海通叶挥发油的提取方法及应用与流程

本发明涉及药学技术领域，尤其是一种海通叶挥发油的提取方法及应用。

背景技术：

目前，挥发油的提取方法有水蒸汽蒸馏法、溶剂萃取法、油脂吸收法、超声波辅助提取法、微波辅助萃取法、超临界co2萃取技术等方法。这些方法中有些存在提取效率低，能耗大，原料成本高，仪器设备要求精密，对环境污染大等问题。

近些年，临床上抗生素的不合理使用造成微生物产生了广泛耐药性，长期使用抗菌及抗炎药物对人体的毒副作用也受到临床药物治疗的高度关注，同时，在化妆品添加剂使用者对抗氧化物质的化学成分也更倾向于天然有效成分，为此，寻找更合理的抗菌途径、抗炎、防腐剂及化妆品等物品添加剂在安全性上提出了更高的要求，用天然防腐剂代替化学合成防腐剂已成为发展趋势。

技术实现要素：

本发明的其中一个目的是提供了一种海通叶挥发油的提取方法。

本发明的另一个目的是提供海通叶挥发油在制备抑菌药物中的应用。

本发明是这样实现的：海通叶挥发油的提取方法，其特征在于：向海通叶干燥粗粉中加入10-14重量倍的水，浸泡8-12小时后再蒸馏6-10小时，在蒸馏过程中施加超声波60-100分钟；蒸馏结束后，获得海通叶挥发油。

海通叶挥发油在制备抑菌药物中的应用，将海通叶挥发油作为唯一有效成分。

为了验证本发明的技术效果，进行了如下实验。

一、海通叶挥发油的制备方法实验。

1.1材料与方法

1.1.1实验材料

药材采自贵州大学南校区，经贵州大学林学院鉴定为马鞭草科大青属植物clerodendrummandarinorumdiels的叶片，采摘后自然晾干，粉碎备用。

1.1.2实验仪器与试剂

fa2004型电子分析天平(上海良平仪器有限公司)，fw177型中药粉碎机(温岭市百乐粉碎设备厂)，bb89-2000型挥发油提取器(兰州昱欣仪器设备有限公司)，电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)，不锈钢断水自控蒸馏水器(天津市泰斯特仪器有限公司)，kh-500de型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。正己烷、无水硫酸钠、氯化钠均为分析纯、水为蒸馏水。

1.2不同单因素对海通叶挥发油得油率考察

1.2.1海通叶挥发油的提取

称取海通叶干燥粗粉100g，按《中华人民共和国药典》2010版i部附录xd挥发油测定甲法操作(中华人民共和国药典，2010)。以海通叶挥发油得油率为考察指标，以加液量(a)、浸泡时间(b)、蒸馏时间(c)、超声时间(d)为影响因素，进行正交试验，油水先在提取器中粗分离，将蒸出的油水混合物迅速冷却加入过量氯化钠至溶液达到饱和(王佰灵，2014)，静置2h，然后用正己烷萃取，无水硫酸钠脱水过夜，低于35℃自然风干，得到淡黄色油状物，精密称重，计算得油率：

挥发油得油率(％)＝海通叶中挥发油含量/海通叶重量×100％

1.2.2不同加液量对海通叶挥发油得油率的考察

称取海通叶粗粉约100g，共6份，分别加入6，8，10，12，14，16倍的水。浸泡2h，蒸馏5h，照2.2.1项下方法实验，重复三次，其挥发油平均得油率分别为0.21％，0.25％，0.27％，0.28％，0.27％，0.27％。表明：加水量在12倍时海通叶挥发油的得油率最高。原因可能为加水量过多易导致溶液暴沸，原料沾壁，影响提取效果，水量过少又不能充分浸润其原料，故选择12倍加液量为最佳加液量。

1.2.3不同浸泡时间对海通叶挥发油得油率的考察

称取海通叶粗粉约100g，共6份，加入12倍的水，浸泡时间分别为0，4，8，12，16，20h，蒸馏5h，按照2.2.1项方法实验，重复三次，其挥发油平均得油率分别为0.23％，0.25％，0.28％，0.3％，0.3％，0.29％。表明：海通叶挥发油提取率随着浸泡时间的延长而增大，但在浸泡时间大于12h以后，得油率变化不明显。浸泡理论认为浸泡可使植物细胞间隙变大，组织细胞充分膨胀，加速细胞内、外液动态交换而有利于挥发油的提取(伍振峰等，2014)。因此，可以认为海通叶浸泡12h组织已经充分膨胀，本着工业生产节约时间原则，浸泡时间选择为12h。

1.2.4不同超声时间对海通叶挥发油得油率的考察

称取海通叶粗粉约100g，共6份，加水12倍，浸泡时间12h，蒸馏时间10h，超声时间分别为20，40，60，80，100，120min，按照2.2.1项方法实验，重复三次，其挥发油平均得油率分别为0.22％，0.24％，0.28％，0.30％，0.30％，0.29％。表明：超声时间小于60min，得油率增加较为显著，60min后，挥发油得油率增加相对变慢，100min后挥发油得油率几乎保持不变，在超声100min时其挥发油得油率最佳。超声提取的优势在于由于超声波机械作用及温热效应的存在，使挥发油向外渗出的效率大大增加。一方面，机械效应可以使细胞内的物质产生震荡、旋转、摩擦等运动，并可以改变细胞膜的通透性，刺激细胞半透膜的弥散过程，加快了细胞内物质向外的渗出。另方面，温热效应可以提高溶剂(水)的温度，增加分子的运动速度，有利于细胞内成分的渗出(朱兆友等，2010)

1.2.5不同蒸馏时间对海通叶挥发油得油率的考察

称取海通叶粗粉约100g，共6份，加水12倍，浸泡时间12h，蒸馏时间分别为2，4，6，8，10，12h，按照2.2.1项方法实验，重复三次，其挥发油平均得油率分别为0.18％，0.22％，0.28％，0.30％，0.32％，0.32％。表明：蒸馏时间小于6h时，挥发油的量随蒸馏时间的增加较为明显，6h后，挥发油量增加相对缓慢，到达10h后，挥发油的量几乎不再有变化。由于随时间推移，料液中油类组分减少，海通叶挥发油蒸馏出的量也相应减少。在蒸馏10h达到最大值并保持相对平稳，故选择10h为最佳蒸馏时间。

1.2.6实验因素水平设计

参考单因素实验结果，以挥发油得油率为指标，考察海通叶加液量、浸泡时间、超声波处理时间、蒸馏时间四个因素，每个因素三个水平，见表1。准确称取海通叶，加入蒸馏水，室温下浸泡，釆用正交设计表中的设计方案进行海通叶挥发油的提取(每个处理重复3次)。蒸溜所得挥发油，釆用少量正己烷多次萃取，在用少量无水硫酸钠干燥，挥去正己烷后，记录出油量(g)。

表1实验因素水平

1.2.7正交实验

根据单因素实验结果，选择加液量(a)、浸泡时间(b)、蒸馏时间(c)和超声时间(d)为考察因素，每个单因素各3个水平，以海通叶挥发油得油率为评定指标，选用l9(3⁴)正交表。称取海通叶粗粉约100g，共9份，照1.2.1项方法进行实验，结果见表2。

表2海通叶提取工艺的正交实验结果

表3方差分析表

注：f0.05(2，2)＝19，f0.01(2，2)＝99。

由表3方差分析结果表明：c因素的影响具有非常显著性意义(p<0.01)，a因素具有显著性(0.1<p<0.05)，b、d显著性不明显(p<0.1)，因此，最优水平为a2b2c2d1，即加液量12倍，浸泡时间12h，超声时间80min，蒸馏时间10h。结果与单因素实验结果一致。

1.2.8验证性实验

取海通叶粗粉约100g，共5份，根据筛选a2b2c2d2得到的工艺进行验证实验，得到挥发油得油率分别为0.32％，0.34％，0.33％，0.33％，0.34％，平均得油率为0.332％，rsd为2.52％，表明所得到的挥发油提取工艺稳定可行，重复性好。

1.3结论

1、水蒸气蒸馏法是提取挥发油最常用的方法，具有设备简单、容易操作、成本低、得油率高的优点。

2、在提取过程中发现粉碎的海通叶粗粉质轻，易漂于水面上不易浸透，故在加水浸泡时应注意搅拌，使海通叶能充分浸润。

3、提取器蒸馏的海通叶挥发油油滴散布在水中，有些密度大的成分会下沉至挥发油提取器的刻度下端，导致无法聚集，故本文采取加入少量正己烷的方法以促进其挥发油的聚集。

4、水蒸气蒸馏法提取挥发油，由于温度过高可能对有些对热敏感的化合物结构造成破坏，同时，海通叶自身酶的作用加速其某些次生代谢产物分解，从而，对挥发油的提取有一定的影响。

通过gc-ms检测出海通叶挥发油主要化合物中含量最高的1-辛烯-3-醇，又称蘑菇醇(mashroomaloeho1)，其次芳樟醇，因此构成了特殊的香味。目前使用的香料产品中，芳樟醇是使用频率最高的一种广谱性香料等。普遍应用于制造香精香料(陈尚钘等，2013)、医疗保健、制药等领域(王坚，2004；bradleybf，2007)。

二、海通叶挥发油的抗菌实验

2.1材料与仪器

2.1.1材料与试剂

海通叶采自贵州大学南区，经贵州大学林学院鉴定为马鞭草科大青属植物clerodendrummandarinorumdiels的叶；牛肉浸膏(上海博微生物科技有限公司)氯化钠(ar，成都金山化学试剂有限公司)；葡萄糖(ar，成都金山化学试剂有限公司)；酵母粉(北京奥博星生物技术有限公司)；蛋白胨(北京奥博星生物技术有限公司)；青霉素钠(哈药集团制药总厂)；酮康唑(阿拉丁)；丙酮(上海南翔试剂有限公司)；正己烷(上海南翔试剂有限公司)；蒸馏水(自制)；

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球(staphylococcus)、奇异变形杆菌(proteusmirabilis)、大肠杆菌(escherichiacoli)、铜绿假单胞杆菌(pseudomonasaeruginosa)、白色念珠菌(candidaalbicans)、木霉(trichodermaspp)、青霉(bgbfngnvb.nhg)均由贵州省中药民族药创制工程中心提供。

2.1.2实验仪器

自动双重纯水蒸馏仪(上海亚荣生化仪器厂)；电热恒温箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；zwyr-2102c型恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；cj-2d洁净工作台(天津泰斯特仪器有限公司)；千分之一电子天平(福州华志科学仪器有限公司)。

2.2实验方法

2.2.1海通叶挥发油的提取

称取海通叶干燥粗粉100g，按《中华人民共和国药典》2010版i部附录xd挥发油测定甲法操作。采用水蒸气蒸馏法最佳提取工艺加12倍量水浸泡12h，蒸馏提取10h，超声80min提取海通叶挥发油，油水先在提取器中粗分离，将蒸出的油水混合物迅速冷却加入过量氯化钠至溶液达到饱和，静置2h，然后用正己烷萃取，无水硫酸钠脱水过夜，低于35℃自然风干，得到淡黄色油状物，精密称重，计算得油率，阴凉避光保存备用。

2.2.2菌悬液的制备

测定海通叶挥发油对细菌活性的抑制作用时，应该保证接种时的细菌浓度需要达到10⁸cu/ml左右。为尽可能的控制细菌原始数量，使其结果更加可靠，故对其生长曲线进行实验研究。

(1)培养基的配置

1)肉汤培养基：称取牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠15.0g、溶解于1000ml水中，调节ph值约7.0，分装于三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min。

2)肉汤琼脂培养基：：称取牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠15.0g、20.0g琼脂溶解于1000ml水中，调节ph值约7.0，分装于三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min。

3)改良马丁培养基：称取蛋白胨5.0g、k2ho41.0g、酵母浸出粉2.0g、mgso40.5g、葡萄糖20.0g、14.0g琼脂，溶解于1000ml水中，调节ph值约7.0，分装于三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min。

4)霉菌培养基：马铃薯去皮切块200.0g、蔗糖20.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000ml,自然ph。

(2)细菌液体培养基及od值测定

按照“2.2.2菌悬液的制备”方法，(1)配置液体培养基，测定其原始培养基od值，在接种菌种，(第三代)，将三角瓶放于振荡器中37℃，真菌为25℃培养，每隔8h取样一次，测定od值，同时，将样液分别稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍。按照本章“4.2.2菌悬液的制备”方法的(1)方法配置相应的琼脂培养基，并将培养基倒入灭菌干燥好的培养皿中，冷却后，取稀释10⁶、10⁷倍的菌液0.1ml，接种到培养皿中，37℃真菌25℃培养48h(真菌为24h)，数出其中的菌落数，以此判断原始取样的浓度，直到浓度为10⁸cfu/ml左右。

菌悬液的制备：细菌采用平板计数法，霉菌采用显微镜直接记数法测菌体或孢子个数，调至浓度为含孢子或菌体10⁶～10⁷个.ml^-1的菌悬液，备用(沈萍，1999)。

2.2.3抑菌活性测定

采用滤纸片法(沈萍，1999)：制直径为6mm圆形滤纸片，灭菌后备用；将各种待测菌悬液各取100μl在相应的固体培养基上均匀涂抹，制成含菌平板；将滤纸片放入用丙酮稀释80％海通叶挥发油溶液中浸泡2h，取浸泡过滤纸片贴在含菌平板上，每个培养皿贴滤纸片2片。用丙酮浸泡的滤纸片做空白对照，用浓度为1mg·ml^-1(稀释剂为蒸馏水)的青霉素钠浸泡的滤纸片作为细菌抑菌对照，用浓度为0.4mg·ml^-1(稀释剂为丙二醇)的酮康唑浸泡的滤纸片作为真菌抑菌对照。细菌置培养箱中36℃下培养24h，霉菌置培养箱中27℃下培养72h。测量抑菌圈的直径(mm)，做3次平行实验，结果取均值。

2.2.4最低抑菌浓度(mic)的测定

采用平板涂布法(赵淑艳，2008)：将浓度为10％、5％、2.5％、1.25％、0.625％、0.3125％(溶剂为丙酮)的挥发油定量地加入到培养基中，充分混合均匀，倒入培养皿，待培养基冷却后，用接种针于各培养基中依次涂布供试菌液0.1ml，细菌置培养箱中36℃下培养24h，真菌置培养箱中27℃下培养72h，观察菌体的生长情况，每个浓度做3次重复，从无菌生长的培养基中找出提取物浓度最低的培养基，即为该抑菌剂的最低抑菌浓度。

2.2.5不同ph值对海通叶挥发油抑菌活性的影响

用20％的naoh和50％的柠檬酸调节ph值，分别制成ph为4、5、6、7、8、9的系列培养基，将50％浓度(溶剂为丙酮)的挥发油分别在按照2.2.3项方法测定其对金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色链球菌、木霉抑菌圈大小，比较不同ph值对海通叶挥发油抑菌活性的影响。

2.2.6抑菌成分热稳定性实验

将挥发油分别置于80、100、121℃下热处理15min，制成50％浓度(溶剂为丙酮)的挥发油溶液，选取相应待试菌，按照2.2.3项项方法测定其对金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色链球菌、木霉抑菌圈大小，比较不同温度下处理的海通叶挥发油对其抑菌活性的影响。

2.2.7抑菌活性紫外稳定性实验

将挥发油放置在紫外灯下照射5、10、15、20、25min，制成50％浓度(溶剂为丙酮)的挥发油溶液，按照2.2.3项方法测定其金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色链球菌、木霉抑菌圈大小，比较紫外灯照射对海通叶挥发油抑菌活性的影响。

2.3结果与分析

2.3.1海通叶挥发油的抑菌活性

海通叶挥发油对菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、白色链球菌、木霉、青霉抑菌效果如表4所示。

表4海通叶挥发油对供试菌的抑菌圈直径

注：-表示没有测定

抗菌素抑菌圈的判定标准是：抑菌圈直径＞15mm时为较敏感、10～15mm为中度敏感，7～9mm时为低度敏感，无抑菌者为不敏感(沈萍，1999)。由表4结果可见，海通叶挥发油对8种供试菌均具有抑菌效果，对表皮葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌的抑菌圈直径处于10～15mm之间，属于中度敏感；对金黄色葡萄球菌、奇异变相杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、木霉、青霉的抑菌圈均达15mm以上，属较敏感。结果表明海通叶挥发油对各供试的细菌、真菌均有抑制作用。

2.3.2海通叶挥发油的最低抑菌浓度(mic)

海通叶挥发油对8种供试菌的最低抑菌浓度(mic)的测定结果如表5所示。

表5海通叶挥发油对供试菌的mic

注：－表示无菌落出现；+表示有菌落出现。

海通叶挥发油对各组受试菌均有一定的抑制作用，因此，采用适当的海通叶挥发油稀释浓度对各受试菌进行稀释敏感实验，由表4-2可知，海通叶挥发油对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色链球菌、木霉、青霉各受试菌的最小抑制浓度(mic)分别是2.5％、5％、2.5％、2.5％、5％、1.25％、0.625％、0.625％。从上表还可看出，在低于的浓度范围内，随挥发油浓度的降低，各受试菌生长越多。

2.3.3ph值对海通叶挥发油抑菌活性的影响

以金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色链球菌、木霉为对象菌，不同ph值条件下海通叶挥发油对6种菌的抑菌效果如图1。

图1结果显示：当ph值为4时菌体几乎停止生长；ph值为5、6、7时，随ph值的增大抑菌圈有减小的趋势。表明海通叶挥发油的抑菌效果在酸性条件下极为敏感，在中性和碱性范围内随ph值的增大而有所减弱。低ph抑菌力增强有两方面的原因：一方面是h⁺的作用，ph降低，改变细菌所处生长环境发，降低了细菌的活性；另一方面，ph降低引起非极性酚类化合物上所带的酚羟基的电离度变小，疏水性增加，酚类更易溶于细菌细胞膜的脂相及蛋白质的疏水区域，和细胞膜上的蛋白质结合能力更强，因而ph降低，抑菌作用增大(顾仁勇，2006)。

2.3.4海通叶挥发油热稳定性测定结果

海通叶挥发油分别经过80、100、121℃热处理15min，测定其对金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色链球菌、木霉的抑菌圈大小，结果见图2。

图2的结果可知，经过80、100、121℃的热处理15min后，海通叶挥发油对金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色链球菌、木霉的抑菌圈直径相互间没有明显差异。这一结果表明海通叶挥发油在加热的条件下，对其抗菌成分影响不明显，说明其中的抑菌菌成分具备良好的热稳定性。

2.3.5海通叶挥发油抑菌效果的紫外稳定性

海通叶挥发油在5、10、15、20、25min紫外光下处理由，测定其对金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色链球菌、木霉抑菌圈的大小，结果见图3。

如图3可见，在紫外光处理条件下，随着时间的变化海通叶挥发油对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色链球菌、木霉、青霉的抑菌活性基本保持不变，结果表明：海通叶挥发油对紫外光照射具有较好的稳定性。

2.4讨论

海通叶挥发油对8种受试菌的抑菌效果有一定差异，对霉菌的抑制作用相对较强，对革兰阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制作用相对较弱；挥发油对温度和紫外照射具有良好的稳定性，在不同的ph值条件下其抑菌活性不稳定，酸性环境下其抑菌活性较弱，ph<5琼脂培养基不易凝固成型，对菌液的均匀涂布有一定的影响；因此，ph的改变对抑菌活性影响较大。

与现有的技术相比，本发明优化了提取方案，有效降低了海通叶挥发油的提取成本，并显著提高了提取效率；发明人还发现了海通叶挥发油对于金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、白色链球菌、木霉及青霉等具有抑制效果，既能作为新的抗菌途径和有效且安全的食品天然防腐剂，为海通资源的综合开发利用提供一些有益的参考依据。本发明材料来源广泛，成本低廉，使用效果好。

附图说明

图1ph值对海通叶挥发油抑菌效果的影响；

图2温度对枫香叶精油抑菌效果的影响；

图3紫外光处理对海通叶挥发油抑菌的影响。

具体实施方式

本发明的实施例1：海通叶挥发油的提取方法，其特征在于：向海通叶干燥粗粉中加入12重量倍的水，浸泡12小时后再蒸馏10小时，在蒸馏过程中施加超声波80分钟；蒸馏结束后，获得海通叶挥发油。

本发明的实施例2：将海通叶挥发油作为唯一活性成分加入药学上可接受的辅剂，制成各种剂型的抑菌药物。