一种蓝藻细胞破碎方法及装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种蓝藻细胞破碎方法及装置。本发明所提供的蓝藻细胞破碎方法包括如下步骤：(1)将待破碎的蓝藻细胞的藻液进行离心，弃上清，得沉淀；(2)向步骤(1)所得沉淀中加入金刚砂，进行研磨。实验证明，本发明提供的蓝藻细胞破碎方法高效、实用，不仅适合于单细胞蓝藻也适合丝状蓝藻，且将实验室蓝藻细胞破碎由原来的需要数小时缩短到六分钟，细胞破碎率由原来的65％提高到95％以上，而且不影响后续的产物提取及产物活性。这一新方法的建立，将为蓝藻实验室研究及蓝藻工业应用领域解决细胞破碎这一难题，将极大的提高蓝藻研发效率及蓝藻天然产物生产效率。
【专利说明】一种蓝藻细胞破碎方法及装置
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种蓝藻细胞破碎方法及装置。
【背景技术】
[0002]蓝藻(blue-green algae),又称蓝细菌(cyanobacteria),是可以进行放氧光合作用的原核生物。蓝藻广泛分布在淡水、海水甚至是污水中，能够利用CO2和太阳能快速繁殖，是利用CO2生物合成化学品的理想宿主，成为CO2减排及可再生能源领域的研究热点，如在蓝藻中利用CO2生物合成醇类、生物柴油及重要蛋白等化学品。此外，多数蓝藻本身营养丰富，富含重要天然产物，如类胡萝卜素、藻蓝藻蛋白及抗癌药物等。因此，无论是把蓝藻作为生产重要化学品的宿主还是对于其天然产物进行开发；无论是用于菌株改造基因操作的小量DNA、蛋白提取，还是用于天然产物的大量提取及制备，都需要对蓝藻细胞进行破碎。[0003]虽然蓝藻细胞壁化学组成与细菌细胞壁类似，都是以肽聚糖为主，但蓝藻细胞壁为多层结构，分内外两层，内层是纤维素，外层是胶质鞘。这种多层细胞壁结构使传统的细菌破碎方法不适合破碎蓝藻细胞。现有的破碎蓝藻细胞方法主要有反复冻融法、酶裂解法、超声破碎法、玻璃珠研磨法及高压匀浆法等，其中前三种方法只适合小量细胞破碎，研磨法可以用于小量细胞破碎及大量细胞破碎，而高压匀浆法一般只适合大量细胞破碎。但无论是上述哪种方法都存在费时、费力及破碎效率低等问题，如通常要数小时，细胞破碎率不到80%。玻璃珠研磨法虽然比较简便，但由于玻璃珠硬度相当于细胞壁结构复杂的蓝藻及对蓝藻细胞的机械摩擦力不够，使蓝藻细胞破碎效果不理想，通常要结合冻融法使用，使破碎时间大大延长。
[0004]因此，无论是为发展蓝藻利用CO2生物合成化学品而进行的蓝藻基因改造，还是蓝藻天然产物提取都需要开发一种高效、简便的蓝藻细胞破碎方法，而且该方法不仅可用于微量细胞破碎，还可以根据需要任意放大。
【发明内容】
[0005]本发明公开了一种蓝藻细胞破碎方法及装置。
[0006]本发明所提供的蓝藻细胞的破碎方法，具体可包括如下步骤:
[0007](I)将待破碎的蓝藻细胞的藻液进行离心，弃上清，得沉淀；
[0008](2)向步骤⑴所得沉淀中加入金刚砂，进行研磨。
[0009]在所述方法的步骤(1)中，所述离心具体可为4°C 10000_13000g(如1000Og或13000g)离心 2_8min(如 2min 或 8min)。
[0010]在实际操作中，若收集小量细胞，如几毫升，可用13000g离心2min。若收集大量细胞，如几十毫升，可用1000Og离心8min。
[0011]在所述方法的步骤(2)中，所述金刚砂与所述沉淀的质量配比为1:1。
[0012]在所述方法的步骤(2)中，所述进行研磨为:(al)对所述沉淀研磨Imin后置于冰上Imin ； (a2)再重复操作步骤(al)两次。[0013]在所述方法的步骤(1)中，在将所述待破碎的蓝藻细胞的藻液进行离心后，还包括用磷酸盐缓冲液洗涤所述蓝藻细胞的步骤。
[0014]更加具体的，在本发明中，所述蓝藻细胞的破碎方法，包括如下步骤:
[0015](a)将待破碎的蓝藻细胞的藻液置于离心管中，4°C 10000_13000g(如1000Og或13000g)离心2-8min (如2min或8min),弃上清,用磷酸盐缓冲液重悬蓝藻细胞,4°C 13000g离心2-8min (如2min或8min),弃上清,得沉淀；
[0016](b)向步骤(a)所得沉淀中加入金刚砂，所述金刚砂与所述沉淀的质量配比为1:1 ;采用与步骤(a)中所述离心管匹配的研磨棒在所述离心管中按照如下(bl)和(b2)的步骤进行研磨:(bl)对所述沉淀研磨Imin后置于冰上Imin ； (b2)再重复操作步骤(bl)两次。
[0017]在上述方法中，所述待破碎的蓝藻细胞的藻液为将所述待破碎的蓝藻细胞用BG-1l液体培养基进行培养后得到的培养液。
[0018]所述BG-1l液体培养基的配方见表1。
[0019]在上述方法中，所述磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度为:100mM磷酸钾，ρΗ7.5。
[0020]本发明的再一个目的是提供一种用于破碎蓝藻细胞的装置。
[0021]本发明所提供的用于破碎蓝藻细胞的装置，由离心管和研磨棒组成；所述研磨棒包括接触被研磨物的研磨体和手柄；所述研磨体的形状和所述离心管内腔头部(即管底部分)的形状是相匹配的。
[0022]进行所述研磨时，将所述研磨棒插入到所述离心管中，所述研磨体与所述离心管的管底侧壁接触，由所述手柄提供手部拿持(所述研磨棒的长度需大于所述离心管的长度)，通过旋转所述棒体使所述研磨体与所述离心管的管底侧壁产生挤压力，在所述挤压力和所述金刚砂的作用下实现所述蓝藻细胞的破碎。
[0023]更加具体的，在本发明中，所述装置为如下(I)-(III)中任一:
[0024](I)由1.5mL离心管和与之匹配的研磨棒I组成的装置；所述1.5mL离心管为生工生物工程有限公司产品，其产品目录号为ST620-1 ;所述研磨棒为美国Kimble Chase公司产品，其产品目录号为749521-1500。
[0025](II)由50mL离心管和与之匹配的研磨棒2组成的装置；所述50mL离心管为Axygen公司产品，其产品目录号为SCT-50ML-25-S。
[0026](III)由15mL离心管和与之匹配的研磨棒3组成的装置；所述15mL离心管为Axygen公司产品，其产品目录号为SCT-15ML-25-S。
[0027]可根据需要破碎的蓝藻细胞的量，选择如上(I)-(III)中不同规格的装置进行操作。
[0028]本发明的再一个目的是提供一种用于破碎蓝藻细胞的产品。
[0029]本发明所提供的用于破碎蓝藻细胞的产品，由所述装置和金刚砂组成。
[0030]在本发明中，以上所有的所述金刚砂的粒径均可为400目。
[0031]在本发明中，所述金刚砂为Sigma-Aldrich公司产品，其产品目录号为3597391。
[0032] 所述装置(如15ml或50ml的大体积研磨装置)或所述产品在破碎蓝藻细胞中的应用也属于本发明的保护范围。[0033]在本发明中，以上所有的所述蓝藻均可为淡水单细胞蓝藻集胞藻6803、海水单细胞蓝藻聚球藻7002、丝状蓝藻鱼腥藻7120或丝状蓝藻螺旋藻或其它任何一种蓝藻。
[0034]本发明提供了一种高效、稳定的蓝藻细胞破碎方法一金刚砂研磨法。首先本发明的发明人选用金刚砂作为磨料，然后确定了研磨方法，发现用藻泥比用细胞悬浮液好。最后确定了研磨装置，为实现金刚砂微小颗粒与微小细胞间的有效接触与机械研磨，同时避免藻泥在更换研磨器皿时大量损失，本发明的发明人在离心管内对离心收集的藻泥进行原位研磨，购买与1.5mL离心管相匹配的研磨棒。为实现大量细胞破碎，我们设计并定制与15mL和50ml尖底离心管相匹配的研磨棒，实现对小量(毫升)和大量(升)藻细胞的高效破碎。
[0035]另外，现有的玻璃珠研磨法一般用提取缓冲液重悬藻泥，把玻璃珠加入到藻细胞悬浮液中，震荡破碎。而本发明的发明人研究发现，直接研磨藻泥可以实现金刚砂微小颗粒与微小细胞间的有效接触并提高机械研磨力，研磨效果非常好，使实验室蓝藻细胞破碎由需要数小时缩短到六分钟，细胞破碎率由原来的65%提高到95%以上，而且不影响后续的产物提取及产物活性。
[0036]本发明的发明人利用该方法对实验室科学研究有代表性的淡水单细胞蓝藻集胞藻6803、海水单细胞蓝藻聚球藻7002和丝状蓝藻鱼腥藻7120及工业应用上有代表性的丝状蓝藻螺旋藻细胞进行破碎，以细胞破碎所用时间、细胞破碎率及蛋白得率来体现破碎效率。以对基因进行扩增、SDS-PAGE及酶活性测定，来证明该细胞破碎方法不影响后续工作。实验证明，本发明 提供的蓝藻细胞破碎方法高效、实用，不仅适合于单细胞蓝藻也适合丝状蓝藻，这一新方法的建立，将为蓝藻实验室研究及蓝藻工业应用领域解决细胞破碎这一难题，将极大的提高蓝藻研发效率及蓝藻天然产物生产效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为蓝藻细胞破碎装置示意图。
[0038]图2为小量蓝藻细胞破碎DNA提取PCR验证图。其中，MII1:DNA分子量标准(各条带从大到小依次为4500，3000，2000，1200，800，500，200bp) ；S.6803:淡水单细胞蓝藻集胞藻6803 ；S.7002:海水单细胞蓝藻聚球藻7002 ；A.7120:丝状蓝藻鱼腥藻7120。
[0039]图3为小量蓝藻细胞破碎蛋白提取SDS-PAGE蛋白鉴定图。其中，M:蛋白分子量标准；S.6803:淡水单细胞蓝藻集胞藻6803 ；S.7002:海水单细胞蓝藻聚球藻7002 ；A.7120:丝状蓝藻鱼腥藻7120 ；Spirulina:丝状蓝藻螺旋藻。
[0040]图4为大量蓝藻细胞破碎DNA提取PCR验证图。其中，MII1:DNA分子量标准(各条带从大到小依次为4500，3000，2000，1200，800，500，200bp) ；S.6803:淡水单细胞蓝藻集胞藻6803 ；S.7002:海水单细胞蓝藻聚球藻7002 ；A.7120:丝状蓝藻鱼腥藻7120。
[0041]图5为大量蓝藻细胞破碎蛋白提取SDS-PAGE蛋白鉴定图。其中，M:蛋白分子量标准；S.6803:淡水单细胞蓝藻集胞藻6803 ；S.7002:海水单细胞蓝藻聚球藻7002 ；A.7120:丝状蓝藻鱼腥藻7120 ；Spirulina:丝状蓝藻螺旋藻。
【具体实施方式】
[0042]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0044]下述实施例中所用的金刚砂的粒径为400目，具体为Sigma-Aldrich公司产品，其产品目录号为3597391。
[0045]淡水单细胞蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)属于色球藻科、集胞藻属；参考文 Zhang S，Spann KWj et al.1dentification of two genes, sll0804andslrl306，as putative components of the C02-concentrating mechanism in thecyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC6803.J Bacteriol.2008，190:8234-8237。公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0046]海水单细胞蓝藻聚球藻7002 (Synechococcus sp.PCC7002)属于色球藻科、聚球藻属；参考文献:Cantre11 A and Bryant DA.Molecular cloning and nucleotide sequenceof the psaA and psaB genes of the cyanobacterium Synechococcus sp.PCC7002.PlantMol Biol.1987,9:453-468。公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0047]丝状蓝藻鱼腥藻7120 (Anabaena sp.PCC7120)属于念球藻科、鱼腥藻属；参考文献:Wei TFj Ramasubramanian TSj et al.Anabaena sp.strain PCC7120ntcAgene required for growth on nitrate and heterocyst development.JBacteriol.1994，176:4473-4482。公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0048]丝状蓝藻螺旋藻(Spirulina)属于颤藻科、螺旋藻属；参考文献:吴蕾，庞广昌，陈庆森。高压匀浆破碎螺旋藻细胞释放藻蛋白的研究。食品科学.2008，29:43-45。公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0049]下述实施例中，所涉及的BG-1l液体培养基组成见表1。Trace metal mix A5组成见表2。
[0050]表1BG-11液体培养基组成
【权利要求】
1.一种蓝藻细胞的破碎方法，包括如下步骤: (1)将待破碎的蓝藻细胞的藻液进行离心，弃上清，得沉淀； (2)向步骤(1)所得沉淀中加入金刚砂，进行研磨。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，所述离心为10000-13000g离心 2_8min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述金刚砂与所述沉淀的质量配比为1:1。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述进行研磨为:(al)对所述沉淀研磨Imin后置于冰上Imin ； (a2)再重复操作步骤(al)两次。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于: 所述方法包括如下步骤: (a)将待破碎的蓝藻细胞的藻液置于离心管中，10000-13000g离心2-8min，弃上清，用磷酸盐缓冲液重悬蓝藻细胞，13000g离心2-8min,弃上清,得沉淀； (b)向步骤(a)所得沉淀中加入金刚砂，所述金刚砂与所述沉淀的质量配比为1:1 ;采用与所述离心管匹配的研磨棒按照如下(bl)和(b2)的步骤进行研磨:(bl)对所述沉淀研磨Imin后置于冰上Imin ; (b2)再重复操作步骤(bl)两次。
6.一种用于破碎蓝藻细胞的装置，由离心管和研磨棒组成；其特征在于:所述研磨棒包括接触被研磨物的研磨体和手柄；所述研磨体的形状和所述离心管内腔头部的形状是相匹配的。
7.一种用于破碎蓝藻细胞的产品，由权利要求6所述的装置和金刚砂组成。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法或装置或产品，其特征在于:所述金刚砂的粒径为400目。
9.权利要求6所述的装置或权利要求7所述的产品在破碎蓝藻细胞中的应用。
10.根据权利要求1-9中任一所述的方法或装置或产品或应用，其特征在于:所述蓝藻为淡水单细胞蓝藻集 胞藻6803、海水单细胞蓝藻聚球藻7002、丝状蓝藻鱼腥藻7120或丝状蓝藻螺旋藻。
【文档编号】C12R1/89GK103923836SQ201410138661
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】周杰, 张福良, 蒙恒凯, 李寅 申请人:中国科学院微生物研究所