专利名称：：一种检测稻瘟病菌致病蛋白的方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测稻瘟病菌致病蛋白的方法，属于植物保护领域。
背景技术：
：以稻瘟病菌(^fag"apoW/ze^7'^fl)为病原菌侵染水稻而引发的稻瘟病是世界范围内危害水稻生产最严重的病害之一。在稻瘟病菌对水稻致病性的研究中，通常用不同生理小种稻瘟病菌的孢子在不同品系水稻叶片接种并观察产生症状的方法来确定二者之间相互作用的结果是致病还是抗病。孢子在水稻叶片上接种后产生的病斑大小已经成为目前鉴定不同稻瘟病菌菌株致病力差异检测的主要手段。近年来的研究表明，病原菌产生的蛋白与寄主抗性基因蛋白产物的分子互作是病原菌与寄主互作机制的核心。与孢子接种的目的类似，这些蛋白的功能也要通过在寄主植物上接种后观察致病的症状来进行检测。目前对稻瘟病菌致病蛋白的研究还甚少，实验中稻瘟病菌致病蛋白主要来源于其菌丝体产生的蛋白或是稻瘟病菌致病相关基因的表达蛋白产物。对稻瘟病菌进行氮饥饿培养和重组表达稻瘟病菌致病基因是获得致病蛋白的主要方法。但其致病性检测方法并不完善，还未见到专门用于稻瘟病菌致病蛋白在水稻叶片上致病性检测方法的文献和专利报道。这导致了无法像孢子接种那样通过测量病斑长度来对稻瘟病菌产生的不同致病性蛋白进行致病力差异的定量分析，也难以准确地判定稻瘟病菌产生的不同致病蛋白致病力差异及其与不同水稻品系互作的结果，限制了对稻瘟病菌致病蛋白及其致病相关基因功能和致病机制的研
发明内容本发明克服了不能定量检测稻瘟病菌致病蛋白致病性大小的不足，提供了一种在水稻叶片上检测稻瘟病菌致病蛋白致病性的方法。本发明的技术方案为(1)水稻感病品种丽江新团黑谷生长至第4片叶完全展开时接种。(2)选择在接种水稻叶片的中部最宽处，用致伤设备形成直径1mm的压伤斑1个，将稻瘟病菌在完全培养基中培养后转入到不含有氮源的培养基中，进行氮饥饿培养而获得的致病蛋白或致病基因在大肠杆菌中表达后得到的蛋白在致伤处接种，蛋白的接种浓度为ll^ta接种体积为3ul。(3)接种后72小时在水稻叶片上形成的病斑为椭圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值。(4)将稻瘟病菌致病蛋白致病性大小按病斑长度值划分的标准进行致病性弱、中等和强的分类。其分类标准为病斑长度为1.5mm至2mm之间为弱致病性；病斑长度在2.1mm至3mm之间为中等致病性；病斑长度大于3.1mm为强致病性。本发明的有益效果是解决了稻瘟病菌蛋白致病性检测的方法问题，与其它方法比较，具有如下优点和积极效果本发明能够在水稻叶片上形成规则的接种点而对其组织没有明显的伤害，接种稻瘟病菌的致病蛋白后形成的病斑为椭圆性与孢子接种的症状一致，沿叶脉方向延伸的病斑长度即可作为不同致病蛋白致病力大小比较的依据。本发明提供的方法具有有效和简便地区分不同蛋白致病力大小的优点。具体实施方案通过对不同稻瘟病菌菌株的氮饥饿的培养及接种后的水稻抗性反应水平的比较研究，获得了具有不同致病性的稻瘟病菌致病蛋白；通过对接种后稻瘟病菌不同基因在水稻组织内的表达及相应水稻抗性反应水平的比较研究，获得了具有不同致病性的稻瘟病菌致病基因并将这些基因在大肠杆菌中表达获得其蛋白产物。以上两种蛋白即可作为检测的对象。实施例一水稻感病品种丽江新团黑谷生长至第4片叶完全展开时接种。选择在接种水稻叶片的中部最宽处，用致伤设备形成直径1mm的压伤斑1个，将在完全培养基中培养后转入到不含有氮源的培养基中，进行氮饥饿培养后得到弱致病力稻瘟病菌蛋白在致伤处接种，用去离子水接种作为对照。蛋白的接种浓度为1P《W，接种体积为3W。接种后72小时在水稻叶片上形成的病斑为椭圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值。按照病斑长度为1.5mm至2mm之间为弱致病性;病斑长度在2.1mm至3mm之间为中等致病性；病斑长度大于3.1mm为强致病性的分类标准，对该蛋白的致病性进行检测，结果见表l。实施例二水稻感病品种丽江新团黑谷生长至第4片叶完全展开时接种。选择在接种水稻叶片的中部最宽处，用致伤设备形成直径1mm的压伤斑1个，将在完全培养基中培养后转入到不含有氮源的培养基中，进行氮饥饿培养后得到的中等致病力稻瘟病菌蛋白在致伤处接种，用去离子水接种作为对照。蛋白的接种浓度为1u《yl，接种体积为3u1。接种后72小时在水稻叶片上形成的病斑为椭圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值。按照病斑长度为1.5mm至2mm之间为弱致病性；病斑长度在2.1mm至3mm之间为中等致病性；病斑长度大于3.1mm为强致病性的分类标准，对该蛋白的致病性进行检测，结果见表l。实施例三水稻感病品种丽江新团黑谷生长至第4片叶完全展开时接种。选择在接种水稻叶片的中部最宽处，用致伤设备形成直径1mm的压伤斑1个，将在完全培养基中培养后转入到不含有氮源的培养基中，进行氮饥饿培养后得到的强致病力稻瘟病菌蛋白在致伤处接种，用去离子水接种作为对照。蛋白的接种浓度为lug^1，接种体积为3ul。接种后72小时在水稻叶片上形成的病斑为椭圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值。按照病斑长度为1.5mm至2mm之间为弱致病性；病斑长度在2.1mm至3mm之间为中等致病性；病斑长度大于3.1mm为强致病性的分类标准，对该蛋白的致病性进行检测，结果见表l。表1稻瘟病菌氮饥饿培养后获得的致病蛋白在丽江新团黑谷接种后病<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例四水稻感病品种丽江新团黑谷生长至第4片叶完全展开时接种。选择在接种水稻叶片的中部最宽处，用致伤设备形成直径lmm的压伤斑l个，将弱致病力的稻瘟病菌致病相关基因7kfG(7—6>/"6>转化至大肠杆菌的表达蛋白在致伤处接种，用空白载体作为对照。蛋白的接种浓度为lt^ul，接种体积为3ul。接种后72小时在水稻叶片上形成的病斑为椭圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值。按照病斑长度为1.5mm至2mm之间为弱致病性；病斑长度在2.1mm至3mm之间为中等致病性；病斑长度大于3.1mm为强致病性的分类标准，对该蛋白的致病性进行检测，结果见表2。实施例五水稻感病品种丽江新团黑谷生长至第4片叶完全展开时接种。选择在接种水稻叶片的中部最宽处，用致伤设备形成直径lmm的压伤斑l个，将中等致病力的稻瘟病菌致病相关基因i^C^—M97转化至大肠杆菌的表达蛋白在致伤处接种，用空白载体作为对照。蛋白的接种浓度为l!^uL接种体积为3iU。接种后72小时在水稻叶片上形成的病斑为椭圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值。按照病斑长度为1.5mm至2mm之间为弱致病性；病斑长度在2.1mm至3mm之间为中等致病性；病斑长度大于3.1mm为强致病性的分类标准，对该蛋白的致病性进行检测，结果见表2。实施例六水稻感病品种丽江新团黑谷生长至第4片叶完全展开时接种。选择在接种水稻叶片的中部最宽处，用致伤设备形成直径1mm的压伤斑1个，将强致病力的稻瘟病菌致病相关基因74627转化至大肠杆菌的表达蛋白在致伤处接种，用空白载体作为对照。蛋白的接种浓度为ly《W，接种体积为3Ul。接种后72小时在水稻叶片上形成的病斑为椭圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值。按照病斑长度为1.5mm至2mm之间为弱致病性；病斑长度在2.1mm至3mm之间为中等致病性；病斑长度大于3.1mm为强致病性的分类标准，对该蛋白的致病性进行检测，结果见表2。表2稻瘟病菌致病相关基因在大肠杆菌的表达蛋白在丽江新团黑谷接种后病斑的长度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果表明不同致病力的稻瘟病菌的致病蛋白和致病相关基因的表达产物在感病品种丽江新团黑谷叶片上形成的病斑长度有明显差异，说明本发明提供的方法能有效地检测和区分稻瘟病菌不同的致病蛋白和致病相关基因表达产物的致病力差异。这对于研究稻瘟病菌致病蛋白和致病相关基因的功能及其与寄主水稻的互作有着重要的作用。权利要求1、一种检测稻瘟病菌致病蛋白的方法，其步骤为(1)水稻感病品种丽江新团黑谷生长至第4片叶完全展开时接种；(2)选择在接种水稻叶片的中部最宽处，用致伤设备形成直径1mm的压伤斑1个，将稻瘟病菌在完全培养基中培养后转入到不含有氮源的培养基中，进行氮饥饿培养而获得的致病蛋白或致病基因在大肠杆菌中表达后得到的蛋白在致伤处接种，蛋白的接种浓度为1μg/μl，接种体积为3μl；(3)接种后72小时在水稻叶片上形成的病斑为椭圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值；(4)将稻瘟病菌致病蛋白致病性大小按病斑长度值划分的标准进行致病性弱、中等和强的分类；其分类标准为病斑长度为1.5mm至2mm之间为弱致病性；病斑长度在2.1mm至3mm之间为中等致病性；病斑长度大于3.1mm为强致病性。全文摘要本发明提供一种检测稻瘟病菌致病蛋白的方法。水稻感病品种丽江新团黑谷生长至第4片叶完全展开时接种。选择在接种水稻叶片的中部最宽处，用致伤设备形成直径1mm的压伤斑1个，将稻瘟病菌氮饥饿培养后或致病基因重组表达后得到的蛋白在致伤处接种，蛋白的接种浓度为1μg/μl，接种体积为3μl。接种后72小时在水稻叶片上形成的病斑为椭圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值，该值是比较不同蛋白致病力大小的依据。其分类标准为病斑长度为1.5mm至2mm之间为弱致病性；病斑长度在2.1mm至3mm之间为中等致病性；病斑长度大于3.1mm为强致病性。该方法对于研究稻瘟病菌致病相关基因和蛋白的功能具有重要意义。文档编号C12Q1/02GK101418332SQ20081023364公开日2009年4月29日申请日期2008年11月25日优先权日2008年11月25日发明者林刘,孔垂思,明常,朱有勇,李成云,静杨,王云月,源苏,蔡永占申请人:云南农业大学