专利名称：：细菌检测和/或鉴定培养基的制作方法细菌检测和/或鉴定培养基本发明领域为生化微生物分析，具体为细菌的检测和鉴定。致病菌特别是革兰氏阴性菌例如肠细菌每年引起许多疾病、流行病等。大肠杆菌(^"/^"c/^②W是消化道最主要的需氧菌。但是，该细菌在水中的存在提示粪便污染，某些菌株为致病菌，可引起腹腔化脓、胆道化脓、阑尾化脓或生殖器化脓。大肠杆菌的早期特异检测可以在治疗方面提出去污等的适宜解决方法。这种检测可特别基于包含特定底物的检测培养基的使用，其中特定底物特异针对检测培养基需检测的细菌的代谢活性，称为靶代谢活性，例如酶活性根据是否存在反应，通过选择底物有可能鉴定微生物的性质。CPSID3(bioMerieux)培养基联合使用J3-葡糖醛酸糖苷酶底物和13-葡糖苷酶底物和任选地色氨酸酶检测，用于检测大肠杆菌的菌株。但是，尽管这种培养基具有出色的特异性，但由于存在少部分不表达这种活性的大肠杆菌菌株(5-10%)，使用13-葡糖醛酸糖苷酶底物检测大肠杆菌仍表现出不完全的灵敏性。而且，某些柠檬酸杆菌属菌株也可产生与大肠杆菌菌落颜色相同的B-葡糖醛酸糖苷酶阳性菌落。本发明通过提供一种特别适合鉴定大肠杆菌的新培养基，旨在解决现有技术难题。该鉴定快速廉价且易于实施。令人惊讶的是，发明人已表明特定组合的具有适宜浓度的酶底物能够快速简便地检测大肠杆菌，特别是使用尿样时。在公开本发明之前，给出下列定义以便于理解本发明。术语MMMIM是指包含微生物生存和/或生长必需的所有组分的培养基。这种检测培养基或可只用作检测培养基，或可用作培养基和检测培养基。在第一种情况下，接种前进行微生物的培养，而在第二种情况下，检测培养基也即是培养基。本发明的培养基可含有其他可能的添加剂，例如:蛋白胨或组织提取物、一种或多种生长因子、碳水化合物、一种或多种选择剂、缓冲液、一种或多种胶凝剂等。该培养基可为液体形式或即用型凝胶形式，可用于试管、培养瓶或培养皿接种。就本发明而言，检测可在液体培养基、条带或其它的固相载体上进行。术语M是指因微生物的酶活性或代谢活性可直接或间接产生可检测信号的任何分子。底物可特别为偶联于指示剂的代谢底物例如碳源或氮源，其中指示剂在其中一种代谢产物的存在下产生颜色。底物还可为酶底物，该底物可被酶水解，产生能够直接或间接检测微生物的产物。该底物可特别包含特异针对待揭示的酶活性的第一部分和作为标记的第二部分(以下称为标记部分)。该标记部分可显色、产生荧光、发光等。作为适用于固相载体(滤膜、琼脂、电泳凝胶)的显色底物，特别指基于吲哚酚及其衍生物的底物，以及基于羟基喹啉或七叶亭和它们的衍生物的底物，这些底物可检测糖苷酶(osidase)和酯酶活性。底物还可指基于硝基酚和硝基苯胺及衍生物的底物，基于硝基酚的底物用于检测糖苷酶和酯酶活性，基于硝基苯胺的底物用于检测肽酶活性。最后，底物还可指基于萘酚和萘胺和它们衍生物的底物，可通过萘酚检测糖苷酶和酯酶活性，可通过萘胺检测肽酶活性。该底物可特别(但不限制)检测酶活性例如糖苷酶、肽酶、酯酶等活性。酶底物还可为天然底物，其水解产物可被直接或间接检测。天然底物可特别指检测色氨酸酶或脱氨酶活性的色氨酸，检测脱氨酶活性的环状氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、酪氨酸)，检测磷酯酶活性的磷脂酰肌醇等。根据本发明，底物优选地选自基于吲哚酚(3-吲哚酚，5-溴-3』引哚酚，5_碘_3』引噪酷，4-氯-3』引哚酚，5-溴-4-氯-3』引哚酚，5-溴-6-氯-3』引噪酚，6画溴-3-卩引哚酚，6-氯-3』引哚酚，6-氟-3-卩引哚酚，5-溴-4-氯-N-甲基-3』引哚酚，N—甲基—3』引哚酚等)；伞形酮(4-甲基伞形酮，环己酮七叶亭等)；茜素；对萘酚苯甲醇；硝基酚(邻硝基酚，对硝基酚等)；羟基喹啉；儿茶酚(cathecol，二羟黄酮，羟黄酮等)；试卤灵；氯酚红；荧光素；氨基酚(对氨基酚，二氯氨基酚等)；萘酚(a-萘酚，2-萘酚，萘酚-ASBI等)；氨基香豆素(7-氨基-4-甲基香豆素等)；萘酰胺；吖啶(氨基苯吖啶等)；或氨基吩噁嗪(氨基苯并吩噁嗪酮，氨基戊基试卤灵)的底物。通过提示，用于检测P-葡糖醛酸糖苷酶活性的底物可特别为4-甲基伞形酮-P-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3』引哚基-(3-葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3』引哚基-卩-葡糖苷酸、6-氯-3-吲哚基-(3-葡糖苷酸、茜素-卩-葡糖苷酸或环己酮七叶苷-卩-葡糖苷酸或它们的盐。用于检测P-半乳糖苷酶活性的底物可特别为4-甲基伞形酮-P-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3』引哚基-(3-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-卩引哚基-|3-半乳糖苷、6-氯-3』引哚基+半乳糖苷、茜素屮-半乳糖苷或环己酮七叶苷+半乳糖苷或它们的盐。用于检测(3-葡糖苷酶活性的底物可特别为4-甲基伞形酮-|3-葡糖苷、5-溴-4-氯-3-卩引哚基-P-葡糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-|3-葡糖苷、6-氯-3』引哚基-卩-葡糖苷、茜素-卩-葡糖苷或环己酮七叶苷-卩-葡糖苷、硝基酚-卩-葡糖苷或二氯氨基苯葡糖苷或它们的盐。术语M^H是指诱导靶代谢活性增加的化合物；在其他所有实验条件相同时，诱导物处于适宜浓度时的代谢活性比诱导物不存在或处于非适宜浓度时要高。不作限制地，100ng/1-10g/1的浓度，优选10mg/l-3g/1的浓度特别适合本发明。诱导物特别指*对于卩-葡糖醛酸糖苷酶，葡糖苷酸优选地选自葡糖醛酸和甲基-卩-葡糖苷酸；*对于P-半乳糖苷酶，半乳糖苷优选地选自乳糖和异丙基-P-硫代半乳糖苷；*对于(3-葡糖苷酶，碳水化合物的P-位连接葡萄糖的碳水化合物，或具有(3-葡糖苷亚单位的碳水化合物，特别是纤维二糖、纤维素、淀粉、纤维三糖或海藻糖。诱导物还可指甲基-B-葡糖苷、异丙基-13-硫代葡糖苷、吲哚基-B-葡糖苷或甲基-B-硫代葡糖苷。术语fflMM是指引起靶代谢活性降低的化合物；在其他所有实验条件相同时，抑制剂处于适宜浓度时的代谢活性比抑制剂不存在或处于非适宜浓度时要低。不作限制地，100ng/1-30g/1之间的浓度，优选1mg/l-3g/1的浓度特别适合本发明。抑制剂特别指.对于B-葡糖醛酸糖苷酶D-葡萄糖、D-葡糖二酸l,4-内酯*对于13-半乳糖苷酶2-脱氧半乳糖、纤维二糖、D-半乳糖、D-葡萄糖。5术语^MI^是指源自生物体液样品的临床样品，或源自任何类型食物的食物样品，或环境样品，例如表面样品、水样品、空气样品等。因此该样品可为液体或固体，可指(非限制)来自血液、血浆、尿液或粪便的临床样品；取自鼻、喉、皮肤、伤口或脑脊液的样品；来自水或来自饮料例如牛奶或果汁或来自酸奶、肉类、蛋、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼等的食物样品，或源自动物饲料例如特别是源自动物肉类的样品。在这方面，本发明涉及一种检测和/或鉴定生物样品(优选为尿样)中的大肠杆菌的方法，其包括-a)将可能含有大肠杆菌的样品(优选为尿样)接种到检测培养基上用于获得细菌菌落，该检测培养基包含第一底物，其选自卩-葡糖醛酸糖苷酶底物、P-半乳糖苷酶底物和a-半乳糖苷酶底物，以及用于乳糖酸化酶、P-核糖苷酶(P-ribosidase)、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物，以及不同于所述第一底物的第二底物，其选自P-葡糖醛酸糖苷酶底物、P-半乳糖苷酶底物和a-半乳糖苷酶底物，以及用于乳糖酸化酶、(3-核糖苷酶、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物；b)鉴定与第一底物和/或第二底物反应的菌落为大肠杆菌的菌落。优选情况下，所述第一底物和第二底物处于适宜的浓度。可通过本领域技术人员知晓的任何接种技术进行微生物的接种。可在最适于需检测的酶活性的温度下进行接种步骤，其中本领域技术人员根据待检测的酶活性可以容易地选择所述温度。可通过目视检查、比色法或荧光法进行检测/鉴定。根据本发明的一个优选实施方式，所述第一底物的浓度是20-1000mg/1，所述第二底物的浓度是20mg/l-30g/1。根据本发明的一个优选实施方式，所述第一底物是13-葡糖醛酸糖苷酶底物，第二底物是P-半乳糖苷酶底物。优选情况下，用于P-葡糖醛酸糖苷酶活性的底物选自浓度优选为20-1000mg/1的4-甲基伞形酮-(3-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3』引哚基-P-葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3-吲哚基-p-葡糖苷酸、6-氯-3-卩引哚基-P-葡糖苷酸、茜素+葡糖苷酸或环己酮七叶苷-|3-葡糖苷酸或它们的盐。优选情况下，p-半乳糖苷酶底物的浓度低。优选情况下，用于(3-半乳糖苷酶活性的底物选自浓度优选为10-1000mg/l，优选为20-500mg/1的4画甲基伞形酮-|3-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-(3-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3』引噪基-P-半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-卩-半乳糖苷、茜素-卩-半乳糖苷或环己酮七叶苷-P-半乳糖苷或它们的盐。根据本发明的一个优选实施方式，检测培养基还包含第三底物，优选地选自P-葡糖苷酶、(3-乳糖苷酶、N-乙酰氨基己糖苷酶、酯酶、硫酸酯酶、(3-木糖苷酶、磷脂酶、a-甘露糖苷酶、卩-甘露糖苷酶、P-纤维二糖苷酶、a-葡糖苷酶、色氨酸酶、脱氨酶、氧化酶、色素合成、肽酶(卩-丙氨酸氨肽酶，弹性蛋白酶等)的底物。优选情况下，所述第三底物是卩-葡糖苷酶的底物。优选情况下，用于卩-葡糖苷酶活性的底物选自浓度优选为10-1000mg/1，优选为20-500mg/1的4-甲基伞形酮-卩-葡糖苷、5-溴-4-氯-3』引哚基-P-葡糖苷、5-溴-6-氯-3』引哚基-P-葡糖苷、6-氯-3-吲哚基-卩-葡糖苷、环己酮七叶苷-卩-葡糖苷、硝基苯-卩-葡糖苷或二氯氨基苯葡糖苷或它们的盐。根据本发明的一个优选实施方式，检测培养基还包含诱导物。优选情况下，诱导物的浓度为100ng/l-10g/l。根据本发明的一个优选实施方式，诱导物优选为，对于P-葡糖醛酸糖苷酶，葡糖苷酸优选地选自葡糖醛酸和甲基-(3-葡糖苷酸；*对于卩-半乳糖苷酶，半乳糖苷优选地选自乳糖和异丙基-卩-硫代半乳糖苷；*对于卩-葡糖苷酶，碳水化合物的卩-位连接葡萄糖的碳水化合物，或具有P-葡糖苷亚单位的碳水化合物，特别是纤维二糖、纤维素、淀粉、纤维三糖或海藻糖。诱导物还可指甲基-B-葡糖苷、异丙基-B-硫代葡糖苷、吲哚基-13-葡糖苷或甲基-B-硫代葡糖苷。优选情况下，诱导物是纤维二糖，其浓度优选为100ng/l-10g/l。根据本发明的一个优选实施方式，检测培养基还包含抑制剂。优选情况下，抑制剂的浓度为100ng/l-30g/l。根据本发明的一个优选实施方式，抑制剂优选为对于fi-葡糖醛酸糖苷酶D-葡萄糖、D-葡糖二酸l,4-内酯对于B-半乳糖苷酶2-脱氧半乳糖、纤维二糖、D-半乳糖、D-葡萄糖。下文给出的实施例用于解释，绝非用于限制。它们使得更清楚地理解本发明成为可能。实施例1:6-氯-3-吲哚基-!3-葡糖苷酸和5-溴-6-氯-3-吲哚基-B-半乳糖苷组合的评价向CPSID3培养基(bioM6rieux)加入各种浓度的6-氯-3』引哚基-|3-葡糖苷酸(0-0.1-0.15和0.20g/l)和5-溴-6-氯-3-卩引哚基-(3-半乳糖苷(0-0.025-0.05和0.1g/1)，加以混合，其中该培养基已除去13-葡糖醛酸糖苷酶的合成酶底物。这些培养基还包含50mg/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-葡糖苷。它们按每培养皿20ml的比例进行分配。平行测试用于检测和计数食物样品中大肠杆菌和大肠菌且同时含有B-葡糖醛酸糖苷酶底物(6-氯-3-吲哚基-B-葡糖苷酸)和13-半乳糖苷酶底物(5-溴-3-吲哚基-fi-半乳糖苷)的ColiID培养基(bioM6rieux)。通常从尿样分离且源自申请人收藏菌株的微生物通过10^0.5McFarland的混悬液的半定量分离被接种到这些培养基上，稀释至1/20。培养皿在37°C下温育20小时，随后目视检査形成的菌落。记录这些菌落的颜色。下表l给出了结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2:纤维二糖对含有6-氯-3』引哚基-fi-葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3』引哚基-fi-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-fi-葡糖苷组合的培养基的影响分别向胰胨豆胨琼月旨培养基(TrypticaseSoyaAgarMedium,bioM6rieux)加入0.15g/l、0.08g/1和0.08g/1的6-氯-3-卩引哚基各葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3-吲哚基-B-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3』引哚基-fi-葡糖苷。该培养基添加或未添加0.5g/l的纤维二糖。这两种培养基按每培养皿20ml的比例进行分配。通常从尿样分离且源自申请人收藏菌株的微生物通过IO^tl0.5McFarland的混悬液的半定量分离被接种到这些培养基上，稀释至1/20。培养皿在37。C下温育24小时，随后目视检査形成的菌落。记录这些菌落的显色。下表2给出了结果。纤维二糖的浓度(mg/1)菌株0500大肠杆菌407粉红粉红大肠杆菌067粉红粉红肺炎克雷伯杆菌111青绿青绿粘质塞氏杆菌(Se/ra"a脂rcescms)112青绿青绿弗氏拧檬酸杆菌031灰灰弗氏柠檬酸杆菌009粉红蓝紫无乳链球菌(&reptococctwaga/ac"ae)019紫红紫红粪肠球菌117青绿青绿表2:纤维二糖对含6-氯-3』引哚基-B-葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3』引哚基-B-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-H引哚基-B-葡糖苷的培养基在菌落显色方面的影响上表2中，混合有6-氯-3-吲哚基各葡糖苷酸和5-溴-6-氯-3』引哚基各半乳糖苷的培养基中，纤维二糖可更清楚地将弗氏柠檬酸杆菌009菌株与大肠杆菌菌株区分开。这可以增加大肠杆菌检测的灵敏性，而又不破坏检测的特异性。实施例3确定本发明的所述第一底物和第二底物浓度的测试可进行下面的测试以确定本发明的所述第一底物和第二底物的浓度，浓度随使用的底物而变化，更普遍地随反应培养基的配方而变化。为了辅助理解该测试，在下文的13-葡糖醛酸糖苷酶和13-半乳糖苷酶组合的情况下，采用微生物菌株组合(kit)进行该测试，其中特别包含大肠杆菌菌株并包括不表达阳性活性或表达阳性活性较弱或较迟的菌株，以及任选地其他微生物。该测试可用于其它类型的底物。使用包含适宜浓度的J3-葡糖醛酸糖苷酶底物或非13-葡糖醛酸糖苷酶底物的两种反应培养基，制备J3-半乳糖苷酶底物范围，其中包括零浓度，得到与表达13-半乳糖苷酶的大肠杆菌菌株的阳性反应的至少一种浓度，以及中间浓度。等分每种培养基，使得每种微生物菌株可以纯培养形式接种到每种培养基上。在优选为20-50°C的适宜温度下经过一段适宜的温育时间(一般为30分钟到72小时)后，检査培养基，选择包含fi-半乳糖苷酶和J3-葡糖醛酸糖苷酶底物组合的培养基，该培养基可揭示最大数目的大肠杆菌菌株，同时可将它们同最大数目的其他微生物菌株区分开。可能有必要通过调节每种底物浓度和菌株组合来重复实验。反应培养基还可优选包含B-半乳糖苷酶和/或fi-葡糖醛酸糖苷酶的诱导物和/或抑制剂。权利要求1.一种检测和/或鉴定尿样中大肠杆菌(E.coli)的方法，其包括a)将可能含有大肠杆菌的尿样接种到检测培养基上用于获得细菌菌落，该检测培养基包含·第一底物，其选自β-葡糖醛酸糖苷酶底物、β-半乳糖苷酶底物和α-半乳糖苷酶底物以及用于乳糖酸化酶、β-核糖苷酶、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物，以及·不同于所述第一底物的第二底物，其选自β-葡糖醛酸糖苷酶底物、β-半乳糖苷酶底物和α-半乳糖苷酶底物以及用于乳糖酸化酶、β-核糖苷酶、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物；b)鉴定与第一底物和/或第二底物反应的菌落为大肠杆菌的菌落。2.如权利要求1所述的方法，根据该方法，所述第一底物是(3-葡糖醛酸糖苷酶底物，所述第二底物是卩-半乳糖苷酶底物。3.如权利要求2所述的方法，根据该方法，所述第一底物的浓度是20-1000mg/1，所述第二底物的浓度是10mg/1-30g/1。4.如权利要求1-3任一项所述的方法，根据该方法，所述检测培养基还包含第三底物，其选自(3-葡糖苷酶、P-乳糖苷酶、N-乙酰氨基己糖苷酶、酯酶、硫酸酯酶、P-木糖苷酶、磷脂酶、a-甘露糖苷酶、卩-甘露糖苷酶、P-纤维二糖苷酶、a-葡糖苷酶、色氨酸酶、脱氨酶、氧化酶、色素合成、肽酶((3-丙氨酸氨肽酶、弹性蛋白酶等)的底物。5.如权利要求4所述的方法，根据该方法，所述第三底物是(3-葡糖苷酶底物。6.如权利要求1-5任一项所述的方法，根据该方法，所述检测培养基还包含诱导物，优选为纤维二糖。7.如权利要求1-6任一项所述的方法，根据该方法，所述检测培养基还包含抑制剂。全文摘要本发明涉及一种检测和/或鉴定尿样中大肠杆菌的方法，其包括a)将可能含有大肠杆菌的尿样接种到检测培养基上用于获得细菌菌落，该检测培养基包含选自β-葡糖醛酸糖苷酶底物、β-半乳糖苷酶底物和α-半乳糖苷酶底物，和用于乳糖酸化酶、β-核糖苷酶、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物的第一底物，以及不同于所述第一底物的第二底物，其选自β-葡糖醛酸糖苷酶底物、β-半乳糖苷酶底物和α-半乳糖苷酶底物，以及用于乳糖酸化酶、β-核糖苷酶、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物；和b)鉴定与第一底物和/或第二底物反应的菌落为大肠杆菌的菌落。文档编号C12Q1/04GK101631873SQ200880004152公开日2010年1月20日申请日期2008年2月7日优先权日2007年2月8日发明者C·罗歇-达尔贝托,D·蒙热,M·佩雷,S·欧伦加申请人:生物梅里埃公司