波吉卵囊藻高密度培养方法及藻细胞收集方法
【专利摘要】本发明公开了一种波吉卵囊藻高密度培养技术和藻细胞收集方法，涉及海洋微藻养殖领域。波吉卵囊藻传统培养基生长速度慢，产量低。本发明用NaNO3和尿素作氮源，添加适量的NaHCO3并补充了九二0植物生长刺激素、人尿、海泥抽取液、牛粪及羊粪浸出液和土壤抽出液，营养更均衡、全面。本发明采用家庭用矿泉水桶培养方法代替传统的开放水泥池培养，操作简单，不易污染，易于掌控，安全可靠，四季均可生产，成本低，生长快，尤其适用于扩种阶段，产量提高180％。本发明用黄泥浆法收集波吉卵囊藻取代过去的离心法，细胞回收率高，简单易行，花钱少，设备简单，材料易得，对细胞无伤害，适于大规模生产，经济效益高。
【专利说明】波吉卵囊藻高密度培养方法及藻细胞收集方法
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋微藻养殖领域，尤其涉及波吉卵囊藻高密度培养方法及藻细胞收集方法。
【背景技术】
[0002]波吉卵囊藻Oocystis borgei是从对奸高位池分离出来,作为微藻生态调控、改善养殖环境、防止对奸疾病的一种微藻，隶属于绿藻门Chlorophyta,绿藻纲Chlorophyceae,绿球藻目Chlorococcales,卵囊藻科Oocystaceae,卵囊藻属Oocystis。由2、4、8个细胞组成群体生活，群体卵圆形；群体外有一层明显胶质包被，群体中细胞椭圆或略呈卵形，两端广圆；色素体片状。细胞长10-19 μ m，宽9-13 μ m ;一般产生2、4、8或16个似亲孢子，营孢子生殖。
[0003]高位池是一种对虾高密度集约化养殖模式。通过生物技术调控养殖水域中微生物群落的结构与功能来预防疾病，是对虾养殖生态防病的重要内容。波吉卵囊藻广泛存在于南方对虾高位池，种群稳定，适应能力强，可调控和改善养殖环境并防止对虾疾病。该藻富含蛋白质、海藻多糖、维生素及多不饱和脂肪酸，是水产经济动物舌鳎、黑鲷、海湾扇贝、鲍鱼、紫海胆、梭子蟹、海参、泥蚶、贻贝、牡蛎、文蛤、日本对虾等的良好饵料。生态学研究表明，波吉卵囊藻最适生长温度是25-30°C;最适海水密度1.008-1.016，在1.004-1.020范围均能正常生长；最适PH值范围7.5-9.0 ;最适光照强度为4000-100001X，每天24小时连续光照，细胞增殖率最大；种群增长无明显指数生长期。张浩在实验室中模拟多种氮源共存的虾池水环境，利用稳定同位素示踪剂，研究温度、光照、盐度、pH、藻浓度对波吉卵囊藻氨氮吸收速率的影响，结果表明，温度、光照和藻浓度对波吉卵囊藻氨氮吸收速率影响极显著。当温度为20°C，照度为45001x，藻浓度为5.5X105/mL时，该藻对氨氮吸收速率最大。
[0004]海泥抽出液含有藻类生长所必需的各种微量元素和溶解有机物质及某些辅助生长物质，具有络合剂的作用。在培养液中加入海泥抽出液，实际是解决了微量元素供应的问题。碳水化合物是海泥的有机组成成分，可以补充碳源。陈振奋认为，海泥抽取液对牟氏角毛藻生长的促进作用强于维生素。我的研究表明，添加适量海泥抽取液对波吉卵囊藻生长有较好促进作用。人尿中95%是水，5%是可溶性无机盐，其中约2%是尿素。在藻细胞的氮代谢中，氮必须以NH4+的形式与细胞内的碳水化合物衍生的酮酸作用生成氨基酸，再合成蛋白质。孙凌毅指出，波吉卵囊藻对铵盐和尿素的利用强于硝酸盐。张贵杰等研究表明，培养波吉卵囊藻以尿素效果最好，硝酸钠次之，氯化铵最差。张青田等认为以尿素为氮源培养隐藻效果强于氯化铵。本人研究证实每升培养液中添加1-3毫升的尿液对波吉卵囊藻生长有较好促进作用。
[0005]目前，波吉 卵囊藻规模化培养存在的主要问题是藻细胞生长缓慢、倍增时间长、产量低、易污染。合适的培养基是实现波吉卵囊藻高密度养殖的基础。波吉卵囊藻的培养传统上使用f/2培养基，其中不含碳酸氢钠和九二 O植物生长刺激素，但我的实验研究表明，波吉卵囊藻除了能利用空气中游离的CO2，还能有效地利用培养液中的HC03_作为碳源，波吉卵囊藻培养基中添加适量的NaHCO3、九二 O植物生长刺激素、海泥抽取液、牛粪和羊粪浸出液、土壤抽出液及复合维生素等不仅缩短了波吉卵囊藻倍增时间，而且延长了生长时间，大大提闻了生长速度，操广量能提闻180%。
[0006]传统上，波吉卵囊藻采用开放水泥池培养，培养规模大，产量高，但缺点也十分明显:易污染，占地面积大，受天气影响大，不易掌控，一次性投资大，单产低，见效慢，经济效益低，不适用于扩种阶段。我采用家庭用的矿泉水桶培养方法代替传统的开放水泥池培养，不仅操作简单，不易污染，易于掌控，规模可大可小，灵活多样，塑料桶不易划破，安全可靠，透光性好，可重复使用，而且一年四季均可生产，成本低，生长快，尤其适用于扩种阶段，产量大大提闻。
[0007]关于波吉卵囊藻细胞收集方法，过去最常用的方法是离心机离心，无污染，离心较彻底，但缺点太明显:离心设备昂贵，即使一台简易的大型离心机也需要40万-50万元人民币，不仅耗电量大，运行费用高，而且会打碎藻细胞，降低产量。也有人采用明矾和石灰水沉淀法收集藻细胞，回收效率较高，但明矾和石灰对藻细胞有污染及伤害作用，而且费用很高。我的实验和研究表明，黄泥浆法收集波吉卵囊藻不仅回收率高，沉淀彻底，而且简单易行，花钱少，设备简单，材料易得，易于操作，对波吉卵囊藻细胞没有任何伤害，适于大规模生产和推广，经济效益高。
【发明内容】
[0008]为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种波吉卵囊藻培养基配方:NH4N036毫克，K2HP044 毫克，尿素 2 毫克，Na2SiO3.9H205 毫克，MgSO4.7H2012 毫克，NaHC0340 毫克，九二 O植物生长刺激素400国际单位，f/2维生素溶液I毫升，f/2微量元素溶液I毫升，人尿1.5毫升,海泥抽取液2毫升,牛粪浸出液I毫升,羊粪浸出液1.2毫升,土壤抽出液I晕升，消毒海水1000毫升。其中f/2微量元素溶液配方=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，FeC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，纯水1000毫升；f/2维生素溶液配方:维生素B120.5毫克，维生素B1IOO毫克，维生素H0.5毫克，纯水`1000毫升。消毒海水制备方法:每I立方米海水中加入漂白液200-300毫升，使海水中有效氯含量达到10-20mg/L，空气压缩机充气8_12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止。
[0009]一种波吉卵囊藻高密度培养方式，其特征在于包括如下步骤:
[0010]培养容器为家庭用的矿泉水桶，容积约20升，无色透明或带浅天蓝色，洗刷干净，后用蒸馏水润洗3遍，用漏斗装入上述培养基12升，充分摇匀5分钟，选择生命力旺盛、无污染的波吉卵囊藻液进行接种，接种密度15 X 104-20 X 104cell/mL，瓶口插入两根干净玻璃管，一根长58厘米，插入较深，离瓶底5厘米，用以充气；另一根长15厘米，两端露出瓶口即可，用以排气。两根玻璃管同样粗细，直径6毫米。最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干净的透明胶带封口并将两根玻璃管固定。长的玻璃管上端露出瓶口 10-15厘米，用乳胶管或塑料管与空气压缩机或气泵相连，一天24小时连续充气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可。室内培养，空调控温，最佳温度26±2°C，日光灯照射，光照强度10000-120001x，光/暗周期为16L/8D，即光照16小时，黑暗8小时。培养至第6天，停止充气，揭开透明胶带，用漏斗从瓶口加入2升新鲜培养基，胶带重新封口，充气，继续培养，至第10天，密度增加至800 X IO4-1OOO X IO4CelΙ/mL，停止培养，从瓶口倒出藻液，将矿泉水桶洗刷干净后，加入中药消毒液消毒10-30分钟，后进入下一轮培养。
[0011]所述中药消毒液:由以下重量比的物质组成:黄芩7~10份、黄秋葵粉3~5份、鱼腥草3~5份、大黄5~10份、甘草5~10份；将上述药材放入可加热的容器中，加入3~5倍体积的纯净水，煮沸后持续煮30~50分钟，后过滤，沉淀I~2小时，后取澄清液即可；所述黄秋葵粉是清洗干净并烘干后的黄秋葵茎叶、花及籽粒经超微粉碎机粉碎至250目，然后搅匀、灭菌所得。
[0012]波吉卵囊藻细胞收集方法
[0013]取新鲜黄泥巴I公斤于塑料水桶中，加入10升蒸馏水，玻璃棒充分搅拌15分钟，后置于黑暗处静置沉淀24小时，取上清液，用网目孔径80-100 μ m的筛絹过滤，除去沉渣后，留下清液，用离心机离心15分钟，转速4500r/min，取上清液，装入棕色磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存，备用。将培养完的藻液按每I升藻液加入250毫升黄泥巴上清液的量加入黄泥巴上清液，充分搅拌30分钟，后置于黑暗处，静置沉淀48小时，98%的藻细胞可沉淀到底部，弃上清液，即得绿色牙膏状藻泥，110°C喷雾干燥法烘干藻泥可得绿色面粉状藻粉，收集完成。
[0014]有益效果
[0015]波吉卵囊藻的培养传统上使用f/2培养液配方，生长速度慢，产量低。我的新发明用NaNO3和尿素作氮源，添加适量的NaHCO3并补充了九二 O植物生长刺激素、f/2维生素、人尿、海泥抽取液、牛粪及羊粪浸出液和土壤抽出液，营养更均衡、全面，大大加快了波吉卵囊藻生长速度。波吉卵囊藻的培养方式，我采用家庭用的矿泉水桶培养方法代替传统的开放水泥池培养，操作简单，不易污染，易于掌控，规模可大可小，灵活多样，塑料桶不易划破，安全可靠，透光性好，可重复使用，一年四季均可生产，成本低，生长快，尤其适用于扩种阶段，产量提高180%。波吉卵囊藻细胞收集方法，过去常用的方法是离心机离心，该方法设备昂贵，耗电量巨大且会打碎细胞，降低产`量。也有人采用明矾沉淀法收集藻细胞，回收率较高，但明矾对藻细胞有污染和伤害作用且费用很高。我发明的黄泥浆法收集波吉卵囊藻细胞不但回收率高，沉淀彻底，而且简单易行，花钱少，设备简单，材料易得，易于操作，对波吉卵囊藻细胞没有任何伤害，适于大规模生产和推广，经济效益高。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图为波吉卵囊藻塑料桶高密度培养方式图。
[0017]其中附图标记为:1矿泉水桶；2充气管；3排气管；4藻液。
【具体实施方式】
[0018]培养基配制方法
[0019]I)九二 O植物生长刺激素为白色结晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(每克用50毫升酒精或60度白酒溶解I小时以上)，再按所需浓度兑水稀释；
[0020]2)配制培养基的过程中需不断搅水，消毒海水中加完一种营养盐，不停地搅拌，隔3分钟，再加下一种，而且各种营养盐按配方提供的顺序加入，以免发生化学反应；[0021]3)各种营养盐特别是f/2维生素溶液需预先配成母液，置于4°C冰箱冷藏保存，备用；
[0022]4)海泥浸出液制备方法:取海滩上沙质较少、有机质较多而又不过分於黑的上层软泥，清除其中的小树枝和小石块等杂物，以容量计算一份泥加两份水，充分搅拌均匀，静置10-15分钟，待粗砂、小石下沉后，把上层泥浆倒入铝锅中，弃去底部粗砂、小石等杂物，按每1000毫升泥浆加入1克的量加入NaOH，煮沸20-30分钟，煮时需不断搅拌，煮后静置24小时，吸取上清液，装入棕色试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存，备用；
[0023]5)因柠檬酸铁(FeC6H5O7.5H20)较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90°C，并不断搅拌至全部融化；
[0024]6)人尿制备方法:取人尿1000毫升，烧瓶煮沸15分钟后，冷却24小时，装入白色
透明磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存，备用；
[0025]7)羊粪浸出液制备方法:取新鲜羊粪10公斤，加入麸皮1公斤，玉米面0.5公斤，自来水I升，充分搅拌，装入塑料袋发酵10天，后取2公斤放入盆中，加入6升蒸馏水，充分搅拌15分钟，静置，36小时后500目筛絹过滤，取滤液加热煮沸30分钟，以杀死其中的病毒等微生物，冷却，静置72小时，取上清液，即为羊粪浸出液，装入磨口塞试剂瓶，密封，置于
4°C冰箱保存，备用；
[0026]8)牛粪浸出液制备方法:取牛粪50公斤，加入麸皮3公斤，玉米面1公斤，自来水4升，充分搅拌，堆成圆锥状，自然发酵15天，后摊成薄层，阳光下暴晒3天，后取3公斤放入水桶中，加入10升蒸馏水，充分搅匀，静置，48小时后400目筛絹过滤，取滤液加热，煮沸45分钟，杀死其中的细菌、霉菌、病毒等，冷却，沉淀48小时，取上清液，即得牛粪浸出液，装入磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存，备用；
[0027]9) 土壤抽出液制备方法:取草地上层有机质较多且较松散土壤1公斤，加蒸馏水1000毫升，再加入Na0H2.5克，充分搅拌，煮沸120分钟，冷却后过滤，将清液置于暗处静置48小时，取上清液装入棕色试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存，备用；
[0028]10)消毒海水制备方法:每I立方米海水中加入漂白液200-300毫升，使海水中有效氯含量达到10-20mg/L，空气压缩机充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止；
[0029]11)配制培养基所用的化学药品纯度均需分析纯级别；
[0030]12)此培养基配方对波吉卵囊藻扩种和大规模培养各阶段都适用。
[0031]一种波吉卵囊藻培养基配方:NH4N036毫克，K2HP044毫克，尿素2毫克，Na2SiO3.9H205毫克，MgSO4.7H2012毫克，NaHC0340毫克，九二 0植物生长刺激素400国际单位，f/2维生素溶液I毫升，f/2微量元素溶液I毫升,人尿1.5毫升,海泥抽取液2毫升，牛粪浸出液I毫升，羊粪浸出液1.2毫升，土壤抽出液I毫升，消毒海水1000毫升。其中f/2微量元素溶液配方=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010毫克，FeC6H507.5H203.9 克，Na2MoO4.2H207.3 毫克，CoCl2.6H2012 毫克，Na2EDTA4.35 克，纯水1000毫升；f/2维生素溶液配方:维生素B120.5毫克，维生素B1IOO毫克，维生素H0.5毫克，纯水1000毫升。
[0032]一种波吉卵囊藻高密度培养技术，参见附图1，其特征在于包括如下步骤:
[0033]培养容器为家庭用的矿泉水桶，容积约20升，无色透明或带浅天蓝色，洗刷干净，后用蒸馏水润洗3遍，用漏斗装入上述培养基12升，充分摇匀5分钟，选择生命力旺盛、无污染的波吉卵囊藻液进行接种，接种密度15 X 104-20 X 104cell/mL，瓶口插入两根干净玻璃管，一根长58厘米，插入较深，离瓶底5厘米，用以充气；另一根长15厘米，两端露出瓶口即可，用以排气。两根玻璃管同样粗细，直径6毫米。最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干净的透明胶带封口并将两根玻璃管固定。长的玻璃管上端露出瓶口 10-15厘米，用乳胶管或塑料管与空气压缩机或气泵相连，一天24小时连续充气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可。室内培养，空调控温，最佳温度26±2°C，日光灯照射，光照强度10000-120001x，光/暗周期为16L/8D，即光照16小时，黑暗8小时。培养至第6天，停止充气，揭开透明胶带，用漏斗从瓶口加入2升新鲜培养基，胶带重新封口，充气，继续培养，至第10天，密度增加至800 X IO4-1OOO X IO4Cel Ι/mL，从瓶口倒出藻液，将矿泉水桶洗刷干净后，加入中药消毒液消毒10-30分钟，后进入下一轮培养。
[0034]所述中药消毒液:由以下重量比的物质组成:黄芩7~10份、黄秋葵粉3~5份、鱼腥草3~5份、大黄5~10份、甘草5~10份；将上述药材放入可加热的容器中，加入3~5倍体积的纯净水，煮沸后持续煮30~50分钟，后过滤，沉淀I~2小时，后取澄清液即可；所述黄秋葵粉是清洗干净并烘干后的黄秋葵茎叶、花及籽粒经超微粉碎机粉碎至250目，然后搅匀、灭菌所得。
[0035]波吉卵囊藻细胞收集方法
[0036]取新鲜黄泥巴I公斤于塑料水桶中，加入10升蒸馏水，玻璃棒充分搅拌15分钟，后置于黑暗处静置沉淀24小时，取上清液，用网目孔径80-100 μ m的筛絹过滤，除去沉渣后，留下清液，用离心机离心15分钟，转速4500r/min，取上清液，装入棕色磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存，备用。将培养完的藻液按每I升藻液加入250毫升黄泥巴上清液的量加入黄泥巴上清液，充分搅拌30分钟，后置于黑暗处，静置沉淀48小时，98%的藻细胞可沉淀到底部，弃上清液，即得绿色牙膏状藻泥，110°C喷雾干燥法烘干藻泥可得绿色面粉状藻粉，收集完成。
`[0037]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种波吉卵囊藻培养基，其特征在于配方如下:NH4N036毫克，K2HP044毫克，尿素2毫克，Na2SiO3.9H205毫克，MgSO4.7H2012毫克，NaHC0340毫克，九二 O植物生长刺激素400国际单位，f/2维生素溶液I毫升，f/2微量兀素溶液I毫升，人尿1.5毫升,海泥抽取液2毫升，牛粪浸出液I毫升，羊粪浸出液1.2毫升，土壤抽出液I毫升，消毒海水1000毫升；其中f/2微量元素溶液配方:ZnS04.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010毫克，FeC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35 克，纯水1000毫升；f/2维生素溶液配方:维生素B120.5毫克，维生素B1IOO毫克，维生素H0.5毫克，纯水1000毫升。消毒海水制备方法:每I立方米海水中加入漂白液200-300毫升，使海水中有效氯含量达到10-20mg/L，空气压缩机充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止。
2.一种波吉卵囊藻高密度培养方法，其特征在于包括如下步骤: 培养容器为家庭用的矿泉水桶，容积约20升，无色透明或带浅天蓝色，洗刷干净，后用蒸馏水润洗3遍，用漏斗装入上述培养基12升，充分摇匀5分钟，选择生命力旺盛、无污染的波吉卵囊藻液进行接种，接种密度15X 104-20X 104cell/mL，瓶口插入两根干净玻璃管，一根长58厘米，插入较深，离瓶底5厘米，用以充气；另一根长15厘米，两端露出瓶口即可，用以排气。两根玻璃管同样粗细，直径6毫米。最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干净的透明胶带封口并将两根玻璃管固定。长的玻璃管上端露出瓶口 10-15厘米，用乳胶管或塑料管与空气压缩机或气泵相连，一天24小时连续充气，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可。室内培养，空调控温，最佳温度26±2°C，日光灯照射，光照强度10000-120001x，光/暗周期为16L/8D，即光照16小时，黑暗8小时。培养至第6天，停止充气，揭开透明胶带，用漏斗从瓶口加入2升新鲜培养基，胶带重新封口，充气，继续培养，至第10天，密度增加至800 X IO4-1OOO X 104 cell/mL,停止培养，从瓶口倒出藻液，将矿泉水桶洗刷干净后，加入中药消毒液消毒10-30分钟，后进入下一轮培养。 所述中药消毒液:由以下重量比的物质组成:黄芩7~10份、黄秋葵粉3~5份、鱼腥草3~5份、大黄5~10份、甘草5~10份；将上述药材放入可加热的容器中，加入3~5倍体积的纯净水，煮沸后持续煮30~50分钟，后过滤，沉淀I~2小时，后取澄清液即可；所述黄秋葵粉是清洗干净并烘干后的黄秋葵茎叶、花及籽粒经超微粉碎机粉碎至250目，然后搅匀、灭菌所得。
3.根据权利要求2所述的波吉卵囊藻细胞收集方法，其特征在于: 取新鲜黄泥巴I公斤于塑料水桶中，加入10升蒸馏水，玻璃棒充分搅拌15分钟，后置于黑暗处静置沉淀24小时，取上清液，用网目孔径80-100 μ m的筛絹过滤，除去沉渣后，留下清液，用离心机离心15分钟，转速4500r/min，取上清液，装入棕色磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱保存，备用。将培养完的藻液按每I升藻液加入250毫升黄泥巴上清液的量加入黄泥巴上清液，充分搅拌30分钟，后置于黑暗处，静置沉淀48小时，98%的藻细胞可沉淀到底部，弃上清液，即得绿色牙膏状藻泥，110°C喷雾干燥法烘干藻泥可得绿色面粉状藻粉，收集完成。
【文档编号】C12R1/89GK103820325SQ201410073501
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】王培磊 申请人:临沂大学