一种2,4-二氯苯氧乙酸在提高裂壶藻dha产量及促进裂壶藻油脂积累中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种在裂壶藻生长过程中添加2,4-二氯苯氧乙酸以提高裂壶藻DHA产量及裂壶藻油脂积累的方法，属于微藻生物【技术领域】。具体操作步骤为：(1)在裂壶藻生长的调整期，添加不同浓度的2,4-二氯苯氧乙酸；(2)分析加入不同浓度的2,4-二氯苯氧乙酸对油脂积累及DHA含量的影响。本发明首次提出在裂壶藻的生长过程中添加2,4-二氯苯氧乙酸提高裂壶藻油脂积累以及DHA的含量，为使用化学方法促进裂壶藻油脂积累以及DHA含量提高提供了一条新思路。
【专利说明】一种2, 4-二氯苯氧乙酸在提高裂壶藻DHA产量及促进裂壶 藻油脂积累中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微藻生物【技术领域】，具体涉及一种2, 4-二氯苯氧乙酸在提高裂壶藻 DHA产量及及促进裂壶藻油脂积累中的应用。
【背景技术】
[0002] DHA是ω-3多不饱和脂肪酸，在脑和视网膜发育中起到重要作用，已经引起人们 的广泛关注。膳食中缺少ω-3多不饱和脂肪酸，会增加癌症、抑郁症、老年痴呆症、糖尿病、 高血压和心血管疾病、脑血管意外、关节炎和动脉粥样硬化的风险。目前，鱼被证明是DHA 的主要来源，但统计数据显示鱼在市场上的数量从1950年的100万吨增加到大约2000万 吨，1990年之后并没有增加，随后证实了鱼的数量已接近市场最大潜力这一事实，这就促使 人们去寻找新的DHA来源。而人们在微藻中如甲藻、Prymnesiophyceae、Euglenophyceae 和Thraustochytriaceae发现有大量的DHA。目前公认的裂壶藻因含有大量的DHA已经引 起了人们的关注，这类海洋微藻已经用作商业来源进行生产的DHA并添加到婴幼儿配方奶 粉或其他食品。裂壶藻具有增长快，产率高，不饱和脂肪酸尤其是DHA含量较高，生物量大， 方便采收等的优点，已成为生产DHA的优质来源。
[0003]目前关于DHA的生产专利主要集中在如何提高提取的效率上，而在如何提高微藻 中DHA含量上鲜有报道。因此我们需要寻找一种新的方法，来提高裂壶藻中DHA含量。
[0004] 生物活性小分子是一类分子量低，能够主动运输到细胞内目标位置的化学物质， 因此它们对大多数的生物合成途径具有重要影响，最终影响细胞的生长。小分子植物激素 是植物生长发育的重要调节器。虽然在微藻也发现有植物激素存在，但它们的功能和作用 方式，特别是在微藻领域的应用未见报道。
[0005] 2, 4-二氯苯氧乙酸（简称2, 4-D)，是一种无臭晶体，难溶于水，易溶于有机溶剂。 2, 4-二氯苯氧乙酸是植物生长调节剂和除草剂，现已广泛应用于农业生产。在植物体内激 素与细胞内相应的激素受体的蛋白质结合后即表现出调节代谢的功能，激素受体与激素有 很强的专一性和亲和力。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是，提供一种2, 4-二氯苯氧乙酸在提高微藻DHA产量及 油脂积累中的应用。
[0007] 为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0008] 2, 4-二氯苯氧乙酸在提高裂壶藻DHA产量中的应用在本发明的保护范围之内。
[0009] 其中，在裂壶藻培养基中添加植物为2, 4-二氯苯氧乙酸，添加时间为裂壶藻生长 的调整期，优选在裂壶藻〇D_值为0?0. 5时（调整期）添加2, 4-二氯苯氧乙酸，最优选 在裂壶藻OD68tl值为0. 5时（调整期）添加2, 4-二氯苯氧乙酸。
[0010] 其中，2, 4-二氯苯氧乙酸的添加量为0. 5?12 μ g/L，优选为1. 5?12mg/L，最优 选 6mg/L〇
[0011] 其中，裂壶藻培养的温度为22?30°C，优选30°C;光照强度为2000?40001ux， 优选 30001ux。
[0012] 2, 4-二氯苯氧乙酸在提高裂壶藻DHA产量和促进裂壶藻油脂积累中的应用在本 发明的保护范围之内。
[0013] 其中，在裂壶藻的培养基中添加的植物为2, 4-二氯苯氧乙酸，添加时间为裂壶藻 生长的调整期，优选在微藻〇D_值为0?0. 5时（调整期）添加2, 4-二氯苯氧乙酸，最优 选在微藻OD68tl值为0. 5时（调整期）添加2, 4-二氯苯氧乙酸。
[0014] 其中，2, 4-二氯苯氧乙酸在裂壶藻生长的调整期的添加量为0. 5?3mg/L，优选 I. 5mg/L〇
[0015]其中，裂壶藻培养温度为25?30°C，优选30°C;培养光照强度为2000?40001ux， 优选为30001ux。
[0016] 2, 4-二氯苯氧乙酸在促进裂壶藻油脂积累中的应用在本发明的保护范围之内。
[0017] 其中，在裂壶藻培养基中添加植物为2, 4-二氯苯氧乙酸，添加时间为裂壶藻生长 的调整期，优选在裂壶藻〇D_值为0?0. 5时（调整期）添加2, 4-二氯苯氧乙酸，最优选 在裂壶藻OD68tl值为0. 5时（调整期）添加2, 4-二氯苯氧乙酸。
[0018] 其中，2, 4-二氯苯氧乙酸在裂壶藻生长的调整期的添加量为0. 5?3mg/L，I. 5mg/ L〇
[0019]其中，裂壶藻培养温度为25?30°C，优选30°C;培养光照强度为2000?40001ux， 优选为30001ux。
[0020] 有益效果：
[0021] 本发明具有如下显著特点和效果：
[0022] (1)本发明首次提出在裂壶藻的生长过程中添加2, 4-二氯苯氧乙酸，为促进裂壶 藻中油脂积累及提高裂壶藻DHA提供了一条新思路。
[0023] (2)通过补充2, 4-二氯苯氧乙酸，可以明显促进裂壶藻中油脂积累及DHA的积累， 积累量是未添加时的1. 13倍和1. 35倍，为使用2, 4-二氯苯氧乙酸提高裂壶藻中油脂积累 和DHA积累提供了实验基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1在裂壶藻生长的调整期，加入不同浓度的2, 4-二氯苯氧乙酸，裂壶藻DHA含 量的变化。其中，横坐标为2, 4-二氯苯氧乙酸添加的不同浓度，纵坐标为裂壶藻DHA含量 的变化，数据为3次平行取样的平均值。
[0025] 图2在裂壶藻生长的调整期，加入不同浓度的2, 4-二氯苯氧乙酸，裂壶藻油脂积 累的变化。其中，横坐标为2, 4-二氯苯氧乙酸添加的不同浓度，纵坐标为裂壶藻油脂积累 的变化，数据为3次平行取样的平均值。
【具体实施方式】
[0026] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0027] 以下实施例中所使用的微藻为裂壶藻SR21(SchizochytriumlimacinumSR21), 该菌株购自美国模式菌种收集中心（ATCC,Americantypeculturecollection),编号为 ATCCMYA-I38I〇
[0028] 以下实施例中2, 4-二氯苯氧乙酸简写为2, 4-D。
[0029] 以下实施例中裂壶藻按照以下方式培养：将新鲜裂壶藻细胞按照5%的体积分数 接种到装有IOOml新鲜的基础Tap培养基的250ml三角瓶中，静置培养，并在裂壶藻生长的 调整期添加2, 4-D，其间每天摇动三角瓶3?5次，当裂壶藻细胞增殖到最大密度的稳定期 时采收裂壶藻细胞，藻液离心浓缩，用去离子水洗涤、离心，去除裂壶藻细胞培养盐，制备成 无培养盐的湿藻，作为萃取油脂之用。
[0030] 以下实施例中所用的基础培养基（每升）配方如下：400.OOmgNH4Cl, 50.OOmgCaCl2 · 2H20, 100.OOmgMgSO4 · 7H20,98. 80mgNa2HP04, 61. 73mgKH2PO4, 50.OOmgNa2EDTA· 2H20, 22.OOmgZnSO4 · 7H20, 11. 40mgH3BO3, 5.IOmgMnCl2 · 4H20, 5.OOmgFeSO4 · 7H20,1. 60mgCoCl2 · 6H20,1. 16mgCuSO4 · 5H20,1.IOmg(NH4)6Mo7O24 · 4H20, 2420.OOmgTrismaBase,ImlGlacialAcetic。
[0031] 以下实施例中裂壶藻的油脂通过以下方法得到：向所得的Ig裂壶藻干品（请补充 裂壶藻干品的制备方法）中加入5ml浓盐酸（质量浓度36% -38% )，混匀，70°C水浴中放 置20min，加入5ml无水乙醇，静置冷却后再向体系中加入5mL乙醚，振荡lmin，4000rpm离 心2min，获得上层乙醚相和下层沉淀，将上层乙醚相移出，向下层沉淀中加入5mL的乙醚， 振荡lmin，4000rpm离心2min，再将上层乙醚相移出，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除 溶剂，获得藻油。裂壶藻细胞油脂含量表达为mg*g^k，即裂壶藻油脂含量（％)=油脂重 量/裂壶藻干品重量*100。
[0032] 以下实施例中藻油通过如下方法进行甲酯化，向所得到的藻油加入CHCl3，将藻油 充分溶解，转入1.5mlAgilent玻璃瓶中，加入Imllmol/L的硫酸甲醇溶液，充N2密封，于 l〇〇°C反应lh，自然冷却，加入200μL去离子水，混匀，用200μL正己烷萃取3次，合并有 机相，用200μL去离子水反萃取洗涤3次，取有机相，转入I. 5mlAgilent玻璃瓶中，N2吹 干,称重。
[0033] 以下实施例中脂肪酸甲酯的定量分析条件如下：
[0034] 采用Agilent公司生产的7890型气相色谱仪（GC)。
[0035]GC分析条件：DB-WAX毛细管色谱柱（30mX0. 32_X0. 50μm)。柱升温程序：从 50°C升至200°C，保持5min;然后以KTC/min升至250°C，保持3min。载气：氮气；流量： 3ml/min。检测器：氢火焰检测器，氢气：30ml/min;空气：300ml/min。进样口温度：280°C; 检测器温度300°C。
[0036] 实施例1 :
[0037]为了考察2, 4-D对裂壶藻多不饱和脂肪酸组分尤其是DHA的影响，除了培养初期 加入 2, 4-D，即OD68。值为 0· 5 时加入浓度为 0mg/L、0. 5mg/L、l. 5mg/L、3mg/L、6mg/L、12mg/L 的 2,4-D。
[0038] 在上述各组培养液中分别以体积分数5%的接种量接种新鲜的裂壶藻，在25°C， 30001UX的恒温光照培养箱中培养至调整期，获得藻液。培养过程中，每隔24h取藻液，于 680nm下测定藻液的吸光度，得到裂壶藻的生长曲线。
[0039] 将上述藻液离心浓缩，用去离子水洗涤、离心，去除裂壶藻细胞培养盐，制备成无 培养盐的湿藻，作为萃取油脂之用。
[0040] 裂壶藻生长调整期加入不同浓度2, 4-D对其脂肪酸组成的影响见表1所示。结果 显示相对于对照组（2, 4-D的浓度为0μg/L)，在裂壶藻生长的调整期加入2, 4-D能够显著 提高裂壶藻的DHA含量。裂壶藻DHA含量的提高程度与2, 4-D的浓度有很大的关系，随着 2, 4-D浓度的增加，裂壶藻的油脂含量呈现一个逐渐增加的趋势，但是高浓度的2, 4-D也会 导致裂壶藻DHA含量的略微下降，综合考虑2, 4-D对裂壶藻DHA含量的影响，选择2, 4-D浓 度6mg/L，作为裂壶藻DHA积累的最适宜浓度，此时裂壶藻的DHA含量为对照组的1. 35倍。
[0041] 表1裂壶藻生长调整期加入不同浓度2, 4-D对其脂肪酸组成的影响
[0042]
【权利要求】
1. 2, 4-二氯苯氧乙酸在提高裂壶藻DHA产量中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在裂壶藻生长的调整期向其培养基中加 入2, 4_二氣苯氧乙酸。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，2, 4-二氯苯氧乙酸的添加量为0. 5? 12 u g/L〇
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，裂壶藻培养的温度为22?30°C，光照强 度为 2000 ?40001ux。 5. 2, 4-二氯苯氧乙酸在提高裂壶藻DHA产量和促进裂壶藻油脂积累中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在裂壶藻生长的调整期向其培养基中加 入2, 4_二氣苯氧乙酸。
7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，2, 4-二氯苯氧乙酸的添加量为0. 5? 3 u g/L〇
8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，裂壶藻培养的温度为22?30°C，光照强 度为 2000 ?40001ux。 9. 2, 4-二氯苯氧乙酸在促进裂壶藻油脂积累中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在裂壶藻生长的调整期向其培养基中加 入2, 4_二氣苯氧乙酸。
11. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，2, 4-二氯苯氧乙酸的添加量为0. 5? 3 V- g/L
12. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，裂壶藻培养的温度为22?30°C，光照强 度为 2000 ?40001ux。
【文档编号】C12R1/89GK104357498SQ201410494587
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】陈以峰, 何冰, 阿里·帕萨爱默尔 申请人:江苏省农业科学院