利用裂壶藻发酵生产含dha油脂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明微生物发酵产油脂领域，特别涉及利用裂壶藻发酵生产DHA的方法。
【背景技术】
[0002] 二十二碳六稀酸（docosahexaenoicacid，简称DHA)化学名称为二十二碳_4, 7， 10,13,16,19-六烯酸，属n-3系列长链多不饱和脂肪酸，是人体中的一种功能性脂肪酸。 DHA大量存在于人脑细胞中，是大脑神经视觉细胞中重要的脂肪酸成分，占大脑脂肪酸的 25-33%。在胎儿及婴幼儿大脑和视觉系统发育过程中占有十分重要的地位，对大脑活动、 脂肪代谢、胎儿生长、婴幼儿智力发育及免疫功能都有极大的影响。同时，DHA还可以加速骨 骼增长，防止骨质疏松，减少妇女产后神经衰弱及产后抑郁症的发生。提高机体免疫力，促 进成年人外周血液单核细胞的增殖，阻止肿瘤细胞的异常增生。DHA在治疗心肌梗塞、动脉 硬化、高血压等心血管疾病的临床试验和动物饲养研宄中已先后被证明具有降低血脂总胆 固醇、血液黏度、血小板凝聚力及增加 HDL的生理功能，从而降低心血管疾病发生的概率。
[0003] 国内外市场对DHA需求量巨大，其在孕妇、哺乳期妇女、婴儿和儿童食品和保健品 中，可供开发多类产品。如，DHA可用做高纯度医药制品；可添加于奶粉、米粉、饮品（如牛 奶、酸奶、果汁）、面包、饼干、面条、冰淇淋、糖果等食品与保健品中，从而达到增强大众身体 健康和智力发展的目的。
[0004] 1994年，联合国粮农组织和世界卫生组织（FA0/WH0)正式推荐在婴幼儿配方奶粉 中添加 DHA ;2000年，美国著名的婴儿营养专家Birch教授证实ARA+DHA婴幼儿配方奶粉对 婴幼儿智力发育具有显著促进作用；2001年，FDA在GRAS Notice No. 000080批准了 DHA在 婴幼儿配方奶粉中应用。微藻油是唯一得到美国食品与药物管理局（FDA)认可的儿童DHA 补充剂来源；2010年，中国卫生部《食品安全国家标准婴幼儿配方食品》中批准在婴幼儿奶 粉中添加 DHA，并要求添加 DHA同时必须添加相同量的ARA ;2011年，欧洲食品安全局宣布 孕妇DHA日摄入大于200mg，婴儿DHA日摄入大于100mg，能促进婴幼儿视力发育。
[0005] 长期以来，DHA主要来源于深海鱼油，但深海鱼油存在诸多不足：①鱼油资源有 限，产量不稳定，远远不能满足市场需求。②鱼油质量随捕捞季节和地域变化，品质波动大。 ③鱼油中的DHA含量不高，仅占7-14%，且很难与大量的EPA和其它结构类似的高度不饱 和脂肪酸分离。④纯化工艺复杂，生产成本高，产品得率低。在实际生产过程中，ω-3多不 饱和脂肪酸被氢化饱和，降低了其在鱼油中含量，造成原料浪费，也损害了 DHA和EPA的品 质。⑤鱼油易于氧化，难以应用于食品添加剂行业。由于鱼油含有很重且难闻的鱼腥味，即 使经过复杂的提纯工艺也难以去除，限制了这类DHA的应用范围。⑥基于DHA等ω-3多不 饱和脂肪酸的市场需求不断增加，将会导致过量捕捞行为的出现，不利于环境资源的保护。 因此，寻找DHA商业化生产的替代来源备受关注。
[0006] 20世纪提出的"单细胞油脂"、"微藻油"是以微生物作为来源发酵得到的含多不饱 和脂肪酸的油脂，已成为当前人们关注的热点。通过微生物发酵法制备DHA，与传统鱼油来 源相比，具有微生物生长快，易于大规模培养；多不饱和脂肪酸含量高，大于35%，甚至大 于40% ;不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含量低，易于分离纯化；氧化稳定性较好 等优点。因此，微生物发酵生产DHA可替代鱼油来源的DHA，具有广泛的应用前景。能够代 谢积累DHA的微生物有细菌、微藻、海洋真菌三大类。其中细菌的DHA生产能力差，条件苛 亥IJ，不适宜实际生产应用。大约有500种海洋微藻具有生产DHA的能力，已经证实的有88 种，主要是较低级真菌中的藻状菌（硅藻类、甲藻类、隐藻类等）。
[0007] 目前，发现产DHA的海洋真菌主要是一些较低级的藻状菌类，其中破囊壶菌 (Traustochytrium)和裂壶藻（Schizochytrium)是研宄最多，最有潜力成为DHA生产菌 株的两种海洋真菌。裂壶藻是最早被用于工业化生产的海洋真菌。如中国专利申请CN 200910033869. 5公开的技术方案中，在7吨发酵罐中，120小时生物量达到70. 6g/L，总油脂 31. 5g/L，DHA占总油脂含量达到41. 13%。虽然DHA含量较高，但是发酵周期太长，且总油 脂含量及总DHA产量偏少，增加了染菌几率和单位DHA发酵成本，具有提升的空间。
[0008] 影响裂壶藻发酵生产DHA的因素主要有：①高产DHA的优质菌种。②配套的DHA发 酵生产工艺。发明人在已获得授权的专利《一种海洋真菌裂壶藻（Schizochytrium)LX0809 及其工业应用》中报道了筛选得到了一株优良的生产菌株裂壶藻LX0809,其发酵96h细胞 干重达到72. 5g/L，DHA占总脂肪酸比例为37%，DHA产量15. 3g/L。为了进一步提升裂壶 藻产DHA的经济性，本发明将进一步提升利用发酵的综合指标。
[0009] 从微观上来看，微生物体内DHA的合成过程可以分为2个阶段，第一阶段，从葡萄 糖酵解开始，经三羧酸循环（TCA)和柠檬酸裂解途径生成乙酰CoA和NADPH ;第二阶段是乙 酰CoA和NADPH通过依赖氧的FAS途径或不依赖氧PKS途径合成DHA等长链多不饱和脂肪 酸。Metz等人的研宄结果证实Schizochytrium sp.的DHA合成途径与细菌的PKS途径类 似。2006年，美国Market公司通过对Schizochytrium sp.研宄表明其I型脂肪酸合成酶和 长链多不饱和脂肪酸合成酶同时存在，DHA的合成只需长链多不饱和脂肪酸合成酶参与即 可，I型脂肪酸合成酶主要用于短链饱和脂肪酸（C14:0和C16:0)的合成。Schizochytrium 的PKS途径中存在一个和脂肪酸合酶相类似的多酶复合体-PKS合成酶，该酶是多亚基 的复合酶，包括：β _酮酰合成酶（β-ketoacyl synthase, KS)、β -酮酰-ACP还原酶 (β -ketoacyl-ACP reductase, KR)、稀脂酰-ACP 还原酶（enoyl-ACP reducatase, ER)、 脱水酶/异构酶（dehydrase/isomerase, D/I)、酰基转移酶（acyl carrier protein transacyla)和酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACPh在PKS合成酶的作用下，以 底物乙酰CoA和丙二酸单酰CoA作为基本的合成单位，经过缩合、还原、脱水、还原/异构的 循环往复，最终合成DHA。
[0010] 发明人认为，微生物发酵生产油脂的过程可以分为两个阶段：氮源未耗尽前的细 胞增殖生长阶段和氮源耗尽后的油脂合成积累阶段。研宄表明，细胞增殖阶段转向油脂合 成积累阶段需要一个前提条件，即培养基中氮源耗尽而碳源充足。在此条件下，培养基中的 碳源不再用于微生物胞内碳骨架的合成，而是转向油脂的积累。脂肪酸合成不仅需要细胞 连续供应乙酰辅酶A用于脂肪酸碳链的延伸，还需要提供足够的NADPH用以补充还原力。一 种生产菌株在给予充分营养和时间生长的情况下，其个体中总油脂含量占菌体自身重量的 比例基本稳定，细胞个体繁殖的高密度，是获取高总油脂产量的基础。
[0011] 总体上，DHA的发酵产量=总油脂产量*DHA占总油脂的含量。想要获取高的DHA 产量，一方面我们需要提高总油脂的产量，另一方面需要提高DHA占总油脂的含量。
[0012] 发明人发现，一种生产菌株在给予充分营养和时间生长的情况下，其个体细胞 中总油脂含量占菌体自身重量的比例基本稳定，但是由于培养工艺条件的区别会导致 细胞内蛋白、油脂、维生素等组分含量发生变化。以油脂中脂肪酸组分为例，研宄表明 Schizochytrium sp.其依赖氧气供应的I型脂肪酸合成酶和不依赖氧气供应的长链多不 饱和脂肪酸合成酶同时存在，且Schizochytrium sp.合成DHA只需不依赖氧气供应的长 链多不饱和脂肪酸合成酶（PKS)参与即可，I型脂肪酸合成酶主要用于短链饱和脂肪酸 (C14:0和C16:0)的合成。因此，当培养条件发生变化的时候，特别是改变溶氧指标的时候， 短链