肺炎支原体耐药诊断试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种肺炎支原体耐药诊断试剂盒。该试剂盒包括上游引物序列P1：5'TCCAGGTACGGGTGAAGACA'3；下游引物序列P2：5'GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT'3；探针序列T1：5'ACGGAAAGACCCC'3，VIC标记；探针序列T2：5'CGGGAAGACCCC'3，FAM标记。本发明提供的肺炎支原体耐药诊断试剂盒通过建立荧光定量PCR等位基因鉴别方法，对MP2063位点的基因型进行鉴定，在快速诊断的同时判断其耐药性，检测灵敏度较好。
【专利说明】肺炎支原体耐药诊断试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种PCR检测试剂盒，更具体地说，涉及一种实时定量的肺炎支原体耐药诊断试剂盒。
【背景技术】
[0002]肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,简称为MP)是儿童、青少年及成人上、下呼吸道感染的常见病原体。23%~50%的学龄前儿童和青少年社区获得性肺炎是由MP感染导致的，流行周期为3~7年。肺炎支原体肺炎易复发或迁延不愈，重症患者常合并肺外症状，对健康危害严重。
[0003]MP无细胞壁结构，临床上只能选择抑制或影响其蛋白质和核酸合成的药物，如大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、喹诺酮类抗生素等。但由于其他抗生素的不良反应，治疗儿童MP感染首选大环内酯类抗生素。自2001年发现对大环内酯类抗生素耐药的MP以来，MP耐药率逐年升高且流行范围逐渐扩大，已有多个国家或地区分离到MP耐药株。据文献报道，日本2007年MP耐药率已高达40%以上，韩国儿童住院患者MP耐药率为61.3%，意大利为26%，法国为9.8%，德国为3%。中国MP耐药形势则更为严峻，MP临床分离株中92%以上大环内酯类抗生素耐药。MP的耐药机制主要是核糖体大亚基23S rRNA的基因突变和核糖体蛋白L4、L22基因突变，其中23S rRNA结构域V区的2063位点和2064位点的点突变占主导地位。我国发现的耐药MP中2063A-G突变占97%以上。
[0004]目前，临床上常用的MP诊断方法为MP培养、血清学检测和PCR。MP培养耗时长，阳性率低，耐药性的监测通常需要体外培养并进行药敏试验，测定最小抑菌浓度(MIC)。血清学检测方法简便易行，但需要患者恢复期血清做对照，急性期诊断效果不佳。常规PCR方法具有快速、阳性率高的优点，但存在假阳性的问题。荧光定量PCR以特异性强、定量准确、重复性好等优点而得到迅速发展，但其并不能判断病原体耐药性，对临床治疗的指导意义有限。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于提供一种肺炎支原体耐药诊断试剂盒。该试剂盒可以通过建立荧光定量PCR等位基因鉴别方法，对MP2063位点的基因型进行鉴定，在诊断的同时判断其耐药性。
[0006]为实现上述的发明目的，本发明采用下述的技术方案:
[0007]—种肺炎支原体耐药诊断试剂盒,包括:
[0008]上游引物序列Pl:5’ TCCAGGTACGGGTGAAGACA’ 3 ；
[0009]下游引物序列P2:5’ GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT’ 3 ；
[0010]探针序列Tl:5’ ACGGAAAGACCCC’ 3，VIC 标记；
[0011]探针序列T2:5’ CGGGAAGACCCC’ 3，FAM 标记。
[0012]本发明提供的肺炎支原体耐药诊断 试剂盒通过建立荧光定量PCR等位基因鉴别方法，对MP2063位点的基因型进行鉴定，在快速诊断的同时判断其耐药性，从而指导临床实践。该诊断试剂盒的检测灵敏度较好，临床应用前景巨大。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为MP标准株ra、耐药株307及构建的标准质粒PCR结果。其中，I为MP标准株FH，2为耐药株307，3为敏感2063A质粒，4为耐药2063G质粒，N为阴性对照，P为阳性对照⑷为 IOObp DNA Ladder。
[0014]图2为实时荧光定量PCR标准曲线。
[0015]图3显示了实时荧光定量PCR鉴定2063等位基因的诊断价值。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0017]肺炎支原体(MP)是引起儿童肺炎和肺外并发症的一种常见病原体。目前儿童MP感染的主要治疗药物为大环内酯类抗生素。近年来国内、国际临床上越来越多分离到耐大环内酯类抗生素的MP株，主要耐药机制是核糖体大亚基的23S rRNA的编码基因突变。在我国，目前报道97%以上的耐药株为2063A —G突变。自2000年第一次报道实时定量PCR诊断MP以来，已有大量的针对不同扩增序列的实时定量PCR诊断方法研究出现，也出现很多市售试剂盒。但这些方法只能给出阳性或阴性结果，不能获得耐药信息。因此，本发明针对导致MP耐药2063位A — G的点突变，设计引物和探针，建立MP耐药诊断一步法的试剂盒。下面对此展开详细具体的说明。
[0018]I材料与方法
[0019]1.1 标本
[0020]1.1.1MP 标准株
[0021]MP标准株ra (ATCC15531)、人型支原体(ATCC27813)为首都医科大学附属北京友谊医院热带医学研究所实验室储存；梨形支原体、穿通支原体、生殖支原体由东南大学公共卫生学院王蓓教授馈赠。
[0022]1.1.2MP临床分离株
[0023]MP临床分离株分离自2010年2月~2011年2月就诊于首都医科大学附属北京友谊医院儿科(住院部和门诊)、首都医科大学附属北京朝阳医院儿科(住院部)的43例疑似肺炎支原体肺炎患儿的呼吸道咽拭子标本。鼻咽拭子标本12份采集自2012年12月就诊于北京大学第三医院儿科疑似MPP的病例。
[0024]1.1.3比对菌株
[0025]绿脓杆菌( ATCC27853)、大肠埃希菌(ATCC25922)、阴沟肠杆菌(ATCC700323)、金黄色葡萄球菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯临床分离株(1705)由首都医科大学附属北京友谊医院检验科馈赠。
[0026]1.2 试剂[0027]小牛血清、酵母提取物、葡萄糖、氨苄青霉素、IPTG、X-Gal、琼脂糖、胰蛋白胨均购自北京环亚泰克生物有限公司；2XTap plus PCR Green Mix购自Takara公司；pGEM?_-T Easy Vector Systems II 购自 Promega 公司；QIAamp DNA minikit DNA 提取试剂盒购自Qiagen公司；PCR产物回收试剂盒及质粒纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；突光定量PCR Genotyping mix购自美国ABI公司。
[0028]1.3荧光定量PCR
[0029]1.3.1DNA 模板提取
[0030]取20(^1^对数期生长的培养1^，2000(^，离心201^11;20(^1^ PBS沉淀重悬；QIAamp DNA minikit提取DNA模板。接种环无菌挑取菌落至200 μ L PBS中，QIAampDNAminikit提取DNA模板。对提取咽拭子标本的灭菌棉签用MP培养液浸泡，经反复涮洗挤压后弃掉棉签,将浸泡液以20000g，离心lOmin，弃去上清液后加标本处理液50 μ L,并充分混匀，置100°C沸水中水浴lOmin，此溶液作为DNA模板备用。
[0031]1.3.2引物序列与探针序列
[0032]根据MP标准株Ml29序列(NC_000912.1) 23S RNA突变位点设计上下游引物及探针;上游引物序列 Pl:5’TCCAGGTACGGGTGAAGACA’3( SEQ ID N0.1)，下游引物序列 P2:5，GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT’3 (SEQ IDN0.2)，探针序列 Tl:5’ACGGAAAGACCCC’3 (SEQID N0.3)，VIC 标记；T2:5’CGGGAAGACCCC’3 (SEQ ID N0.4)，FAM 标记。引物序列和探针序列均由英潍捷基贸易有限公司合成。
[0033]1.3.3PCR
[0034]反应体系:2X缓冲液 10`.0yL, 10 μ mol/L 的引物 P31.0 μ L，10 μ mol/L 引物P41.0 μ L，模板 DNA1.0yL, ddH207.0 μ L。
[0035]反应条件:93°C变性2min ；95°C lmin, 50°C lmin, 72°C lmin, 35 个循环；72°C延伸5min。
[0036]荧光定量PCR产物采用胶回收试剂盒回收，采用T Easy载体连接体系克隆，4°C连接过夜，转化感受态细胞，蓝白斑筛选。随机挑取6个白色菌落，以裂解液为模板，以原有荧光定量PCR反应体系进行扩增，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子挑选2个阳性克隆送英潍捷基贸易有限公司测序；采用Blast功能进行序列分析。挑选测序结果一致的克隆提取质粒备用。
[0037]1.3.4实时荧光定量PCR
[0038]反应体系:2X缓冲液 10.0 μ L，40XAssay Mix (含 P1，P2，T1，T2) 0.5 μ L，DNA 模板(野生型2063A或突变型2063G标准质粒)l.0yL, ddH207.0 μ L，总体积20 μ L。
[0039]反应条件:95°C lmin ；92°C 15s，60°C lmin,40个循环；分别收集扩增前、扩增时、扩增后荧光信号，采用ABI公司荧光定量PCR仪7500的SDS软件获得标准曲线。阳性质粒从600000到6进行10倍倍比稀释。采用不同菌株DNA作为模板进行特异性实验，检测实时荧光定量PCR反应体系中引物和探针的专一性。43株MP临床分离株2063位点基因型和鼻咽拭子标本2063位点基因型的鉴定均在本反应体系下完成。
[0040]1.3.523S rRNA巢式PCR23S rRNA巢式PCR引物为外套上游:5' GGTCCTAAGGTAGCGAAATT3' (SEQ ID N0.5);外套下游:5' CAGTTACCAATTAGAACAGC3'(SEQ ID N0.6);内套上游 P3:5' CCTAGTCGGGTAAATTCCGT3' (SEQ ID N0.7);内套下游 P4:5' CCAAGGGTAGTATTCCACCT3; (SEQ ID N0.8)(参见李靖、崔菲菲、辛德莉的论文《儿童呼吸道肺炎支原体感染耐药现状》，刊载于《实用儿科临床杂志》2009，24 (22):1717~1719.)，二轮产物送英潍捷基贸易有限公司测序。以23S rRNA巢式PCR测序结果为对照，计算实时荧光定量PCR鉴定2063位点基因型的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等。
[0041]2 结果
[0042]2.1构建标准质粒
[0043]以MP标准株!7H (敏感株，2063A)和临床分离株317 (耐药株，2063G)为DNA模板，进行PCR扩增，扩增片段位于250bp左右位置，与设计的目的片段244bp大小一致(见图1 )。将上述PCR产物连接至T-EASY后转化感受态细胞，涂板含有ITPG、Χ-gal和氨苄青霉素选择性平板，选择白色的菌落进行PCR鉴定，得到的片段大小与预期一致(见图1)。质粒测序结果显示，敏感2063A质粒2063位点与MP标准株均为A，耐药2063G质粒2063位点为G，与MP标准株!7H不一致。
[0044]2.2标准曲线
[0045]敏感2063A质粒标准曲线的R2为0.9979，斜率为一3.4893，扩增效率为93% ;耐药2063G质粒标准曲线的R2为0.9979，斜率为一3.7262，扩增效率为86%。在相同拷贝数下，敏感2063A质粒和耐药2063G质粒对应的Ct值很接近，重现性较好(见图2)。敏感2063A质粒和耐药2063G质粒的检测下限分别为和6和60，敏感2063A质粒拷贝数为6~6X 106，基因型为2063A ;耐药2063G质粒拷贝数为60~6X 106，基因型为2063G。
[0046]2.3特异性实验
[0047]MP临床分离株中耐药株的Ct值为24.69，基因型为2063G ；MP标准株的Ct值为26.05，基因型为2063A。 除生殖支原体外，人型支原体、梨形支原体、穿通支原体及绿脓杆菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌临床分离株均未出现扩增，生殖支原体的Ct值为26.15，基因型为2063A。
[0048]2.443株临床分离株2063位点基因型
[0049]43株临床分离株进行实时荧光定量PCR均出现扩增，Ct值为26.82~34.25，拷贝数为2.05 X IO4~2.95 X IO6 ;其中6株2063位点为A，为敏感株，37株2063位点为G，为耐药株，MP耐药率为86.05%。与23S rRNA巢式PCR测序结果相比，实时荧光定量PCR鉴定2063等位基因的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均为100% (见图3)。
[0050]2.5鼻咽拭子标本2063位点基因型
[0051]12份鼻咽拭子标本中2份进行实时荧光定量PCR均未出现扩增，其余10份标本中6份2063位点为A，为敏感株，3株2063位点为G，为耐药株，1份标本同时发现2063A和2063G位点。鼻咽拭子标本MP阳性率为83.33% (10/12)，耐药率为33.33% (4/12)。
[0052]本发明采用MP标准株FH，以耐药谱明确的临床分离株307作为模板，构建敏感型2063A质粒，将耐药型2063G质粒作为阳性标准品，绘制标准曲线。两型最低检出分别为6和60拷贝数。耐药型标准品较敏感型低一个数量级，考虑原因可能为2063位G氢键断裂需要较高的能量。所以在相同退火温度时，含G开链效率较A低，因此检出效果较A差。所以根据不同基因型构建标准曲线再进行核酸定量是必要的。特异性实验结果显示生殖支原体MG有扩增，基因型为2063A。MG为一种定植于泌尿生殖道的具有致病性的性传播病原体，首选治疗药物为大环内酯类、喹诺酮和四环素类抗生素。对MG进行序列分析，发现2063A位附近MG序列与标准株M129 —致性达到99%。因检测位点区域、荧光定量PCR引物和探针实验设计的限制，该交叉不可避免。但可以通过血清学或16s RNA PCR区分。
[0053]应用该试剂盒检测43株临床分离株，6株为敏感株，37株是耐药株。将43株临床分离株经传统23S rRNA巢式PCR后测序显示结果与本发明完全一致。由此可以看出，对于临床分离株，利用该试剂盒可以快速准确鉴定2063位基因型，区分耐药和敏感株，从而简化操作流程，降低劳动强度。
[0054]该试剂盒应用于临床标本，发现MP阳性检出率为88.33%。同批标本23S rRNA巢式PCR均检出阳性。发明人经过分析，认为可能是咽拭子标本DNA提取液混有大量杂质，简单煮沸法并不能完全清除PCR抑制物，导致实时定量PCR效率下降，检出率降低；或者由于个别患者载量较低所致，可以考虑优化DNA标本提取方法或者使用成熟的DNA提取试剂盒。
[0055]本发明第一次在同一标本中检测出2063A和2063G杂合基因型,说明在同一患者可能同时存在敏感和耐药株。而普通巢氏PCR测序会导致优势菌株基因大量被扩增，测序结果通常仅说明优势菌群基因型，不能如实反应病人实际感染MP的表型。本发明的研究成果显示MP在体外大环内酯类抗生素压力下会产耐药性，或者也可能为环境中MP即存在2063A — G的低水平突变，只是抗生素使用杀死敏感株时，耐药株才成为优势菌群。
[0056]综上所述，本发明初步建立了一种快速诊断MP感染及判断耐药表型的肺炎支原体耐药诊断试剂盒。该试剂盒检测灵敏度较好，但2063A和2063G基因型检测下限不同，2063G较2063A低一个数量级，仅与生殖支原体有交叉。应继续优化反应体系并在扩大临床应用，对效果进行评估。本发明与传统23S rRNA巢氏PCR测序方法相比，敏感性和特异性均较好，临床应用前景巨大。
[0057]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。`
【权利要求】
1.一种肺炎支原体耐药诊断试剂盒，其特征在于包括: 上游引物序列 Pl:5’ TCCAGGTACGGGTGAAGACA’ 3 ； 下游引物序列 P2:5’ GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT’ 3 ； 探针序列 Tl:5’ ACGGAAAGACCCC’ 3，VIC 标记； 探针序列 T2:5’ CGGGAAGACCCC’ 3，FAM 标记。
2.如权利要求1所述的肺炎支原体耐药诊断试剂盒，其特征在于: 采用肺炎支原体标准株，以耐药谱明确的临床分离株作为模板，构建敏感型2063A质粒，将耐药型2063G质粒作为`阳性标准品，绘制标准曲线。
【文档编号】C12Q1/68GK103820557SQ201410073883
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】辛德莉, 李静宜, 孙岚, 郭东星, 姜越 申请人:首都医科大学附属北京友谊医院