS-CoV具有高度的特异性。
表6双抗体夹心ELISA法试剂盒检测检测细胞培养的SARS-CoV抗原
2、抗体夹心ELISA法试剂盒检测的灵敏度检测分析以纯化的SARS-CoV N重组蛋白作为标准检测品(0、50、100、200、400、800及1600pg/毫升)，以非相关蛋白作为阴性对照，用上述的双抗体夹心ELISA法分别进行检测，绘制标准曲线，如附图中图4结果所示。此试剂盒灵敏度可达10-50pg/毫升。通过检测样品的OD值，从标准曲线中计算样品的含量。
实施例12SARS-CoV单克隆抗体的临床应用研究检测SARS病人肺组织中SARS-CoV抗原用SARS-CoV单克隆抗体，通过免疫组化染色法检测SARS病人肺组织中SARS-CoV抗原的表达。按常规方法对肺组织石蜡包埋后组织切片进行免疫组化染色法，简述如下切片置于58℃烤箱烤1小时，浸入二甲苯中脱蜡，常规水化后，3％H2O2室温作用15分钟，以封闭内源性过氧化物酶活性。然后用冷1×PBS洗片，3次，每次5分钟。加SARS-CoV单克隆抗体腹水1∶1000于湿盒中4℃过夜。用冷PBS洗片3次。辣根过氧化物酶标记的标记羊抗鼠IgG，37℃孵育1小时，充分洗片后，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化后，梯度脱水，透明，中性树胶封固。显微镜下镜检。附图中图6、7所示，结果表明本发明的单抗检测到SARS病人肺组织中肺泡上皮细胞中的SARS-CoV抗原。说明SARS-CoV单克隆抗体具有很高的特异性和敏感性。
双抗体夹心ELISA法试剂盒检测检测细胞培养的SARS-CoV抗原通过本发明提供高特异性的抗SARS-CoV单克隆抗体建立双抗体夹心酶联免疫法检测SARS-CoV抗原，以实施例11描述的抗体1E8A11、8E1A17和10E4A4作为俘获抗体，在聚苯乙烯微96孔板上将纯化的单抗制成固并用牛血清白蛋白(BSA，Sigma)封闭多余的位点，以灭活的SARS-CoV感染的Vero细胞的培养上清作为SARS-CoV抗原来源，37℃孵育洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记14A3A3A19单抗，再次37℃孵育洗涤后，加TMB酶底物液避光显色，加H2SO2终止反应，测450nm吸收值。使用这一方法，对来自不同地区的3株SARS-CoV感染的细胞培养上清均呈阳性反应。而与没有感染SARS-CoV的细胞培养物无交叉反应。附图中的图5给出分析结果。
双抗体夹心ELISA法试剂盒检测检测病人血清中的SARS-CoV抗原。
实施例11建立的方法检测SARS病人血清中的SARS-CoV抗原，对广东省CDC提供165份SARS病人急性期和恢复期血清样品进行检测，检出SARS冠状病毒抗原阳性率为40％，对15例实验室诊断(恢复期IgG 4倍增高)的急性期10天内的血中SARS冠状病毒抗原检出阳性率为93.3％(14/15)。对北京CDC提供20份SARS病人急性期5天内的血中SARS冠状病毒抗原检出阳性率为90％(18/20)。对2000份对照样品检测的特异性为99％。检测结果证明本发明建立的试剂盒在发病的早期第一天血清中，测到SARS-CoV抗原，而且通过本发明建立的检测方法发现在SARS发病6-10天血清中的抗原达到高峰，发病的10天后开始下降，如附图中的图8所示。该发现证明本发明的一组单克隆抗体以及用该组单克隆抗体建立的检测方法不仅可用于SARS的早期诊断而且用于SARS的发病机制研究具有非常重要的科学价值。
上面所述的以1E8A11、8E1A17和10E4A4混合包被固相表面，以辣根过氧化物酶标记14A3A3A19抗体作为液相的检测抗体所组成的双抗体夹心酶联免疫法检测SARS-CoV抗原，可用于检测检测人或动物的血清或血浆样品痰液、漱口水、鼻拭子、咽拭子、尿液以及粪便中的SARS-CoV抗原，用于SARS-CoV感染的早期诊断，达到早期发现、早期隔离。避免转播的目的。
用本发明的单克隆抗体标记荧光后采用直接免疫荧光方法检测被SARS-CoV感染的肺脱落细胞中和活组织中的病毒抗原，或用实施例7所描述的间接免疫荧光法即用本发明的单克隆抗体与细胞或组织中的的SARS-CoV抗原结合后，再用荧光标记羊抗小鼠IgG抗体与结合在细胞或组织中的单克隆抗体结合，同样也可用于SARS-CoV感染的诊断的研究。
权利要求
1.一种对SARS冠状病毒核衣壳蛋白具有特异反应性的单克隆抗体。
2.权力要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述SARS冠状病毒核壳蛋白抗原分子量为46千道尔顿。
3.权利要求1所述单克隆抗体，其特征是由具有保存号包括杂交瘤1E8A11CCTCC-C200401，杂交瘤8E1A17CCTCC-C200402，杂交瘤10E4A4CCTCC-C200403，杂交瘤14A3A3A19CCTCC-C200404的细胞系分泌产生。
4.权力要求1所述的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体属于免疫球蛋白类型IgG1或IgG2b。
5.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于免疫印迹法表明可特异性与SARS冠状病毒裂解产物中核衣壳蛋白分子量为46千道尔顿发生反应。
6.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于免疫印迹法表明可特异性与基因重组的核衣壳蛋白分子量为46千道尔顿发生反应。
7.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于可在免疫荧光分析法中特异性识别被感染SARS冠状病毒的非洲绿猴肾细胞中核衣壳蛋白。
8.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于可在免疫荧光分析法中特异性识别SARS病人的细胞或组织中SARS冠状病毒核衣壳蛋白抗原。
9.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于可在免疫组化分析法中用于识别SARS病人的细胞或组织中SARS冠状病毒核衣壳蛋白抗原。
10.权力要求1所述的单克隆抗体，其特征在于对人的冠状病毒229E和OC43的核衣壳蛋白不具有反应性；且与其他动物冠状病毒及呼吸道病毒没有交叉反应。
11.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于可进行捕获的抗体和标记的抗体的配对，用1E8A11、8E1A17和10E4A4组合作为捕获的单克隆抗体，用14A3A3A19抗体作为标记的单克隆抗体，形成一种在免疫酶试验中的抗体对。
12.具有保藏号为CCTCC-C200401、CCTCC-C200402、CCTCC-C200403和CCTCC-C200404的杂交瘤细胞株。
13.一种SARS冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试剂，其特征在于包括权利要求1～11任何一项所述的单克隆抗体。
14.一种SARS冠状病毒核衣壳蛋白抗原检测试剂盒，其特征在于包括权利要求13所述的试剂。
15.一种权利要求1～11所述的单克隆抗体，其特征在于能单独或结合或与多克隆抗体结合在诊断SARS冠状病毒感染的试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了SARS冠状病毒(SARS－CoV)核衣壳(N)蛋白的特异性单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤，含此单克隆抗体的试剂以及以此建立的试剂盒；该单克隆抗体是由保藏号为杂交瘤1E8A11CCTCC－C200401，杂交瘤8E1A17CCTCC－C200402，杂交瘤10E4A4CCTCC－C200403，杂交瘤14A3A3A19CCTCC－C200404细胞系分泌产生。利用此单克隆抗体建立的试剂盒可早期诊断SARS冠状病毒感染，并具有简易、方便、快速、敏感性高、特异性强等特点。
文档编号C12N5/12GK1557838SQ200410015309
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月10日 优先权日2004年2月10日
发明者车小燕, 丘立文, 温坤, 郝卫, 王亚娣, 潘玉先, 廖志勇 申请人:第一军医大学珠江医院