添加醇类促进二萜类化合物Libertellenone H产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物发酵技术领域；更具体地，本发明涉及一种提高二萜类化合物 Libertellenone H产量的方法，通过在发酵培养基中添加醇类来大大提高二猫类化合物 Libertellenone H 的产量。
【背景技术】
[0002] 北极弯孢聚壳菌（Eutypella sp.)属于丝状真菌，其是分离自北极高炜度 (78° 55'N)仙女木根基土壤的一种丝状真菌，该属真菌在全球分布较为广泛，且能够产生 许多结构新颖、功能独特的次级代谢物，比如桉烷型倍半萜、海松烷型二萜、三萜、细胞松弛 素类、聚酮类和环二肽类化合物。从该菌发酵产物中分离鉴定的两种新型异海松烷型二萜 类化合物Libertellenone G和Libertellenone H对人肺癌细胞株H460、人胶质瘤细胞株 U251、人胃癌细胞株SG7901、人胰腺癌细胞株SW1990、人子宫颈癌细胞株Hela和人肝癌细 胞株Huh-7这7种肿瘤细胞株均有一定抑制活性。其中Libertellenone H对Mcf-7乳腺 癌的抑制作用最强，IC5tl达到了 3.31 ymol/L，和阳性对照紫杉醇的IC5tl相当，具有潜在的 开发应用前景。
[0003] 然而，Libertellenone H在Eutypella sp.的原始产量极低，甚至低于HPLC检出 限，严重限制了对其进行进一步的体内外活性评价及药代药动力学等药理学研宄。
[0004] 因此，本领域迫切需要找到提高Libertellenone H发酵产量的方法，从而为抗肿 瘤研宄提供新的药物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种通过添加醇类促进二猫类化合物Libertellenone H 产量的方法。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种提高Libertellenones H的产量的方法，所述方法 包括：培养北极丝状真菌Eutypella sp·，从而生产Libertellenones H ;并且，在北极丝状 真菌Eutypella sp.的培养基中添加醇类，所述的醇类选自甲醇或乙醇。
[0007] 在一个优选例中，所述的醇类为AR级甲醇或乙醇。
[0008] 在另一优选例中，添加所述的醇类的初始时间是发酵起始起算的第48~96小时； 较佳地，添加所述的醇类的初始时间是发酵起始起算的第60~84小时。
[0009] 在另一优选例中，添加醇类后，醇类在培养基中的最终浓度为1~10% (v/v);更 佳地为 2 ~6% (v/v)，如 4% (v/v)，5% (v/v)。
[0010] 在另一优选例中，所述的醇类的添加方式为：每次添加按照体积〇. 25~2. 5% (v/ v)的醇类，从第一次添加起每隔18~30小时添加1次，共添加2~4次，使醇类最终浓度 为 1 ~10 % (v/v);更佳地为 2 ~6 % (v/v)，如 4 % (v/v)，5 % (v/v)。
[0011] 在另一优选例中，所述的醇类的添加方式为：每次添加按照体积0. 5~I. 5% (v/ V)的醇类，从第一次添加起每隔20~28小时添加1次，共添加2~4次，使醇类的最终浓 度为2~6 % (v/v)，更佳地为3~5 % (v/v)。
[0012] 在另一优选例中，所述的醇类的添加方式为：每次添加按照体积1~2% (如 1. 333% ) (v/v)的醇类，从第一次添加起每隔24小时添加1次，共添加3次，使醇类的最终 浓度为4% (v/v)。
[0013] 在另一优选例中，所述的培养基包含：
[0014]
[0015]
[0016] 在另一优选例中，所述的培养基的pH调至
5. 8 ±0.2 ;较佳地pH调至为5.8 ±0. 1。
[0017] 在另一优选例中，所述的北极丝状真菌是北极丝状真菌Eutypella sp. D-I。
[0018] 在另一优选例中，培养北极丝状真菌Eutypella sp.的温度是28±2°C。
[0019] 在另一优选例中，所述的方法还包括：从发酵液中分离纯化出Libertellenone Η。
[0020] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0021] 图1、发酵培养基中添加甲醇对弯孢聚壳菌D-I菌体生长及Libertellenone H合 成的影响。
[0022] 图2、发酵培养基中添加乙醇对弯孢聚壳菌D-I菌体生长及Libertellenone H合 成的影响。
[0023] 图3、发酵培养基中终浓度4%的乙醇不同添加时间对弯孢聚壳菌D-I菌体生长及 Libertellenone H 合成的影响。
【具体实施方式】
[0024] 本发明人致力于提高北极丝状真菌Eutypella sp.生产二猫类化合物 Libertellenone H的产量的研宄，通过深入而广泛的研宄，意外地发现：在发酵过程中通过 加入醇类，特别是甲醇或乙醇，可以极大地促进Libertellenone H的产量。并且，本发明还 优化了醇类的添加时间和添加量。在此基础上完成了本发明。
[0025] 除非另外说明，本发明中所提到的发酵培养基组成中各组分的量（g/L)是相对于 培养基的体积而言，添加的甲醇或乙醇的浓度百分比（v/v)及甲醇或乙醇的最终浓度百分 比（v/v)均为相对于培养基的体积而言。
[0026] 除非另外说明，本发明所述的接种量的百分比是相对于培养基的体积百分比。
[0027] 本发明人首次提出了以醇类提高北极丝状真菌Eutypella sp.生产 Libertellenone H的产量的策略。所述的醇类包括：甲醇或乙醇；较佳地，为AR级的甲醇 或乙醇。
[0028] 适用于本发明方法的生产Libertellenone H的菌株没有特别限制，可以是野生型 北极丝状真菌Eutypella sp.，也可以是基于该菌株、通过常规方法改造或诱变而获得的工 程菌，也可以是转化有外源基因的重组的菌株，也可以是其自然突变体。
[0029] 利用上述的菌株，可在常规的、适合表达Libertellenone H的条件下培养，从而生 产Libertellenone H，并且在培养过程中添加醇类。
[0030] 本发明人在研宄中发现，浓度不当的醇类的添加对于菌株的生长有极大的影响， 使得菌体量减少。因此，本发明人还优化了醇类的添加量，以醇类在培养基中的最终浓度计 (如多次添加，以添加后的总量计），添加量为1~10% (v/v);更佳地为2~6% (v/v);进 一步更佳地为3~5% (v/v)。
[0031] 本发明人在研宄中发现，在不同的发酵时间点添加醇类，菌株生长的状态也将受 到影响。因此，本发明人还优化了醇类的添加时间，较佳的添加方式为：每次添加按照体积 0.25~2. 5% (v/v)的醇类，从第一次添加起每隔18~30小时添加1次，共添加2~4次， 使醇类最终浓度为1~10% (v/v);更佳的添加方式为：每次添加按照体积〇. 5~1. 5% (v/v)的醇类，从第一次添加起每隔20~28小时添加1次，共添加2~4次，使醇类的最终 浓度为2~6 % (v/v)，更佳地为3~5 % (v/v)。
[0032] 应理解，在本发明的提示下，本领域人员也可适当地对于添加次数以及每次添加 量进行适当的调整，例如调整为进行更多次且每次更少量的添加方式，这种改变是本领域 技术人员已于联想到的，且易于操作，也应包含在本发明的保护范围内。
[0033] 多种已知的可被应用于北极丝状真菌Eutypella sp.的培养基均应被包含在本发 明中，并且在其中添加醇类。还可在培养基中添加有益于菌株生长的微量元素。作为本发 明的优选方式，所述的培养基包含：
[0034]
[0037] 在本发明中，对于发酵生产的Libertellenone H，可以用常规方法进行纯化，随后 制成药剂。一种可选的方法是对发酵样品用常规方法酸化后进行离心、过滤等方式去除菌 体，获得含Libertellenone H的发酵清液。然后，对发酵清液通过盐析、超滤等方法进行初 步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行离子层析纯化。应理解，其它各种适用于化合物纯 化的方法均可被应用于进行Libertellenone H的纯化。
[0038] 在本发明的具体实施例中，利用北极丝状真菌Eutypella sp. D-I (菌种保藏编号： CCTCC M2013144)为生产菌株，当发酵至72h时，在发酵培养基中添加甲醇或乙醇来促进 Libertellenone H产量的提高。在发酵培养基中添加甲醇最高产量可达到0.473mg/l，比 不加甲醇的对照组提高了 72. 3% ;在发酵培养基中添加乙醇最高产量可达到4. 36mg/l，比 不加乙醇的对照组提高了 14. 9倍，实现了极其优异的技术效果。
[0039] 本发明的有益效果具体如下：
[0040] 本发明提供了一种通过在发酵培养基中添加醇类提高Libertellenone H产量的 方法，克服了 Libertellenone H发酵产量低的缺陷。
[0041] 本发明对于北极丝状真菌Eutypella sp.发酵研宄及Libertellenone H的代谢 调控研宄具有重要意义。
[0042] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0043] I.材料和方法
[0044] 1、实验菌株及保藏方法
[0045] 弯孢聚壳菌D-I (Eutypella sp. D-1，菌种保藏编号：CCTCC M2013144)由中国人民 解放军第二军医大学提供。
[0046] 菌株接种于种子培养液中，培养3. 5天后获得新鲜种子液，50%甘油与新鲜种子 液按2:3比例混合于保种管，置于_80°C冷冻保藏，并取新鲜种子液于安瓿管中经冷冻真空 干燥保存。
[0047] 2、培养基
[0048] 固体平板及种子液体培养基：
[0049]
[0050]
[0051] 固体平板培养基则是在此基础上添加2%的琼脂粉，于1