专利名称：同型半胱氨酸甲基转移酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞及制法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶，编码该酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，从前述重组宿主细胞中纯化该酶的方法，以及包括上述酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。更具体地，本发明涉及一种同型半胱氨酸甲基转移酶，编码该同型半胱氨酸甲基转移酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，从前述重组宿主细胞中纯化该酶的方法，以及包括上述同型半胱氨酸甲基转移酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。
背景技术：
甲基转移酶是生命活动中起关键调节作用的酶，它可以将S-腺苷甲硫氨酸(SAM) 上的甲基转移到底物分子上，生成多种重要的含甲基生理活性物质，达到功能调节的目的。 同型半胱氨酸甲基转移酶(EC 2. 1. 1. 10)是甲基转移酶中的一种，可以用于同型半胱氨酸 (HCY)生化诊断试剂的配制，是一种关键原料酶。现有的同型半胱氨酸甲基转移酶主要从酿酒酵母中提取，存在酶产率低，纯化困难、热稳定性差(保存温度超过40°C即完全失活)等缺点。
发明内容
本发明的一个目的是克服现有的同型半胱氨酸甲基转移酶耐热性差、产率低纯化困难的缺点，提供一种耐热性好、产率高且容易纯化的同型半胱氨酸甲基转移酶。本发明的第二个目的是提供编码所述同型半胱氨酸甲基转移酶的核苷酸序列。本发明的第三个目的是提供包括所述核苷酸序列的重组载体。本发明的第四个目的是提供包括所述重组载体的重组宿主细胞。本发明的第五个目的是提供包括上述同型半胱氨酸甲基转移酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。本发明的发明人付出了大量地创造性劳动，从白色念珠菌(Candida albicans SC5314)中得到本发明具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基转移酶， 并且利用随机突变的方法得到本发明具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基转移酶。并且本发明的发明人意外地发现，所得两种同型半胱氨酸甲基转移酶都具有很好的耐热性，能在宽的温度范围内保持较高的稳定性。本发明提供了一种同型半胱氨酸甲基转移酶，其中，所述同型半胱氨酸甲基转移酶的氨基酸序列为(I)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或者(2) SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列，或者(3)对(1)或( 所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其同型半胱氨酸甲基转移酶的功能不变的氨基酸序列。本发明还提供了编码本发明所述同型半胱氨酸甲基转移酶的核苷酸序列。本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。本发明还提供了从前述重组宿主细胞中纯化该酶的方法。本发明还提供了包括本发明所述的同型半胱氨酸甲基转移酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。本发明提供的同型半胱氨酸甲基转移酶具有耐热性好的优点。参见图3可知，本发明的两种同型半胱氨酸甲基转移酶在40°C下于pH6. 0的缓冲液中静置15分钟后仍都具有60%以上的相对活性，其中，本发明具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基转移酶在45°C下于pH6. 0的缓冲液中静置15分钟后仍都具有50%以上的相对活性。
图1实施例1的同型半胱氨酸甲基转移酶基因纯化的琼脂糖凝胶鉴定照片；图2实施例1的同型半胱氨酸甲基转移酶在IPTG诱导后表达与纯化的SDS-PAGE 鉴定照片，其中，M泳道为分子量标记，第1泳道为未受IPTG诱导的蛋白表达，第2泳道为 IPTG诱导后的蛋白表达，从中明显可以看出，在第2泳道中，目标蛋白质同型半胱氨酸甲基转移酶得到了大量表达；图3实施例1和2同型半胱氨酸甲基转移酶热稳定性图。
具体实施例方式本发明提供了一种同型半胱氨酸甲基转移酶，其中，所述同型半胱氨酸甲基转移酶的氨基酸序列为(I)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或者(2) SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，或者(3)对(1)或( 所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其同型半胱氨酸甲基转移酶的功能不变的氨基酸序列。本领域人员公知，组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类1、非极性的氨基酸丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、 甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸 (Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代lie，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala 禾口 Ser、Val 禾口 He、Asp 禾口 Glu、Ser 禾口 Thr、Ala 禾口 Gly、Ala 禾口 Thr、Ser 禾口 Asn、 Ala 禾口 Val、Ser 禾口 Gly、Tyr 禾口 Phe、Ala 禾口 Pro、Lys 禾口 Arg、Asp 禾口 Asn、Leu 禾口 lie、Leu 禾口 Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白的立体结构和功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在同型半胱氨酸甲基转移酶上的任意一个氨基酸残基位置上。相反，不同类别的氨基酸残基发生取代，或者氨基酸的取代不符合上述列举的取代规律，很可能会使蛋白的结构发生变化，功能出现差异。本发明提供的同型半胱氨酸甲基转移酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基转移酶存在氨基酸序列上的差异，或者有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术获得。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、Y-氨基酸等)的类似物。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的蛋白的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。优选情况下，所述同型半胱氨酸甲基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO :1或SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。本发明还提供了编码本发明所述同型半胱氨酸甲基转移酶的核苷酸序列。本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met (ATG)或Trp (TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆， 冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的同型半胱氨酸甲基转移酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约， 美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述同型半胱氨酸甲基转移酶活性一致的氨基酸序列。优选情况下，本发明所述核苷酸序列为(1) SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；或者(2) SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列；或者(3)对SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，该核苷酸序列编码的同型半胱氨酸甲基转移酶功能不变。本发明提供的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列和重组工程菌，可以很容易获得模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增， 然后将所得片段按正确次序拼接。一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。本领域公知，所述重组载体一般包括空载体和插入该空载体的目的基因，所述目的基因为本发明所述的同型半胱氨酸甲基转移酶的核苷酸序列。在本发明中，所述“空载体”(或称“载体”)可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选所述空载体为Iac启动子的载体， 更优选所述空载体选自由PET系列载体(例如pET30a)、pUC19、pGEM和pBluescript所组成的载体组中。所述空载体可以包括多种常用的检测标记(例如荧光标记、抗生素标记等报告基因)和酶切位点。重组载体构建可采用空载体本身多克隆位点的各种核酸内切酶 (如对于pET30a可用NcoI和B10I等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中， 如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化；所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母(如毕赤酵母)或各种动植物细胞，更优选所述宿主细胞为本领域常用的基因工程菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。进一步优选所述宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)、BL21、TOPlO或者Dffia。最优选所述宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。所述宿主细胞的培养基以及培养条件可以采用本领域常规的培养基和培养条件。并且大肠杆菌的培养基优选包括0. 03-0. 3%的磷酸二氢钾(或0.03-1. 5%磷酸二氢钠)、0. 1-1%的磷酸氢二钠(或磷酸氢二钾)、0. 05-0. 5%的氯化铵(或0.05-1%的氯化钠)、0. 01-0. 2%的硫酸镁、0. 5-5%的酵母粉(酵母提取物)、0. 1-1%的蛋白胨(例如胰蛋白胨)、0. 001-2%的葡萄糖、2. 5% -10%的甘油、0. 1% -0.8%的乳糖、0. 1-2%的油酸、0. 1-1 %的卵磷脂，并且调节pH至6. 8 7. 2。优选地，在培养所述宿主细胞为大肠杆菌 BL21(DE3)时，在初始培养基中接入5% 20%体积的0D600 = 2 4的LB种子，于37°C， 溶氧大于20%的条件下自然生长，使用氨水、硫酸调节pH6. 5 pH7. 3。当初始培养基中营养成分耗尽时(即溶氧DO值升至40%时)降温至32°C，按照60 100ml/L的比例加入补料液1开始诱导，并按照5 10ml/h/L的速率恒速补加补料液2，使用氨水调节pH。在诱导阶段，每隔3士 1小时降低1 士0. 1°C，降至后恒温至发酵结束。其中，本发明中用到的培养基配方依次如下种子培养基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。121°C灭菌20分钟，灭菌冷却后加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。
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发酵初始培养基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L，磷酸氢二钾6 12g/L、磷酸二氢钠3 6g/ L、一水柠檬酸0. 2 lg/L、硫酸镁0. 2 2g/L、微量元素母液1 10ml/L，调pH至6. 8 7.2，121°C灭菌20分钟。接种前加入灭菌的葡萄糖至终浓度15 20g/L，使用氨水调pH 至6. 5 7. 3。加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。在初始培养基中磷酸盐的比例为磷酸氢二钾磷酸二氢钠=2 1微量元素的配方为IOg FeSO4. 7H20, 2. 25g ZnSO4. 7H20, Ig CuSO4. 5H20, 0. 5gMnS04. 5H20, 0. 23g Na2B4O7. IOH2O, 2g CaCl2. 2H20，0. Ig (NH4) 6Mo7024，溶于 5M 盐酸中。补料液1 酵母提取物250 士 50g/L、胰蛋白胨 100 士 20g/L、乳糖 10 士 2g/L，121°C 灭菌 20min。补料液2 甘油400 士 50g/L，121°C灭菌 20min。可以使用本领域常用的方法从重组宿主细胞中分离和纯化同型半胱氨酸甲基转移酶。例如，离心分离培养基和重组宿主细胞，高压勻浆破碎细胞、离心过滤去除细胞碎片， 亲和层析纯化同型半胱氨酸甲基转移酶。对于分离纯化所得的同型半胱氨酸甲基转移酶的产物，可以使用本领域常用的方法进行纯度鉴定。例如，考马斯亮蓝法、凯氏定氮法、双缩脲法、Iowry法、紫外吸收法、亲和层析、酶活性、抗原抗体法、电泳分析(例如十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、沉降分析、扩散分析、恒溶度法、蛋白质谱等。在破碎细胞时一般都会生热，通常需要在破碎细胞的同时进行降温，破碎细胞过程完成后需要散热，然后才能进行下一步的纯化工作；由于本发明的同型半胱氨酸甲基转移酶耐热性好，破碎细胞过程无需降温过程，即便破碎细胞后破碎细胞液的温度能达到40-45°C，无需散热，仍然可以直接马上进行下一步的提纯步骤。例如向破碎后的细胞液加入氯化钙，离心(，除去大部分膜蛋白与核酸；向离心所得上清中再加入镍离子沉淀蛋白。所得沉淀的蛋白，可以采用以下配方复溶10 50mmol/L pH7. 0 8. 0磷酸盐缓冲液、2 20mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和5 lOmmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)。此外由于本发明的同型半胱氨酸甲基转移酶耐热性好，因此还可以采用将重组细胞破碎液在40-45°C加热15-40分钟，然后在 8000-15000rpm离心10-20min，来除去不耐热的杂蛋白。优选地，采用将重组细胞破碎液在 45°C加热30min，IOOOOrpm离心15min，来除去大部分不耐热的杂蛋白。更优选地，按照下列步骤纯化同型半胱氨酸甲基转移酶(1)发酵液调pH至7.0 8.0，600 900bar勻浆一次，使目标蛋白同型半胱氨酸甲基转移酶释放出来。(2)向勻浆液中加入30 IOOmM的氯化钙，充分搅拌混勻，5000g离心20分钟，去
除绝大部分核酸、细胞碎片，以及部分杂蛋白。(3)向离心上清中加入1 5mM镍离子(各种盐形式的镍离子)，混勻，室温下静置1小时，5000g离心20min，绝大部分目的蛋白在沉淀中。(4)向沉淀中加入原体积1/5 1倍体积的复溶缓冲液搅拌30分钟左右。IOOOOg 离心20分钟。复溶缓冲液配方为10 50mM pH7. 0 8. 0磷酸盐缓冲液(PB)，2 20mM NAD，5 IOmM EDTA。
(5)复溶上清经0. 45 μ m滤膜过滤后脱盐。脱盐缓冲液配方为10 50mMpH7. 0 8.0PB，2 5mM EDTA。本发明还提供了包括本发明所述的同型半胱氨酸甲基转移酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。优选情况下，本发明的试剂盒包括同型半胱氨酸甲基转移酶，而不包括核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞。更优选本发明的试剂盒包括同型半胱氨酸甲基转移酶的干粉，而不包括核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞。可以用本领域常用的方法制备同型半胱氨酸甲基转移酶的干粉，只要该方法能够得到同型半胱氨酸甲基转移酶的干粉，并且不破坏同型半胱氨酸甲基转移酶的干粉的活性即可。例如使用真空减压浓缩器得到浓缩的酶液，然后使用冷冻干燥机干燥浓缩的酶液；或者使用真空减压干燥器等设备。同型半胱氨酸甲基转移酶的干粉在使用时可以通过溶解于 PH5. 0-8. 0的缓冲液体系(例如醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选pH为5. 5-7. 0)中而转化为液体形式。本发明的试剂盒还可以包括本领域常用于测定血清同型半胱氨酸的试剂盒的成分。对应于本发明的试剂盒中的同型半胱氨酸甲基转移酶可以是液体形式或固体干粉形式，本发明的试剂盒中的其他成分也可以是液体形式和/或固体干粉形式。例如，当本发明的试剂盒为液体形式时，反应液中可以含有0.01-0. 5mol/L pH 8. OTris-Cl盐缓冲液、 1000-10000U/L的同型半胱氨酸甲基转移酶、100-10000U/L的腺苷同型半胱氨酸水解酶、 100-10000U/L的腺苷脱氨酶、l-100mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、l-20mmol/L的a_酮戊二酸、1000-100000U/L的谷氨酸脱氢酶、0. 2-2mmol/L的还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠(NADH)和l-20mmol/L的三(2-羧乙基)膦氯化氢(TCEP)。本发明的试剂盒优选含有0.01-0. 05mol/L pH 8.0 Tris-Cl盐缓冲液、1000-10000U/L的同型半胱氨酸甲基转移酶、100-1000U/L的腺苷同型半胱氨酸水解酶、1000-10000U/L的腺苷脱氨酶、l-15mmol/L 的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、1. 2-10mmol/L的a_酮戊二酸、1000-10000U/L的谷氨酸脱氢酶、 0. 3-1. 5mmol/L的还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠和1-lOmmol/L的三(2-羧乙基)膦氯化氢(TCEP)。本发明液体形式的试剂盒组分可以通过冷冻干燥技术，结合减压蒸馏技术、 反渗透技术及超滤技术等，制备成试剂干粉。所述干粉可以在检测待测标本前用选自去离子水、蒸馏水和双蒸水的溶剂复溶至所述试剂的原有体积。本发明的试剂盒可以包括记载有上述各种组分使用方法和用量的说明书。因此，所述溶液也可以由使用者在使用前按照试剂盒说明书的记载根据现有技术配制即可。适于使用本发明所述试剂盒的待测标本可以是动物体(包括人体)健康状态下以及病理状态下的血液自然凝固后析出的血清。下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。制备实施例1
cooes] A) ammm^mMm^j^m^mmmn (即获f导序歹！丨ι所示 射亥苷 序歹u)Α-1)白色念珠菌(Candida albicans SC5314)(购自 ATCC MYA-2876)的培养白色念珠菌培养的固体培养基为2%的葡萄糖、的蛋白胨、0.5%的酵母膏和 2%的琼脂，121°C20min灭菌(如无特殊说明，本文中“ ％ ”指重量百分比)。白色念珠菌培养的液体培养基为2%的葡萄糖、的蛋白胨和0.5%的酵母膏，121°C 20min灭菌。
白色念珠菌SC5314在以上所述固体平板上活化，活化过程即在30°C培养箱中培养36小时，然后将菌落接种到以上酵母液体培养基中；30°C条件下培养对小时。A-幻白色念珠菌基因组DNA的提取取步骤1)获得的培养物，在室温下IOOOOrpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于 400 μ 1 裂解缓冲液中(2% (v/v) Triton X-100,1 % (m/v) SDS, IOOmM NaCl, IOmM Tris-Cl (ρΗ8· 0)，ImM EDTA (ρΗ8· 0))，加入与细胞体积相等的酸洗玻璃珠，和400 μ 1酚/氯仿。冰浴，剧烈振动5X30s。IOOOOrpm离心lOmin，将上清转移到新的EP管中。加0. 6倍体积异丙醇或2倍体积乙醇，颠倒混勻，室温放置lOmin。IOOOOrpm离心lOmin，弃上清。加入500 μ 1 75%乙醇，涡旋，IOOOOrpm离心anin，弃上清。将沉淀在空气中干燥lOmin，加入 50 μ 1 TEdOmM Tris-Cl (ρΗ8· 0)，ImM EDTA (ρΗ8· 0))溶解。力口 1 μ 1 的 10mg/ml 的 RNase， 37°C下消化30min。得到基因组DNA。A-3)扩增同型半胱氨酸甲基转移酶基因本发明人设计的同型半胱氨酸甲基转移酶基因引物如下同型半胱氨酸甲基转移酶基因正向引物(SAMF) (SEQ ID NO 5)ATCGCCATGGGACGTGTTCAGGATATTTTAG ；附近有 NcoI 酶切位点。同型半胱氨酸甲基转移酶基因反向引物(SAMR) (SEQ ID NO 6)ATCGCTCGAGCTATTGGTTGATCAATTGTGCAAC ；附近有 XhoI 酶切位点。扩增条件为20mMTris-HCl (pH 8. 8) UOmM KClUOmM(NH4)2SO4,2mM MgS04、0. 1% Triton Χ_100、50μΜ dATP、50yM dGTP、50yM dTTP、50yM dCTP、400nM 引物 SAMF、400nM 引物SAMR、1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng基因组DNA加入反应体系，用无菌水调至反应体积达50 μ L。扩增反应程序为将上述反应体系在95°C下反应5分钟，然后进行30个循环的 "950C 30秒、55°C 30秒和72°C 2分钟”，最后在72°C下保持10分钟。将得到的PCR扩增基因产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分离，并用QIAGEN快速提取凝胶试剂盒回收936bp左右单一条带的DNA片段。B)重组载体的构建将步骤A)得到的同型半胱氨酸甲基转移酶基因经NcoI和B10I双酶切4h，与同样经NcoI和XhoI双酶切4h的pET30a载体，通过使用T4DNA连接酶连接二者，构建成同型半胱氨酸甲基转移酶重组表达载体。ο 重組in本对宿t细朐,mmnPiJkmnmm^mm,mmm挑取在LB固体培养基上37°C培养16小时的大肠杆菌BL21 (DE3)的单菌落，于液体LB培养基中在37°C、150rpm的摇床再培养16小时。取Iml所得液体培养物转接于100ml 新鲜液体LB培养基中，在37°C摇床上以250-300rpm的转速剧烈振荡培养2. 5小时。吸取 1. 5ml培养好的菌液至1. 5ml离心管中，在冰上冷却10分钟后，在4°C、3000g下离心5分钟。弃去上清，加入100 μ 1在冰上预冷的0. lmol/L的CaC12溶液，用移液枪轻轻上下吸动打勻，重悬细胞，在冰放置20分钟。然后在4°C、3000g下离心5分钟，弃去上清，加入100 μ 1 在冰上预冷的0. lmol/L的CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打勻，重悬细胞，得到感受态的宿主细胞。取200 μ 1上述感受态的大肠杆菌BL21(DE3)置于1. 5ml离心管中，加入体积为10μ 1的pET30a溶液(其中pET30a含量为40ng)轻轻摇勻，冰上放置30分钟。然后在 42°C水浴中热击90秒，接着迅速置于冰上冷却5分钟。向离心管中加入Iml LB液体培养基(不含卡那霉素)，混勻后37°C振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的卡那霉素抗生素抗性基因。将上述菌液摇勻后取100 μ 1涂布于含Kan的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养20小时。在筛选平板上出现了大肠杆菌的菌落，即pET30a已经转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中，得到了本实施例的重组宿主细胞——大肠杆菌BL21 (DE3)pET30a。P)重组宿主细胞的培养将上述步骤C)获得的带有编码同型半胱氨酸甲基转移酶的核苷酸序列的对应大肠杆菌BL21(DE3)克隆在LB培养基中37°C下培养至生长对数生长期(0D600 = 2)，接种于 3L初始培养基，即在初始培养基中接入10%体积的0D600 = 2的LB种子液，于37°C，溶氧大于20%的条件下自然生长，使用氨水、硫酸调节pH6. 5 pH7. 3。当初始培养基中营养成分耗尽时(即溶氧DO值上升至40%时)降温至32°C，按照60 100ml/L的比例加入补料液1开始诱导，并按照5 10ml/h/L的速率恒速补加补料液2，使用氨水调节pH。在诱导阶段，每隔3士 1小时降低1 士0. 1°C，降至后恒温至发酵结束(即发酵液中同型半胱氨酸甲基转移酶的酶活大于200KU/L，其中所述同型半胱氨酸甲基转移酶的酶活参照后附的同型半胱氨酸甲基转移酶的酶活测定方法来测定)。其中，本发明中用到的培养基配方依次如下种子培养基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。121°C灭菌20分钟，灭菌冷却后加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/L。发酵初始培养基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L，磷酸氢二钾8g/L、磷酸二氢钠4g/L、一水柠檬酸0. 5g/L、硫酸镁lg/L、微量元素母液5ml/L，调pH至7. 0，121°C灭菌20分钟。接种前加入灭菌的葡萄糖至终浓度18g/L，使用氨水调pH至7. 0。加入硫酸卡那霉素至终浓度50mg/ L0在初始培养基中磷酸盐的比例为磷酸氢二钾磷酸二氢钠=2 1微量元素的配方为IOg FeSO4. 7Η20、2· 25g ZnSO4. 7H20、Ig CuSO4. 5Η20、0· 5gMnS04. 5Η20、0· 23g Na2B4O7. IOH20,2g CaCl2. 2H20 和 0. Ig (NH4) 6Mo7024，溶于 5M 盐酸中。补料液1 酵母提取物250g/L、胰蛋白胨100g/L、乳糖10g/L，121°C灭菌20min。补料液2 甘油400g/L，121°C灭菌 20min。Ε)蛋白产物的分离提纯将步骤D)得到的发酵液调整pH至7. 0-8. 0，用SOObar高压勻浆机破碎重悬的细胞，先将破碎细胞液在45°C下加热30min，使目标蛋白释放出来。向勻浆液中加入50mM的氯化钙，充分搅拌混勻，5000g离心20分钟，去除绝大部分核酸、细胞碎片，以及部分杂蛋白。向离心上清中加入4mM镍离子(硫酸镍)，混勻，室温下静置1小时，5000g离心20min，绝大部分目的蛋白在沉淀中。向沉淀中加入原体积1倍体积的复溶缓冲液搅拌30分钟左右。IOOOOg离心20分钟。复溶液配方为40mM pH7. 5PB, IOmM NAD,8mM EDTA0复溶上清经 0. 45 μ m滤膜过滤。所得滤液再用葡聚糖凝胶G-25层析柱(S^hadex G-25)脱盐。所述脱盐缓冲液配方为40mM pH7.5的PB，4mM EDTA。再用脱盐缓冲液平衡好的层析柱上上样，其中样品溶液的流速为5ml/min，然后用脱盐缓冲液以15ml/min的流速洗脱2个柱体积。收集洗脱下的液体共500毫升。所收集的液体在普通冰箱中-10°C下冷冻2小时，然后再-40°C深冷冰箱预冻8小时，在德国科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA 1-4LSC型冷冻干燥机中，以真空度0. 04mbar、安全压力0. IOOmbar且冷阱温度_60°C的条件冻干25小时。然后等物料温度与冻干机隔板温度差为零，并且观察在15秒内压力指示不变时，结束冻干。冻干所得蛋白质的量为12克。冻干蛋白在冷冻条件下密封保存。取少量冻干样品，参照后附的同型半胱氨酸甲基转移酶的酶活测定方法测得酶活为100U/lmg。采用《蛋白质电泳试验技术》(郭尧君，132-145页，科学出版社，1999年)记载的 SDS-PAGE电泳的方法测定出本实施例的蛋白质的分子量为36KD，并且根据《生物化学》(王镜岩等，高等教育出版社，2002，见168页)记载的蛋白质一级结构的测定方法(分肽段测定)，测得本实施例的蛋白质有330个氨基酸残基(参见SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列)， 与由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列编码的蛋白质结果一致。照以下方法测丨定同型半胱射舌+牛:试剂一称量3g的TRIS用400ml的去离子水溶解，加上0. 1435g的ZnSO4. 7H20， 然后用盐酸调整PH至7. 5，此时为50mM Tris-HCl含有ImM锌离子，向此溶液中添加IOOmM KCl。反应试剂向试剂一的溶液中分别添加5mM同型半胱氨酸(HCY)和5mM S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(现配现用)。反应原理
权利要求
1.一种同型半胱氨酸甲基转移酶，其特征在于，所述同型半胱氨酸甲基转移酶的氨基酸序列为(1)SEQID NO :1所示的氨基酸序列，或者(2)SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列，或者(3)对(1)或( 所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代， 但其同型半胱氨酸甲基转移酶的功能不变的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸甲基转移酶，其中，所述同型半胱氨酸甲基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。
3.一种编码同型半胱氨酸甲基转移酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为编码权利要求1或2所述的同型半胱氨酸甲基转移酶的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为(1)SEQID NO :2所示的核苷酸序列；或者(2)SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列；或者(3)对SEQID NO :2或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，该核苷酸序列编码的同型半胱氨酸甲基转移酶功能不变。
5.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQID NO :2或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为权利要求3-5中任意一项所述的编码同型半胱氨酸甲基转移酶的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述空载体选自由pET系列载体、 pUC19、pGEM和pBluescript所组成的载体组中。
8.—种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞含有权利要求6或7所述的重组载体。
9.根据权利要求8所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌 BL21(DE3)、BL21、T0P10 或者 DH5a。
10.一种从权利要求8或9所述的重组宿主细胞中纯化同型半胱氨酸甲基转移酶的方法，其特征在于，所述方法采用将重组细胞的破碎液在40-45°C加热15-40分钟，然后在 8000-15000rpm离心10_20min，以除去不耐热的杂蛋白。
11.一种检测血清同型半胱氨酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下(a)-(d) 中的至少一种(a)权利要求1或2所述的同型半胱氨酸甲基转移酶；(b)权利要求4-6中任意一项所述的同型半胱氨酸甲基转移酶的核苷酸序列；(c)权利要求6或7所述的重组载体；(d)权利要求8或9所述的重组宿主细胞。
全文摘要
本发明公开了一种同型半胱氨酸甲基转移酶，其氨基酸序列为(1)SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，或者(2)SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，或者(3)对(1)或(2)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其同型半胱氨酸甲基转移酶的功能不变的氨基酸序列。本发明还公开了编码所述同型半胱氨酸甲基转移酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，从前述重组宿主细胞中纯化该酶的方法，以及包括上述同型半胱氨酸甲基转移酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。本发明的同型半胱氨酸甲基转移酶耐热性好、稳定性很高。
文档编号C12N1/21GK102391999SQ20111034364
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司