鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重rt-pcr试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的二重RT-PCR试剂盒及其应用。该试剂盒中含有用于鉴定或辅助鉴定NDV和APV的引物对组：引物对1（序列1和序列2）和引物对2（序列3和序列4）。实验证明，本发明仅需一次PCR就能同时检测和鉴别NDV和APV两种病原体，具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点；且本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同可直接判定扩增结果，更简便、直观和实用。本发明最低能同时检出10pg?NDV?RNA和10pg?APV?RNA，其敏感性为由这两种病毒引起的早期发病提供了快速准确的诊断结果，对预防和控制这两种病具有重要意义，对养鸡业可持续健康发展有重要的现实意义。
【专利说明】鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的二重RT-PCR试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(Avian pneumovirus，APV)是危害养鸡业的两种主要病毒。禽肺炎病毒主要引起上呼吸道的症状，以喷嚏，眼结膜潮红，泪腺肿，头部出现皮下水肿，俗称肿头；产蛋鸡感染主要引起产蛋下降2%-40%，孵化率降低；随着病情的发展，还表现出神经症状。而新城疫病毒感染的鸡也会引起上呼吸道的症状，以咳嗽、呼吸啰音为主，严重时可引起大批死亡。两种病毒引起的呼吸道症状，在临床上有时很难区分，容易混淆。
[0003]PCR技术由于具有敏感性高、特异性好、快速简便等特点，已经走进临床诊断实验室并广泛应用于各种禽病病原体的检测，包括用于NDV和APV的检测。二重PCR是一种特殊的PCR形式，其突出特点是，一次PCR反应，能同时检测并鉴别出两种病原体，在临床上具有很高的应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的引物对组。
[0005]本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的引物对组，由两个引物对组成，一个引物对是由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成的用于鉴定或辅助鉴定所述鸡新城`疫病毒的引物对1，另一个引物对是由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的用于鉴定或辅助鉴定所述禽肺炎病毒的引物对2。
[0006]其中，序列I由19个核苷酸组成；序列2由19个核苷酸组成；序列3由20个核苷酸组成；序列4由23个核苷酸组成。
[0007]所述引物对组中的所述引物对I和所述引物对2在PCR反应体系中的摩尔比为1:1 ;所述引物对I和所述引物对2中各引物对的两条引物均等摩尔。
[0008]本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的试剂。
[0009]本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的试剂，由所述引物对组和RT-PCR扩增缓冲液组成。
[0010]所述RT-PCR扩增缓冲液中含有dNTPs、Mg2+、反转录随机引物(如大连宝生物工程有限公司产品，产品目录号:D3802)、反转录酶(如AMV反转录酶)、RNA酶抑制剂(如大连宝生物工程有限公司产品，产品目录号:D2313A)和DNA聚合酶(如Ex Taq HS)。
[0011 ] 所述RT-PCR扩增缓冲液，具体由反转录缓冲液和PCR缓冲液组成。
[0012]其中，所述反转录缓冲液中含有所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录随机引物、所述反转录酶和所述RNA酶抑制剂；所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录随机引物、所述反转录酶和所述RNA酶抑制剂的配比为20nmoI =IOOnmol:25ymol:2.5U:20U。更加具体的，所述反转录缓冲液由IOmM dNTPs Mix (四种碱基，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:D4030RA),5XRT buffer (含25mM Mg2+，AMV反转录酶中包含有该buffer，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:D2620)，反转录随机引物(50 μ mol/μ L，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:D3802)，AMV反转录酶(5U/yL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:D2620), RNA酶抑制剂(40U/μ L，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:D2313A)，按照体积比为2:4:0.5:0.5:0.5的比例混合后所得溶液。当然，使用其他公司的类似产品也可以。
[0013]所述PCR缓冲液中含有所述dNTPs、所述Mg2+和所述DNA聚合酶；所述dNTPs、所述Mg2+和所述DNA聚合酶的配比为IOnmol:25nmol:5U。更加具体的，所述的PCR缓冲液，为Premix Ex Taq Hot Start Version (2X )(内含 IOmM dNTP Mixture, 25mM Mg2+, 5U/μ LTakara Ex Taq HS，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:R028A)。当然，使用其他公司的类似产品也可以。
[0014]本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的试剂盒。
[0015]本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的试剂盒，具体可含有下述a)和b):
[0016]a)作为阳性对照的鸡新城疫病毒cDNA和禽肺炎病毒cDNA ；
[0017]b)所述引 物对组，或所述试剂。
[0018]所述试剂盒中还可以包括作为阴性对照的无RNA酶的水。
[0019]本发明的第四个目的是提供所述引物对组的制备方法。
[0020]本发明所提供的所述制备方法，包括将所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
[0021]本发明的第五个目的是提供如下c)或d)的应用:
[0022]c)所述引物对组在制备所述试剂，或所述试剂盒中的应用；
[0023]d)所述引物对组、或所述试剂，或所述试剂盒，在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有鸡新城疫病毒和/或禽肺炎病毒的产品中的应用。
[0024]在d)所述应用中，所述检测或辅助检测待测样品中是否含有鸡新城疫病毒和/或禽肺炎病毒为:用所述引物对组，或所述试剂，或所述试剂盒对所述待测样品进行RT-PCR反应，根据PCR产物的大小确定所述待测样品中是否含有鸡新城疫病毒和/或禽肺炎病毒。
[0025]所述进行RT-PCR反应的退火温度可为50°C -60°C，最佳退火温度为55°C。
[0026]进一步，进行所述RT-PCR反应的程序具体可为:首先进行反转录:42°C 60min ；95 V 5min, 4 °C 结束反应；然后进行 PCR 扩增:95 V 变性 5min ；95 V Imin, 55 V Imin,720C lmin，共进行35个循环；最后72°C延伸lOmin，于8°C结束反应。
[0027]在d)所述应用中，所述检测或辅助检测待测样品中是否含有鸡新城疫病毒和/或禽肺炎病毒时，所述引物对组中的六条引物在反应体系中的终浓度均可为0.5 μ mol/μ L。
[0028]在本发明中，进行所述的RT-PCR反应的体系，具体为如下反转录体系和PCR扩增体系:[0029]反转录体系(20yL):AMV反转录酶(5U/yL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:D2620) 0.5yL;RNA酶抑制剂(40U/yL，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:D2313A) 0.5μ L ;随机引物(50μΜ/μ L，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:D3802)
0.5μ L5IOmM dNTPs Mix (四种碱基，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:D4030RA)2μ L ；5XRT buffer (含25mM Mg2+，AMV反转录酶中包含有该buffer，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:D2620) 4μ L ;模板(RNA) 2μ L (约20yg) ;DEPC水补足20 μ L。
[0030]PCR 扩增体系(25 μ L):Premix Ex Taq Hot Start Version (2X )(内含 IOmMdNTP Mixture, 25mM Mg2+, 5U/ μ L Takara Ex Taq HS，大连宝生物工程有限公司，产品目录号:R028A) 12.5 μ L ;模板(反转录所得的cDNA或DNA)2 μ L (约20 μ g);所述引物对组中的四条引物在反应体系中的终浓度均为0.5 μ mol/μ L ;超纯水补足25 μ L0
[0031]在d)所述应用中，所述根据PCR产物的大小确定所述待测样品中是否含有鸡新城疫病毒和/或禽肺炎病毒，具体如下:若所述PCR产物中含有大小为247bp (序列表中序列5的第891-1137位)的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有鸡新城疫病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有鸡新城疫病毒；若所述PCR产物中含有大小为424bp(序列表中序列6的第753-1176位)的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有禽肺炎病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有禽肺炎病毒。
[0032]在d)所述应用中，所述待测样品可来自健康的动物或死亡的动物，可为RNA和/或 DNA。
[0033]本发明的第六个目的是提供用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒的引物对。
[0034]本发明所提 供的用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒的引物对是由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对I。
[0035]所述引物对I中各引物对的两条引物均等摩尔。
[0036]本发明的第七个目的是提供如下应用:
[0037]所述引物对I在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有鸡新城疫病毒的产品中的应用。
[0038]在所述应用中，所述待测样品可来自健康的动物或死亡的动物，可为RNA和/或DNA。
[0039]在本发明中，以上所有的所述鸡新城疫病毒均具体可为鸡新城疫病毒Lasota株、鸡新城疫病毒F48E9株、鸡新城疫病毒分离株GX7/02、鸡新城疫病毒分离株GX9/03或鸡新城疫病毒分离株GX10/03 ；以上所有的所述禽肺炎病毒均具体可为禽肺炎病毒APV/MN株。
[0040]本发明具有如下优点:
[0041]针对目前缺乏同时对鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒进行区分鉴别检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了两对特异性引物，据此建立了鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的的二重RT-PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本发明所提供的试剂盒仅需一次PCR反应就能同时检测和鉴别鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒两种病原体，具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点；而且本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同可直接判定扩增结果，更简便、直观和实用。本发明的待测样品可来自健康动物或死亡动物，可为RNA和/或DNA，最低能同时检出IOpg鸡新城疫病毒RNA、IOpg禽肺炎病毒RNA，这为由这两种病毒引起鸡的疾病(尤其是发病早期)提供了准确的诊断结果，对切断其传播途径有重要意义，具有广阔的应用前景，对养鸡业可持续发展有着重要的现实意义。【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1为二重RT-PCR的灵敏度试验结果电泳图。图中:M为分子量标准IOObp DNAladder ；1 为 IOOng NDV 和 IOOng APV RNA ；2 为 IOng NDV 和 IOng APV RNA ；3 为 Ing NDV和 Ing APV RNA ；4 为 IOOpg NDV 和 IOOpg APV RNA ；5 为 IOpg NDV 和 IOpg APV RNA ；6 为Ipg NDV 和 Ipg APV RNA ；7 为 IOOfg NDV 和 IOOfg APV RNA。
[0043]图2为二重RT-PCR的特异性试验结果电泳图。图中:M为分子量标准IOObp DNAladder ;1 为 NDV (Lasota)RNA ；2 为 APV RNA ；3 为 NDV (Lasota)RNA 和 APV RNA 的混合模板(模板摩尔比1:1);4为NDV (F48E9) RNA和APV RNA的混合模板(模板摩尔比1:1);5为NDV (GX7/02)RNA 和 APV RNA 的混合模板(模板摩尔比 1:1);6 为 NDV (GX9/03)RNA 和 APVRNA的混合模板(模板摩尔比1:1) ;7为NDV (GX10/03) RNA和APV RNA的混合模板(模板摩尔比 1:1) ;8 为 AIV H9N2 (A/Chicken/Guangxi/067C4/2010) RNA ；9 为鸡传染性支气管炎病毒(Mass41)RNA ;10为禽脑脊髓炎病毒(AE Van)RNA ; 11为禽呼肠孤病毒(Reo S1133)RNA ；12为鸡传染性喉气管炎病毒(北京株)DNA ；13为鸡马立克氏病(MDV)疫苗毒DNA ；14为鸡毒霉形体(MG) DNA ；15为禽大肠杆菌(E.coli O2) DNA。
[0044]图3为二重RT-PCR对临床样品检测结果电泳图。图中:M为分子量标准IOObpDNA ladder ；1 为 NDV (Lasota) RNA ；2 为 APV/MN RNA ；3 为 NDV (Lasota) RNA 和 APV/MNRNA的混合模板(模板摩尔比1:1) ;4为阴性对照(正常鸡肺、气管组织RNA) ；5为临床样品C20120402RNA ；6为临床样品C20120427RNA ；7为临床样品C2012820RNA ；8为临床样品C20130504RNA ；9为临床样品C20130516RNA ；10为临床样品C20120314RNA ；11为临床样品C20130609RNA ; 12为临床样品C20130715RNA ;13为临床样品C20130811RNA ;14为临床样品C20131016RNA。`【具体实施方式】
[0045]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0046]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047]下述实施例中所用一些材料和试剂如下:
[0048]PCR仪为Bio-rad公司产品；DNA片断胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司；RT-PCR试剂、pMD18-T试剂盒购自大连宝生物工程(TaKaRa)公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。
[0049]禽肺炎病毒APV/MN株:记载于“谢志勤等，环介导等温可视扩增(LAMP)检测禽肺炎病毒方法的建立.中国动物检疫，2013，30 (3):48-51” 一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0050]鸡新城疫病毒(Lasota)、鸡新城疫病毒(F48E9):记载于“唐小飞等，多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立.中国兽医科技，2005，35 (11):888-891” 一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0051]鸡新城疫病毒分尚株GX7/02、鸡新城疫病毒分尚株GX9/03和鸡新城疫病毒分尚株GX10/03:均记载于“唐小飞等，新城疫病毒广西分离株F基因的克隆和序列分析，中国兽医科技，2005，35 (5):333-340” 一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0052]H9N2 亚型禽流感病毒(A/Chicken/Guangxi/067C4/2010):记载在 “Peng Yi (彭宜)等，Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reversetranscription loop-mediated isothermal amplification assay, Virology Journal,2011Jul5; 8:337” 一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0053]禽脑脊髓炎病毒(AE Van)、鸡传染性支气管炎病毒(Mass41)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV，北京株)、禽呼肠孤病毒(Reo S1133)、禽大肠杆菌(E.coli 02)、鸡毒霉形体(MG):记载于“Zhiqin Xie (谢志勤)等，Reverse transcriptase polymerase chainreaction to detect avian Encephalomyelitis virus.Avian Disease (美国禽病杂志)，2005，49:227-230”、“谢志勤等，应用二温式多重PCR技术鉴别鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒.广西科学，2001，8 (2):152-153”和“何士军，黄烨，唐顺发.鸡毒霉形体病(MG)免疫防治对策.2005年23期”中，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0054]鸡马立克氏病(MDV)疫苗毒购自南京梅里亚动物保健品公司。
[0055]实施例1、引物的设计与合成
[0056]根据GenBank中鸡新城疫病毒F基因(GenBank:JX840454.1，序列表中序列5)和禽肺炎病毒F基因(GenBank:AF187154，序列表中序列6)的保守序列，应用DNAStar引物设计软件进行引物设计，设计的引物在GenBank中通过Blast比对进行验证，最后确定并合成了 2对分别扩增AIV H9和APV的特异性引物(表1)。
[0057]表1鉴定NDV和APV的引物寡核苷酸序列
[0058]
【权利要求】
1.用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的引物对组，其特征在于:所述引物对组由两个引物对组成，一个引物对是由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成的用于鉴定或辅助鉴定所述鸡新城疫病毒的引物对1，另一个引物对是由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的用于鉴定或辅助鉴定所述禽肺炎病毒的引物对2。
2.根据权利要求1所述的引物对组，其特征在于:所述引物对组中的所述引物对I和所述引物对2在PCR反应体系中的摩尔比为1:1 ;所述引物对I和所述引物对2中各引物对的两条引物均等摩尔。
3.用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的试剂，由权利要求1或2所述的引物对组和RT-PCR扩增缓冲液组成。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于:所述RT-PCR扩增缓冲液中含有dNTPs、Mg2+、反转录随机引物、反转录酶、RNA酶抑制剂和DNA聚合酶。
5.用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒的试剂盒，含有下述a)和b): a)作为阳性对照的鸡新城疫病毒cDNA和禽肺炎病毒cDNA； b)权利要求1或2所述引物对组，或权利要求3或4所述的试剂。
6.权利要求1或2所述引物对组的制备方法，其特征在于:所述制备方法包括将权利要求I或2所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
7.如下c)或d)的应用:· c)权利要求1或2所述引物对组在制备权利要求3或4所述试剂，或权利要求5所述试剂盒中的应用； d)权利要求1或2所述引物对组、或权利要求3或4所述试剂，或权利要求5所述试剂盒，在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有鸡新城疫病毒和/或禽肺炎病毒的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:d)所述应用中，所述检测或辅助检测待测样品中是否含有鸡新城疫病毒和/或禽肺炎病毒为:用权利要求1或2所述的引物对组，或权利要求3或4所述的试剂，或权利要求5所述的试剂盒对所述待测样品进行RT-PCR反应，根据PCR产物的大小确定所述待测样品中是否含有鸡新城疫病毒和/或禽肺炎病毒； 所述进行RT-PCR反应的退火温度为50°C -600C。
9.用于鉴定或辅助鉴定鸡新城疫病毒的引物对，是由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对I。
10.权利要求9所述的引物对在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有鸡新城疫病毒的产品中的应用。
【文档编号】C12R1/93GK103820575SQ201410057797
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月20日 优先权日:2014年2月20日
【发明者】谢芝勋, 谢志勤, 刘加波, 庞耀珊, 邓显文, 谢丽基, 范晴, 罗思思 申请人:广西壮族自治区兽医研究所