牛体外受精胚胎培养液和培养方法
【专利摘要】本发明提供一种专用于牛体外受精胚胎的培养液，所述培养液中含NaCl109.0-110mM、KCl2.9-3.1mM、NaHCO326.0-26.5mM、MgCl2·6H2O0.5-1.0mM、KH2PO31.0-1.3mM、丙酮酸钠0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸钙5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺1mM、2v/v%必需氨基酸、1v/v%非必须氨基酸和谷胱甘肽1-10mM。将牛体外受精胚胎置于上述培养液中进行体外培养，结果显示明显优于未添加GSH的对照组，提高了囊胚发育率及胚胎质量，降低体外生产胚胎的成本，为牛IVF技术应用于实践提供实验基础，可大大加速遗传育种进程。
【专利说明】牛体外受精胚胎培养液和培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业-畜牧兽医领域，具体地说，涉及一种牛体外受精胚胎培养液和培养方法。
【背景技术】
[0002]随着现代农业科技的发展，为了更充分利用良种母牛的繁殖潜力，加速遗传育种进程，在生产实践中应用高效的繁殖新技术成为必然。活体采卵(Ovum pick UP,0PU)和体外受精技术(In Vitro Fertilization, IVF)是二十世纪八十年代快速发展起来的胚胎工程新技术，二者相结合可获得大量遗传系谱明确的胚胎，从而缩短世代间隔。目前，这两种技术已经成为欧美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群而采用的重要繁殖技术。然而，采用常规的牛胚胎培养体系(CRlaa和SOF液)，牛体外受精的囊胚发育率较低，而且胚胎质量也远不及体内胚胎，导致胚胎移植受体后的妊娠率低，因此如何提高囊胚发育率及胚胎质量成为体外受精胚胎生产的重点和研究的焦点。
[0003]早在1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术。但直到1951年，美籍华人张民觉和Austin分别发现精子体外获能现象后，体外受精技术才获得了突破性进展。牛体外受精技术受到卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、受精卵的体外培养环境等多个方面的影响。
[0004]胚胎的体外培养是IVF技术的一个关键环节，亦是卵母细胞体外成熟和体外受精技术最终效果的体现和检验。在体外受精后，受精卵在向囊胚发育过程中将需经历一系列重要的变化，包括合子的形成 、第一次卵裂、胚胎基因组的激活、致密化以及形成囊胚。这一过程中，外界环境的变化会导致基因表达发生改变，从而影响胚胎的正常发育及质量。目前，哺乳动物早期胚胎的体外培养研究主要集中在改善培养液成分以满足不同发育阶段的胚胎营养需求。基于Rosenkrans等(1991年)开发的Charles Rosenkransl (CRl)培养液和Tervit等(1972年)开发的合成输卵管液(SyntheticOviductal Fluid, S0F),经多年不断改进逐步形成了两种培养体系。据Hakan Sagirkaya等(2007年)和Somfai等(2010年)研究成果表明，CRlaa培养液用于牛胚胎培养有较好的效果，可以广泛应用于牛的胚胎培养Thompson, J.G.等(2000年)和Jean M.Feugang等(2009年)的研究结果显示，SOF培养液也是一种适合于牛胚胎培养的培养体系。张志平等(2006年)和桑国俊等(2008年)研究结果也显示，经过优化的CRlaa和SOF培养液均适合于牛的体外胚胎培养，均取得良好的培养效果。哺乳动物早期胚胎发育是一个高度协调且精确调节的过程。在进化过程中，配子细胞逐步形成了一系列的分子级联网络，以保证胚胎发育周期系统地进行。在发育过程中，胚胎的内外活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, R0S)与抗氧化剂的平衡对早期胚胎发育起着决定性作用。
[0005]大多生化反应均产生R0S，其在细胞内、外均有着重要的作用，一部分ROS起着信号分子的作用，但是大多数ROS对机体是有害的。Brooker，R.J.等(2011年)报道，ROS可以引起细胞DNA损伤、不饱和脂肪酸的氧化、蛋白质中氨基酸的氧化甚至可以导致某些酶的失活。一般来说，ROS以四种形式存在，其中H2O2氧化作用较强，是引起氧化伤害的最主要因素。
[0006] 大量研究表明，谷胱甘肽(GSH)是以非蛋白质形式存在的一种抗氧化剂，能够清除多种自由基:超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢、次氯酸和脂氧自由基，并且能够维持细胞内外氧化还原平衡。细胞内外环境GSH和ROS水平是影响受精卵发育过程中的两个重要因素。早在2000年，de Matos等曾通过在体外胚胎培养过程中添加β-巯基乙醇、半胱氨酸和胱氨酸来提高囊胚率。
[0007]尽管体外受精技术能成功应用于许多哺乳动物，但由于体外受精的囊胚率低而导致体外受精胚胎的生产成本高、效率低，限制了该技术在牛快速扩繁实践中的广泛应用。因此，如何能够降低成本并提高牛IVF胚胎生产效率和胚胎质量成为亟待解决的问题。
[0008]目前，牛体外受精的技术体系中主要以CRlaa和SOF液为胚胎体外培养液，并在此基础上进行改进，囊胚发育率均有不同程度的提高，囊胚发育率平均为30%-40%。对于囊胚质量,可以通过囊胚细胞总数、ICM细胞数/总细胞数比例、细胞凋亡率来评估。囊胚细胞总数根据囊胚所处阶段的不同而不同，S.1wasaki等(1990年)获得的牛早期囊胚总细胞数平均为44，ICM细胞数/囊胚总细胞数比例为15.8%左右；Andrew J.Watson等(2000年)统计牛囊胚细胞凋亡率约为7.7%-13%。
【发明内容】
[0009]本发明旨在提高牛IVF胚胎生产效率和胚胎质量，提供一种专用于牛体外受精胚胎的培养液和培养方法。
[0010]为了实现本发明目的，本发明的一种牛体外受精胚胎培养液，所述培养液配方为=NaCl 109.0-1lOmM, KC12.9-3.1mM, NaHC0326.0-26.5mM、MgCl2.6Η200.5-1.0mM、KH2PO3L 0-1.3mM、丙酮酸钠0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸钙5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必须氨基酸和谷胱甘肽l_10mM，以水配制。
[0011]所述培养液配方优选为:NaC1109.0M、KC13.1M、NaHC0326.2M、MgCl2.6H200.8mM、KH2PO3L 19M、丙酮酸钠0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸钙5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必须氨基酸和谷胱甘肽1-lOmM。
[0012]所述必需氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为=L-盐酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g/L、L-盐酸组氨酸一水物2.lg/L、L-异亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-赖氨酸盐酸盐3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-苏氨酸2.38g/L、L_色氨酸0.51g/L、L_酪氨酸1.8g/L和L-缴氨酸 2.34g/L。
[0013]所述非必须氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为=L-丙氨酸0.89g/L、:L-天门冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L-谷氨酸1.47g/L、甘氨酸 0.75g/L、L-脯氨酸 1.15g/L 和 L-丝氨酸 1.05g/L。
[0014]优选地，所述培养液中谷胱甘肽含量为lmM、3mM、5mM或7mM。
[0015]更优选地，所述培养液中谷胱甘肽含量为3mM或5mM。
[0016]最优选地，所述培养液中谷胱甘肽含量为3mM。
[0017]本发明还提供一种牛体外受精胚胎的培养方法，将牛体外受精胚胎置于上述牛体外受精胚胎培养液中，在38.5°C、0.5%C02、100%湿度条件下进行体外培养。
[0018]本发明具有以下优点:
[0019]本发明通过在培养液中添加一定浓度的谷胱甘肽(Glutathione, GSH),能显著提高体外胚胎的发育能力。同时对囊胚进行差异染色，区分内细胞团(Inner CellMass, ICM)、滋养层细胞和凋亡细胞，比较总细胞数，并计算ICM细胞数/总细胞数比例和凋亡率，结果显示添加GSH的试验组优于对照组，提高了囊胚发育率及胚胎质量，降低体外生产胚胎的成本，为牛IVF技术应用于实践提供实验基础，可大大加速遗传育种进程。
【具体实施方式】
[0020]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0021]实施例牛体外受精胚胎的培养方法
[0022]一、试剂
[0023]成熟培养液:含0.01IU/ml FSHUOIU/ml LH、I μ g/ml 雌二醇、100ng/ml IGF、50ng/ml EGF, lOOU/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、10%胎牛血清的TCM-199培养液。
[0024]洗精液:含112.0mM NaCl,4.02mM KCl,2.25mM CaCl2.2Η20、0.52mM MgCl2.6H20、0.83mM KH2PO3,37.0mM NaHC03、L 25mM 丙酮酸钠、10 μ g/ml 肝素、4mg/ml 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、10mM 咖啡因、lOOU/ml 青霉素、100 μ g/ml 链霉素的水溶液。 [0025]受精液:含112.0mM NaCl,4.02mM KCl,2.25mM CaCl2.2Η20、0.52mM MgCl2.6H20、
0.83mM KH2PO3,37.0mM NaHC03、1.25mM丙酮酸钠、10 μ g/ml 肝素、4mg/ml BSA、lOOU/ml 青霉素、100 μ g/ml链霉素的水溶液。
[0026]胚胎前期培养液:含109.5mM NaCl,3.1mM KCl,26.2mMNaHC03、0.8mM MgCl2.6Η20、
1.19mM ΚΗ2Ρ03、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸H6mg/ml BSA>ImM L-谷氨酰胺、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必须氨基酸的水溶液。胚胎后期培养液:含109.5M NaCl,
3.1M KC1、26.2M NaHC03>0.8M MgCl2.6Η20、1.19ΜΚΗ2Ρ03、0.4Μ丙酮酸钠、1.5Μ葡萄糖、5Μ半乳糖酸1丐、10v/v%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、IM L-谷氨酰胺、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必须氨基酸的水溶液。
[0027]所述必需氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为=L-盐酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g/L、L-盐酸组氨酸一水物2.lg/L、L-异亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-赖氨酸盐酸盐3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-苏氨酸2.38g/L、L_色氨酸0.51g/L、L_酪氨酸1.8g/L和L-缴氨酸 2.34g/L。
[0028]所述非必须氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为=L-丙氨酸0.89g/L、:L-天门冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L-谷氨酸
1.47g/L、甘氨酸 0.75g/L、L-脯氨酸 1.15g/L 和 L-丝氨酸 1.05g/L。
[0029]二、卵母细胞的采集和体外成熟
[0030]1.从屠宰场采集牛卵巢，置于37°C生理盐水中，3h内送至实验室。
[0031]2.使用含有青霉素和链霉素的温热的生理盐水将卵巢清洗3-5次。
[0032]3.使用真空蠕动泵，用18号针头抽取5-8毫米卵泡中的卵泡液。[0033]4.体视显微镜下挑选卵母细胞-卵丘细胞复合体(COCs)，在洗卵液中将COCs洗漆两次，在成熟培养液中洗漆一次。
[0034]5.将洗干净的COCs放入含有成熟培养液并覆盖矿物油的四孔板中，每孔培养50枚 COCs，培养 22-24h。
[0035]三、体外受精
[0036]1.将COCs从成熟培养液中移入50 μ I受精滴中，每滴放15枚COCs。
[0037]2.38°C水浴解冻精液，使用5ml洗精液在500g条件下离心5min ;弃上清，再加入5ml洗精液离心5min，弃上清，使用洗精液调整精子浓度，使精子浓度约为2X IO7个/ml。
[0038]3.取50 μ I精液，与含有COCs的受精滴混合成为100 μ I的液滴。
[0039]4.38.50C，5%C02气体，95%湿度条件下精卵共孵育8h。
[0040]四、胚胎体外培养
[0041]1.精卵共孵育8h后，取出卵母细胞，使用lmg/ml的透明质酸酶处理3min，然后使用移液枪反复吹打，直至卵丘细胞基本脱落。
[0042]2.使用含10%FBS的TCM199终止透明质酸酶的消化，用口吸管将疑似受精卵在胚胎前期培养液中洗3次后放入胚胎前期培养液滴中进行培养。
[0043]3.48h后，将卵裂至4-8细胞的胚胎移至胚胎后期培养液滴中，48h后半量更换胚胎后期培养液。
[0044]4.第7天时,统计囊胚率。
[0045]五、GSH最适添加浓度筛选
[0046]1.配制0.5M的GSH作为储液。
[0047]2.使用GSH储液，按照终浓度为lmM、3mM、5mM、7mM梯度配制为试验组，以非添加组为对照。
[0048]3.分别于培养的第48h、第5天、第7天，统计各个组的卵裂卵与8细胞率、桑椹胚率和囊胚率。
[0049]六、胚胎差异染色
[0050]1.选取体外培养第7天的囊胚,使用2%多聚甲醒固定20min。
[0051 ] 2.使用含0.5%BSA的磷酸盐缓冲液(PBS-BSA)洗两次，放入透化液(50 μ ITriton,5 μ I Tween 和 9.945ml PBS)中，室温放置 30min。
[0052]3.使用2M盐酸室温处理20min，然后使用IOOmM Tris-HCl室温处理lOmin，使
⑶X2蛋白能够与一抗结合。
[0053]4.使用PBS-BSA清洗三次，将囊胚放入封闭液(Iml山羊血清、5μ ITween和
8.995ml PBS)中，室温封闭lh，然后转入4°C冰箱封闭过夜。
[0054]5.弃去封闭液,⑶X2 —抗用封闭液按1:200稀释,室温孵育2h,弃去一抗稀释液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。
[0055]6.caspase-3一抗(购自 Cell Signaling Technology 公司)用封闭液按 1:200 稀释，室温孵育2h，弃去一抗稀释液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。 [0056]7.在避光条件下用封闭液按1:200稀释⑶X2特异性二抗(购自Sigma公司)，室温下避光放置lh。避光条件下弃去二抗稀释液，用PBS清洗3次，每次5min。
[0057]8.在避光条件下用封闭液按1:200稀释caspase-3特异性二抗(购自LifeTechnologies公司),室温下避光放置lh。避光条件下弃去二抗稀释液,用PBS清洗3次，每次5min。
[0058]9.加入10 μ g/mL的Hochest33342染液染细胞核，室温作用5min，在荧光显微镜下观察并拍照。
[0059]10.实验重复三次，每次随机选取10个囊胚，计算凋亡率、ICM细胞数/总细胞数来评估囊胚质量。
[0060]七、数据统计
[0061]实验数据采用统计软件SAS V8中的ANOVA程序进行分析，Duncan’ smultiple-range检验方法判定处理间的差异显著性，当p〈0.05时认为差异显著。
[0062]八、胚胎后期培养液中添加GSH可显著提高牛体外受精囊胚的发育率
[0063]选择GSH添加浓度为O、1、3、5、7mM进行筛选，通过统计卵裂率、4-8细胞率、桑椹胚率、囊胚率(表1 )，结果各组间的卵裂率和4-8细胞率均差异不显著(P > 0.05);对桑葚胚发育率，3mM和5mMGSH添加组均显著高于对照组和其他实验组(P < 0.05)，但这两组间差异不显著(P > 0.05);对囊胚率，和5mM GSH添加组均显著高于对照组(p < 0.05),而7mM的GSH添加组与对照组间差异不显著(p > 0.05)，可见在胚胎后期培养液中添加GSH均可提高牛IVF胚胎的体外发育率。
[0064]表1不同GSH浓度对牛IVF胚胎发育的影响
[0065]
【权利要求】
1.一种牛体外受精胚胎培养液，其特征在于，所述培养液配方为=NaCl 109.0-1lOmM,KCl 2.9-3.1mM, NaHC0326.0-26.5mM、MgCl2.6Η200.5-1.0mM, KH2PO3L 0-1.3mM、丙酮酸钠0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸|丐5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必须氨基酸和谷胱甘肽1-1OmM,以水配制； 所述必需氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为:L-盐酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g/L、L-盐酸组氨酸一水物2.lg/L、L_异亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-赖氨酸盐酸盐3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-苏氨酸2.38g/L、L-色氨酸0.51g/L、L_酪氨酸1.8g/L和L-缴氨酸 2.34g/L ； 所述非必须氨基酸为以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量为:L-丙氨酸0.89g/L、:L-天门冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L_谷氨酸1.47g/L、甘氨酸0.75g/L、L-脯氨酸1.15g/L和L-丝氨酸1.05g/L。
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液配方为:NaC1109.5M、KC13.1M、NaHC0326.2M、MgCl2.6Η200.8mM、KH2PO3L 19M、丙酮酸钠 0.4mM、葡萄糖 1.5mM、半乳糖酸韩5mM>10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必须氨基酸和谷胱甘肽1-10禮。
3.根据权利要求1或2所述的培养液，其特征在于，所述培养液中谷胱甘肽含量为lmM、3mM、5mM 或 7mM。
4.根据权利要求3所述的培养液，其特征在于，所述培养液中谷胱甘肽含量为3mM或5mM。
5.根据权利要求4所述的培养液，其特征在于，所述培养液中谷胱甘肽含量为3mM。
6.牛体外受精胚胎的培养方法，其特征在于，将牛体外受精胚胎置于权利要求1-5任一项所述培养液中，在38.5°C、0.5%C02、100%湿度条件下进行体外培养。
【文档编号】C12N5/073GK103898046SQ201410073635
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】杜卫华, 孙尉俊, 朱化彬 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所