专利名称：利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法
技术领域：
本发明属于肝素的检测领域，特别是涉及一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法。
背景技术：
肝素Q^parin)是由D- β -葡糖醛酸(或L- α -艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖通过糖苷键连接形成的重复二糖单元组成的一种糖胺聚糖，是蛋白多糖的一种。作为有效的抗凝剂，肝素能抑制血小板聚集，刺激血管内皮细胞释放抗凝物质和纤溶物质，抑制凝血酶的形成及活性，并能促使纤维蛋白溶解。因此是临床上常用的抗凝血药物，主要用于外科预防血栓形成以及妊娠者的抗凝血治疗，以及在心脏手术和肾脏透析时维持血液体外循环畅通。但当肝素用量过大时会引起自发性出血，如各种黏膜出血、关节腔积血和伤口出血等，在临床应用中需要进行实时监控。因此，研究肝素的定量测定方法具有十分重要的临床意义。肝素的常用测量方法主要有电化学分析法、分光光度法、荧光法、区带毛细管电泳法、 高效液相色谱法及比色法等。电化学方法则易受到溶液中氧气的干扰，分光光度法灵敏度不高，荧光法容易产生光漂白问题，影响测定的准确性，毛细管电泳法和高效液相色谱法需要昂贵的仪器，操作不便，而比色法主要是基于纳米粒子与肝素作用改变纳米颗粒的大小， 导致纳米粒子的光信号改变，并可通过肉眼检测颜色的变化，具有简单，快速，灵敏度高的优点。贵重金属纳米粒子(NPs)，如Au NPs和Ag NPs由于其表面等离子共振吸收峰而具有独特的光学性能，在医学领域的应用引起了相当大的关注，尤其是在生物传感、疾病诊断、光热疗法以及药物和基因传递领域。在众多的以聚合物辅助合成的Au Ws的实例中，以聚乙烯亚胺(PEI)为稳定剂和还原剂通过原位自动还原的方法合成的纳米粒子已经引起人们大量的关注。这主要是由于聚乙烯亚胺价廉易得，并且利用其分子结构中大量的氨基还原金纳米颗粒可以避免硼氢化钠等还原剂的使用，同时也不涉及高温高压的反应条件， 是一种简便、绿色的金纳米颗粒的制备方法。查阅相关文献，目前还未见利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子来检测肝素含量的方法的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，该方法简单，反应条件温和，易于操作，低能耗无污染，符合绿色化学的要求，同时所用金纳米颗粒的稳定剂为聚乙烯亚胺，价廉易得，具有产业化实施的前景。本发明的一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，包括(1)在100_200μ L聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，加入2. 9mL pH值为 3.6的醋酸盐缓冲溶液，室温放置15min后测试其紫外吸收曲线；(2)在η份与步骤(1)中相同体积的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，分别加入2. 9mL含有不同浓度肝素的醋酸盐缓冲溶液，得到η份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液；其中每份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度为 0. 5-15 μ g/mL，20 ^ η ^ 80 ；(3)将步骤(2)得到的η份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液，在室温下放置15min后，分别测试其紫外吸收曲线；(4)根据步骤⑴和(3)中所得到的紫外吸收曲线，得出步骤(2)中所述的含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值的关系；(5)测试肝素样品将90-330yg的肝素样品溶解在^ml醋酸盐缓冲液中，加入 Iml聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液，室温放置15min，测试其紫外吸收曲线；然后计算肝素样品的紫外吸收曲线中670nm处吸收值与处吸收值的比值，利用步骤(4) 中所述的肝素的浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值的关系确定肝素样品中肝素的浓度。步骤(1)和O)中所述的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液的制备方法为 称取聚乙烯亚胺3-6mg，溶解在IOmL水中，然后边搅拌边滴加100-200 μ L浓度为48. 6mg/ mL氯金酸溶液，反应2-6天，得到聚乙烯亚胺稳定化金纳米颗粒的水溶液，随后将该水溶液置于4°C冰箱中冷藏备用。上述的聚乙烯亚胺为超支化聚乙烯亚胺。上述的氯金酸与聚乙烯亚胺的质量比为1.62 1。上述的反应2-6天中的反应温度为25_37°C，随着反应温度的升高，反应时间会有所缩短，同时温度太低不利于金纳米颗粒的形成，温度太高会使产生的金纳米颗粒不够稳定，最后产物为酒红色纳米金的水溶液。步骤(1)和O)中所述的醋酸盐缓冲溶液的浓度为0. 02-0. 08Mo步骤O)中所述的η份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度分别为 1 μ g/mLU. 5 μ g/mL,2 μ g/mL,2. 5 μ g/mL,3 μ g/mL,3. 5 μ g/mL,4 μ g/ mL、4.5 μ g/mL、5 μ g/mL、5. 5 μ g/mL、6 μ g/mL、6. 5 μ g/mL、7 μ g/mL、7. 5 μ g/mL、8 μ g/mL、 8.5 μ g/mL、9 μ g/mL、9· 5 μ g/mL、10 μ g/mL、10. 5 μ g/mL、11 μ g/mL、11. 5 μ g/mL、12 μ g/mL, η = 23。步骤(3)中测试得到的样品的最大紫外吸收波长为5^nm，所用定量依据是样品在670nm与529nm处的吸光值的比值与肝素浓度之间存在的定量关系。步骤中所述的步骤O)中所述的含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与处吸收值的比值的关系为当步骤O)中所述的含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度为3-8 μ g/mL时，其浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与处吸收值的比值呈指数关系，其中 Y = O. 40614+1. 02292X IO"4Xe(x/L 02369), R2 = 0. 99058，如图 6(b)所示； 当步骤O)中所述的含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度为 7-11 μ g/mL时，其浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值呈线性关系，其中Y = -0. 56446+0. 15069X，R = 0. 99757，如图6(a)所示；肝素浓度的最低检测限为 1. 5 μ g/mL。
从紫外图(图4)中可以看出，肝素的加入对金纳米颗粒的紫外吸收曲线有较大的影响，同时随着肝素浓度的增加，其紫外吸收值在529nm逐渐减小，而在670nm处吸收值逐渐增加，在一定范围内可用670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值定量计算肝素含量。测试结果表明当肝素浓度在3-8 μ g/mL时，其浓度和金纳米颗粒在670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值呈指数关系；当肝素浓度在7_11 μ g/mL时，其浓度和金纳米颗粒在670nm处吸收值与处吸收值的比值呈线性关系，最低检测限为1. 5μ g/mL，表现出良好的实际应用价值。选择性测试(以验证常见聚合物的加入对金纳米颗粒没有影响，从而它们的存在不会干扰肝素的测定)(1)在100-200 μ L聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，加入ρΗ值为3. 6的醋酸盐缓冲溶液2. 9mL，室温放置15min后测试其紫外吸收曲线；(2)在ρΗ值为3. 6的醋酸盐缓冲溶液中加入聚赖氨酸，得聚赖氨酸浓度为10 μ g/ mL的溶液B，取2. 9mL上述的溶液B，加入到与步骤(1)中相同体积的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，得到含有聚赖氨酸的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液；(3)按照步骤O)的方法，分别制得含有壳聚糖、葡萄糖、半胱氨酸、硫酸软骨素或氯化钠的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液；(4)将步骤( 和( 所得的溶液，在室温放置15min后，本别测试其紫外吸收曲线.
一入 ，(5)在ρΗ值为3. 6的醋酸盐缓冲溶液中加入肝素和壳聚糖，得肝素和壳聚糖的浓度分别为5 μ g/mL、10 μ g/mL的溶液C，然后取2. 9mL上述的溶液C，加入到与步骤(1)中相同体积的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，室温放置15min后测试其紫外吸收曲线。从紫外图(图幻中可以看出，聚赖氨酸，壳聚糖，葡萄糖，半胱氨酸，硫酸软骨素和氯化钠的加入对金纳米颗粒的紫外吸收曲线基本没有影响，证明金纳米颗粒检测肝素具有高选择性。另外，在金纳米颗粒中加入肝素和壳聚糖的混合液(浓度分别为5 μ g/mL和 10 μ g/mL,以验证加入正电荷物质可以阻止肝素的负电性对金纳米颗粒的影响)也对金纳米颗粒没有影响，进一步证明了是肝素的负电性对金纳米粒子产生了聚集作用。由于纳米金的表面等离子体共振吸收峰随颗粒粒径的不同而改变，这一变化可以通过紫外吸收的改变进行定量评价，并用于比色化学传感器。这种比色化学传感器具有响应时间快，选择性好，灵敏度高，可肉眼检测颜色的变化，实际应用方便等优点，在生物分子检测中受到了广泛的关注，并已用于DNA、蛋白质等生物大分子的定量检测。因此本发明利用肝素这一负电高聚物来诱导金纳米颗粒的粒径变化，来对肝素进行定量。其具体原理为在水溶液中，肝素由于分子结构中所具有的磺酸基和羧酸基酸性基团解离而带有负电荷，而金纳米颗粒表面由于包裹聚乙烯亚胺分子而带有正电荷。因此，肝素能与聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒发生静电吸引作用，使金纳米颗粒发生聚集，导致溶液颜色发生明显改变，并产生紫外吸收的变化。根据紫外吸收值的变化与肝素浓度的关系建立一种肝素含量的测定方法。本发明使用紫外-可见分光光度计(UV-Vis)、透射电子显微镜(TEM)、表面电势、 粒径等方法表征本发明制备的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒及其对肝素的检测应用，具体测试结果如下(1)紫外-可见光分光光度计的测试结果本发明制备的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒在529nm处有一个特征吸收峰，这是金纳米颗粒的表面等离子体共振峰，参见附图1 ；且该金纳米颗粒材料在不同的PH值(pH 小于5. 6)和不同温度-70°C )范围内均具有非常好的稳定性。(2)透射电子显微镜测试结果本方法制备的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的TEM图片和粒度分布直方图(参见附图2)，表明形成的金纳米颗粒相当均勻，粒径大小为4. 4nm，分布在较窄的范围内。加入 10 μ g/mL肝素后的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的TEM图片和粒径分布直方图(参见附图3)，表明形成的金纳米颗粒有明显的团聚现象，且粒径显著变大，粒径大小为36nm。表明肝素的加入可以使聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒稳定性变差，从而引起了金纳米颗粒的聚集。(3)表面电势及粒径测试取制备的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒溶液100 μ L，加入pH 3. 6的醋酸盐缓冲溶液2. 9mL,室温放置15min后测试其表面电势及粒径，结果表明其表面电势为+32. 6mV,粒径为40. 47nm，表明形成的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒表面带有大量的正电荷，可以维持其胶体的稳定性，同时金纳米颗粒的粒径也较小，但是显著大于透射电子显微镜测试的结果，主要是因为其纳米粒子和周围聚乙烯亚胺的水化作用，使得其粒径为多个纳米粒子的团簇的粒径。取制备的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒溶液100 μ L，加入含有肝素的2. 9mL醋酸盐缓冲溶液(肝素的终浓度为 ο μ g/mL)，室温放置15min后测试其表面电势及粒径，结果表明其表面电势为+5. 88mV，粒径约为432. 5nm。与没有加入肝素的金纳米颗粒相比其表面电势显著变小，失去了胶体的稳定性，所以粒径显著变大。但是显著大于透射电子显微镜的结果，主要是因为其纳米粒子和周围聚乙烯亚胺的水化作用，使得其粒径为多个纳米粒子的团簇的粒径。同时粒径的结果也进一步证明了由于加入了带有大量的负电荷的肝素，可以使聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的表面正电性变小，稳定性变差，从而引起了金纳米颗粒的聚集。通过将聚乙烯亚胺和氯金酸溶液混合，可在室温下利用聚乙烯亚胺的氨基原位还原合成金纳米颗粒，同时聚乙烯亚胺又可以作为稳定剂稳定金纳米颗粒，阻止其聚集，保证生成的Au Ws的尺寸分布较窄，形态均一。同时利用金纳米颗粒的表面等离子共振吸收峰随颗粒粒径的不同而改变的特性将其应用于比色化学传感器，并成功地应用于肝素的定量检测。有益效果(1)本发明的检测方法简单，反应条件温和，易于操作，低能耗无污染，符合绿色化学的要求，同时所用金纳米颗粒的稳定剂为聚乙烯亚胺，价廉易得，具有产业化实施的前
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足；(2)本发明利用金纳米颗粒的表面等离子体共振吸收峰随颗粒粒径的不同而改变的特性将其应用于比色化学传感器，并成功地应用于肝素含量的测定，从而使它们具有潜力广泛应用于生物医学领域；
(3)本发明中的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒尺寸相当均勻，粒径分布在较窄的范围内，且粒径较小，稳定性较好，可用于不同领域。
图1为本发明制备的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的紫外吸收光谱图；图2为本发明制备的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的TEM图片(a)和粒径分布直方图(b)；图3为加入10 μ g/mL肝素后，本发明制备的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的TEM 图片(a)和粒径分布直方图(b)；图4为加入不同浓度肝素后聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的溶液图片(a)和紫外吸收光谱图(b)，图中数字代表肝素浓度，单位为μ g/mL;图5为加入其它不同材料后的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的溶液图片(a)和紫外吸收光谱图(b)，1-8分别为添加材料之前，和添加聚赖氨酸(10 μ g/mL)，壳聚糖(10 μ g/ mL)，葡萄糖(10 μ g/mL)，半胱氨酸(10 μ g/mL)，壳聚糖(10 μ g/mL)和肝素(5 μ g/mL)混合物，硫酸软骨素(10 μ g/mL)，氯化钠(10 μ g/mL)后的纳米金颗粒溶液；图6为聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的紫外吸收值与肝素浓度的定量关系，a为肝素浓度范围7-11 μ g/mL, b为肝素浓度范围3-8 μ g/mL。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1称取聚乙烯亚胺6mg，溶解在IOmL水中制备聚乙烯亚胺溶液，然后边搅拌边滴加溶于200 μ L水的氯金酸溶液6mg/mL)，室温反应6天，得到聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的水溶液，随后将该水溶液置于4°C冰箱中冷藏备用；紫外-可见分光光度计的测试结果表明其最大吸收波长为M9nm，透射电子显微镜测量结果表明形成的金纳米颗粒相当均勻，粒径大小为4. 4nm，分布在较窄的范围内。表面电势及粒径测试结果表明其表面电势为+32. 6mV，粒径约为40. 47nm。实施例2称取聚乙烯亚胺6mg，溶解在IOmL水中制备聚乙烯亚胺溶液，然后边搅拌边滴加溶于200 μ L水的氯金酸溶液6mg/mL)，37°C条件下反应3天，得到聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的水溶液，随后将该水溶液置于4°C冰箱中冷藏备用。紫外-可见分光光度计的测试结果表明其最大吸收波长为5^nm。实施例3称取聚乙烯亚胺:3mg，溶解在IOmL水中制备聚乙烯亚胺溶液，然后边搅拌边滴加溶于100 μ L水的氯金酸溶液6mg/mL)，室温反应4天，得到聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的水溶液，随后将该水溶液置于4°C冰箱中冷藏备用。
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紫外-可见分光光度计的测试结果表明其最大吸收波长为5^nm。实施例4称取聚乙烯亚胺:3mg，溶解在IOmL水中制备聚乙烯亚胺溶液，然后边搅拌边滴加溶于100 μ L水的氯金酸溶液6mg/mL)，37°C条件下反应2天，得到聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的水溶液，随后将该水溶液置于4°C冰箱中冷藏备用。紫外-可见光分光光度计的测试结果表明其最大吸收波长为5^nm。实施例5肝素的定量测试，(1)取实施例1中制备的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒溶液100 μ L，加入ρΗ 3. 6 的醋酸盐缓冲溶液2. 9mL，室温放置15min后测试其紫外吸收曲线。(2)在ρΗ值为3. 6的醋酸盐缓冲溶液中加入肝素，得溶液A，取2. 9mL上述的溶液 A，加入到ΙΟΟμ L实施例1中制备的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，得到含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液；(3)在改变肝素的加入量的情况下，重复步骤0)，共得到23份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液；其中每份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度分别为 1,1. 5,2,2. 5,3,3. 5,4,4. 5,5,5. 5,6,6. 5,7,7. 5,8,8. 5,9,9. 5， 10，10. 5，11，11. 5，12μ g/mL ；(4)将步骤(3)得到的23份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液， 在室温下放置15min后，分别测试其紫外吸收曲线，如附图4。(5)根据步骤⑴和⑷中所得到的紫外吸收曲线，得出步骤⑶中所述的含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值的关系。同时对加入10 μ g/mL肝素后的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒进行透射电子显微镜测试，表明形成的金纳米颗粒有明显的团聚现象，且粒径显著变大，粒径大小为36nm。表面电势及粒径测试结果表明其表面电势为+5. 88mV，粒径约为432. 5nm。与没有加入肝素的金纳米颗粒相比其表面电势显著变小，粒径显著变大，由于水化作用大于透射电子显微镜的测试结果。同时粒径的结果也进一步证明了由于加入带有大量负电荷的肝素，可以使聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒的表面正电性变小，稳定性变差，从而引起了金纳米颗粒的聚集。实施例6肝素测定的选择性测试(1)取实施例1中制备的聚乙烯亚胺稳定的金纳米颗粒溶液ΙΟΟμ L，加入ρΗ为 3. 6的醋酸盐缓冲溶液2. 9mL测试其紫外吸收曲线。(2)在ρΗ值为3. 6的醋酸盐缓冲溶液中加入聚赖氨酸，得聚赖氨酸浓度为10 μ g/ mL的溶液B，取2. 9mL上述的溶液B，加入到100 μ L实施例1中制备的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，得到含有聚赖氨酸的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液；(3)按照步骤O)的方法，分别制得含有壳聚糖、葡萄糖、半胱氨酸、硫酸软骨素或氯化钠的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液；(4)将步骤( 和( 所得的溶液，在室温放置15min后，分别测试其紫外吸收曲线。 表明，所添加的非肝素类物质在相同的实验条件下，没有引起金纳米颗粒溶液颜色及紫外吸收光谱的变化，证明本发明制备的聚乙烯亚胺稳定的纳米金颗粒对肝素的检测具有良好的选择性。
权利要求
1.一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，包括(1)在100-200μ L聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，加入2. 9mL pH值为3. 6 的醋酸盐缓冲溶液，室温放置15min后测试其紫外吸收曲线；(2)在η份与步骤(1)中相同体积的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，分别加入2. 9mL含有不同浓度肝素的醋酸盐缓冲溶液，得到η份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液；其中每份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度为 0. 5-15 μ g/mL, 20 彡 η 彡 80 ；(3)将步骤( 得到的η份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液，在室温下放置15min后，分别测试其紫外吸收曲线；(4)根据步骤(1)和(3)中所得到的紫外吸收曲线，得出步骤(2)中所述的含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值的关系；(5)将90-330μ g的肝素样品溶解在^ml醋酸盐缓冲液中，加入Iml聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液，室温放置15min，测试其紫外吸收曲线；然后计算肝素样品的紫外吸收曲线中670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值，利用步骤中所述的肝素的浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值的关系确定肝素样品中肝素的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，其特征在于步骤(1)和O)中所述的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液的制备方法为称取聚乙烯亚胺3-6mg，溶解在IOmL水中，然后边搅拌边滴加100-200 μ L浓度为 48. 6mg/mL氯金酸溶液，反应2_6天，得到聚乙烯亚胺稳定化金纳米颗粒的水溶液。
3.根据权利要求2所述的一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，其特征在于所述的聚乙烯亚胺为超支化聚乙烯亚胺。
4.根据权利要求2所述的一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，其特征在于所述的氯金酸与聚乙烯亚胺的质量比为1.62 1。
5.根据权利要求2所述的一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，其特征在于所述的反应2-6天中的反应温度为25-37°C。
6.根据权利要求1所述的一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，其特征在于步骤(1)和O)中所述的醋酸盐缓冲溶液的浓度为0. 02-0. 08Mo
7.根据权利要求1所述的一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，其特征在于步骤(2)中所述的含有不同浓度肝素的醋酸盐缓冲溶液的制备方法为在 PH值为3.6的醋酸盐缓冲溶液中加入不同质量的肝素，即得。
8.根据权利要求1所述的一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，其特征在于步骤( 中所述的η份含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度分别为 1 μ g/mLU. 5 μ g/mL,2 μ g/mL,2. 5 μ g/mL,3 μ g/mL,3. 5 μ g/mL,4 μ g/ mL、4.5 μ g/mL、5 μ g/mL、5. 5 μ g/mL、6 μ g/mL、6. 5 μ g/mL、7 μ g/mL、7. 5 μ g/mL、8 μ g/mL、 8.5 μ g/mL、9 μ g/mL、9· 5 μ g/mL、10 μ g/mL、10. 5 μ g/mL、11 μ g/mL、11. 5 μ g/mL、12 μ g/mL, η = 23。
9.根据权利要求1所述的一种利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，其特征在于步骤中所述的步骤O)中所述的含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与处吸收值的比值的关系为当步骤O)中所述的含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度为3-8μ g/mL时，其浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与处吸收值的比值呈指数关系，其中 Y = O. 40614+1. 02292X IO"4Xe(x/L 02369), R2 = 0. 99058 ；当步骤(2) 中所述的含有肝素的聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中肝素的浓度为7-11 μ g/mL 时，其浓度和紫外吸收曲线中670nm处吸收值与529nm处吸收值的比值呈线性关系，其中Y =-0. 56446+0. 15069X, R = O. 99757 ；肝素浓度的最低检测限为 1. 5 μ g/mL。
全文摘要
本发明涉及利用聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子检测肝素含量的方法，包括(1)在聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中加入醋酸盐缓冲溶液，测试紫外吸收曲线；(2)在n份聚乙烯亚胺稳定化金纳米粒子的水溶液中，分别加入含有不同浓度肝素的醋酸盐缓冲溶液；(3)分别测试步骤(2)得到的n份溶液得紫外吸收曲线；(4)根据步骤(1)和(3)中所得到的紫外吸收曲线，得出肝素的浓度和紫外吸收曲线中670nm与529nm处吸收值的比值的关系；(5)测试肝素样品得紫外吸收曲线，得出肝素样品中肝素的浓度。本发明的检测方法简单，反应条件温和，低能耗无污染，同时所用金纳米颗粒的稳定剂为聚乙烯亚胺，价廉易得，应用前景广阔。
文档编号G01N21/33GK102435571SQ20111027639
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者史向阳, 温诗辉 申请人:东华大学