专利名称：一种检测鱼类致病菌的试剂盒和方法
技术领域：
本发明涉及一种检测鱼类致病菌的试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术：
鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)于1979年首次作为斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)养殖的一种新的致病菌被报道，近年从斑点叉尾鮰病鱼诊断分离得到的细菌85%是鮰爱德华氏菌。检测鮰爱德华氏菌的传统方法是细菌的常规分离鉴定，但所需时间长，程序繁琐，准确度较低。近年来，用PCR检测诊断的疾病的方法正在兴起。梁万文，“斑点叉尾鮰败血症PCR诊断方法的建立”，大连水产学院学报，2007年8月第22卷第4期公开了一种用PCR方法检测斑点叉尾鮰败血症的方法，但该方法的检测靶标是一种有待验证的基因 (Edwardsiella ictaluri putative protein, eip)，其是否为致病性基因也有待进一步探讨，不具有代表性，且该文献检测对象为广西研究所鱼病研究室从叉尾鮰上分离鉴定并保存的，不是标准菌株，不能说明该文献的方法能准确检测鮰爱德华氏菌。亟需寻找一种能准确检测鮰爱德华氏菌的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的试剂盒。本发明提供了一种检测鱼类致病菌的试剂盒，所述的试剂盒包含核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 2所示的引物，用以扩增鮰爱德华氏菌的基因。本发明还提供一种检测鱼类致病菌的方法，它包括如下步骤(1)提取待检样本的基因组DNA ；(2)以前述基因组DNA为模板，用SEQ ID NO. 1 2所示的引物扩增；(3)对扩增结果进行检测。所述步骤(1)中待检样本为鱼体或者养殖水体。所述鱼体为肌肉、肝脏、鳃或者脾脏。本发明最后提供了 SEQ ID NO. 1 2所示的核苷酸序列在扩增或者检测来自鮰爱德华氏菌的基因的用途。本发明提供的检测试剂盒和检测方法特异性强、灵敏度高，可以快速准确地判断鱼体或者水体是否被鮰爱德华氏菌污染，为斑点叉尾鮰的养殖提供保障。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1鮰爱德华氏菌常规PCR引物验证实验结果。1 :DNA ；2 单菌落；3 空白对照； M =DNA maker I，该maker有6条条带，从上至下分子量依次为600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp 和 IOObp。图2鮰爱德华氏菌PCR检测体系的特异性检测结果。1 空白对照；2:荧光假单胞菌；3 河水弧菌；4 嗜水气单胞菌；5 豚鼠气单胞菌；6 温和气单胞菌；7 柱状黄杆菌；8 鮰爱德华氏菌；M =DNA marker I。图3鮰爱德华氏菌PCR检测体系的灵敏度检测结果。1-8 梯度稀释的DNA模板， 浓度依次为 25ng/ μ L-2. 5fg/ μ L ；9 空白对照；M =DNA maker I。图4鮰爱德华氏菌PCR检测体系的灵敏度检测结果。1-8:梯度稀释的菌液，浓度依次为 0. 28X 108cfu/mL-0. 28X IO1CfuAiL ；9 空白对照；M =DNAmaker I。图5斑点叉尾鮰病原检测结果。M =DNA maker I ；1 肌肉组织；2 肌肉组织；3 肝组织；4 肌肉组织；5 肌肉组织；6 肌肉组织；7 肌肉组织；8 肌肉组织；9 肌肉组织；10 空白对照；11 鱼鳃；12 鱼鳃；13 脾；14 血液；15 阳性对照。
具体实施例方式实验材料实验菌株柱状黄杆菌、温和气单胞菌、河弧菌、荧光假单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌，均购自中国科学院水生生物研究所，鮰爱德华氏菌ATCC33202，购自ATCC。试齐[J:5U/yL Taq DNA polymerase (Promega，含 IOXreaction buffer 禾口 25mM Mg2+) UOmM dNTPs (Promega) > DNA marker I (Tiangen) ；Sterile Millipore H20(自 ； 细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen)。实施例1引物设计实验1、引物设计从GenBank上查找爱德华氏菌phosphoserine transaminase的保守基因序列， 根据这些序列设计引物。其中，根据鮰爱德华氏菌serC的编码基因序列(基因序列号为 AFl 10153. 1，为致病基因)，设计的一对引物为Ei IF(5-CATGATAATACCCGGTGTTGG-3)EilR(5-GTATTGCTGGGGAACAACTC-3)，如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示，其预期扩增片段的大小为124bp。引物由上海生工生物服务有限公司合成。2、引物验证(1)模板制备活化和制备鮰爱德华氏菌ATCC 33202的菌悬液，并提取基因组 DNA。DNA采用Tiangen的细菌基因组DNA提取试剂盒提取。(2)扩增用上述设计的引物对在Bio-Rad Mycycler梯度扩增仪上扩增；20 μ L的PCR反应体系(终浓度)
4反应缓冲液Ix
上游引物及下游引物0.3μΜ
Mg2+2mM
TaqDNA 聚合酶1.25U
dNTP0.2 mM 模板PCR程序为95°C预变性 ^iin ；94°C变性 15s，56°C退火 10s，72°C延伸 15s，38 个循环；72°C保温5min后在4°C条件下终止反应。(3)检测2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。3、结果实验结果如图1所示，泳道1和2扩增得到了预期的基因片段，而空白对照仅有模糊且分子量较小的条带，其为引物二聚体条带，无预期的基因片段，说明将本发明设计的引物用于扩增鮰爱德华氏菌基因组中的基因片段是有效的。实施例2PCR检测体系的特异性和灵敏度检测1、实验方法(1)模板制备以柱状黄杆菌、温和气单胞菌、河弧菌、荧光假单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌，鮰爱德华氏菌的基因组DNA为模板测定方法的特异性；用梯度稀释的鮰爱德华氏菌的菌液(浓度范围为0. 28X 108cfu/mL-0. 28 X lO^fu/mL)及梯度浓度的基因组 DNA (浓度范围从25ng/ μ L 2. 5fg/ μ L)为模板测定方法的灵敏度。DNA采用Tiangen提供的细菌基因组DNA提取试剂盒提取。(2)扩增用实施例1设计的引物对在Bio-Rad Mycycler梯度扩增仪上扩增；20 μ L的PCR反应体系(终浓度)
反应缓冲液Ix
上游引物及下游引物 0.3μΜ
Mg2+2mM
TaqDNA 聚合酶1.25U
dNTP0.2 mM
模板PCR程序为95°C预变性 ^iin ；94°C变性 15s，56°C退火 10s，72°C延伸 15s，38 个循环；72°C保温5min后在4°C条件下终止反应。(3)检测2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。2、实验结果特异性实验结果如图2所示，柱状黄杆菌、温和气单胞菌、河弧菌、荧光假单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌等几种常见的非靶标鱼类致病菌均无靶标扩增条带，仅有模糊且分子量较小的条带，其为引物二聚体条带，检测结果呈阴性，鮰爱德华氏菌有靶标扩增条带，检测结果呈阳性，说明本发明提供的引物具有良好的特异性。敏感性实验结果如图3 4所示，所建立的PCR体系对于鮰爱德华氏菌基因组DNA的检测下限为25pg/y L，即对于鮰爱德华氏菌菌液的检测下限为0. ^X 105cfu/mL，灵敏度极好。实验说明，根据鮰爱德华氏菌serC的编码基因序列设计的如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引物特异性和灵敏度均较好，可用于鮰爱德华氏菌的检测。实施例3试剂盒的组成及使用方法1、试剂盒的组成(1)、PCR反应液(10 μ L/次)缓冲液，核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示的引物，Mg2+，dNTPs ；(2)、Taq 酶(0. 25 μ L/ 次)；(3)、6%吐6161_100(0嫩提取液，20(^17次)；0)、灭菌超纯水。2、使用方法(1)提取待检样本的基因组DNA ；(2)以提取待检样本的基因组DNA为模板，用前述试剂盒进行扩增20 μ L的PCR反应体系(终浓度)
反应缓冲液Ix
上游引物及下游引物 0.3μΜ Mg2+2mM
Taq DNA polymerase 1.25U dNTP0.2mM
模板2汕PCR程序为95°C预变性 ^iin ；94°C变性 15s，56°C退火 10s，72°C延伸 15s，38 个循环；72°C保温5min后在4°C条件下终止反应。(3) 2 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。实施例4斑点叉尾鮰病鱼的检测1、提取患病鱼体组织的DNA从养殖鱼池现场采集患病的斑点叉尾鮰(Ietalurus Punetaus)病鱼样品，病鱼的头部、鳍的基部及尾部出现开口小溃荡，眼睛突出，鳃片鲜红，腹部肿胀，体腔内有淡黄色的液体，肝脏灰白。各取一小块组织块，分别加入200μ1 Millipore H2O,捣烂，取出残留的组织块，剩余浑浊液于12，000r/min离心lmin，弃上清，加入200μ 1 Millipore H2O重悬。充分混勻后取50 μ 1加入到200 μ 1 6%的chelex-100中，混勻，56°C保温20min，剧烈震荡后于100°C保温8min，剧烈震荡，并于12，000r/min离心3min，取上清作为PCR扩增的模板。2、检测以提取的样本基因组DNA作为模板，用实施例3提供的试剂盒和检测方法进行检测。
3、结果样品2和样品8为非溃疡肌肉组织，样品1、4_7和9均为溃疡肌肉组织，肝、腮、脾均出现病变。检测结果如图5所示，病鱼的溃疡处肌肉组织(样品1、4-7和9)、肝(样品 3)、鳃(样品11-12)、脾(样品13)检测结果与阳性对照(样品15)的结果一致，均检测出鮰爱德华氏菌，非溃疡肌肉组织(样品2和样品8)与空白对照(样品10)结果一致，均没有检测出鮰爱德华氏菌，这与临床症状及解剖检查结果相吻合。血液(样品14)中没有检测到鮰爱德华氏菌，可能与该病鱼的病变程度不高有关。上述实验表明鮰爱德华氏菌是斑点叉尾鮰的致病菌之一，且本发明提供的试剂盒可以准确检测出患病鱼体中的鮰爱德华氏菌。综上，实验证明本发明提供的试剂盒能快速准确地检测鮰爱德华氏菌，为有针对性治疗和有效预防鱼病提供了可靠的诊断结果，为供应安全的水产品提供了保证。
权利要求
1.一种检测鱼类致病菌的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 2所示的引物，用以扩增鮰爱德华氏菌的基因。
2.一种检测鱼类致病菌的方法，其特征在于包括如下步骤(1)提取待检样本的基因组DNA；(2)以步骤(1)中的基因组DNA为模板，用SEQID NO. 1 2所示的引物进行扩增；(3)对扩增结果进行检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中待检样本为鱼体或者养殖水体。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述鱼体为肌肉、肝脏、鳃或者脾脏。
5.SEQ ID NO. 1 2所示的核苷酸序列在扩增或者检测来自鮰爱德华氏菌的基因中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种检测鱼类致病菌的试剂盒，所述的试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物，用以扩增鮰爱德华氏菌的基因。还提供了一种鱼类致病菌的检测方法和SEQ ID NO.1～2所示的引物的用途。本发明提供的试剂盒可以快速准确地检测斑点叉尾鮰致病菌——鮰爱德华氏菌，从而实现有针对性地防治检测斑点叉尾鮰肠败血症，具有广阔的应用前景。
文档编号C12R1/01GK102382881SQ20111034382
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者刘天强, 刘衍鹏, 李茂 , 黄冠军 申请人:通威股份有限公司