一种含有两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶gpx1突变体及其制备方法
【专利摘要】一种含有两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体及其制备方法，属于生物【技术领域】。先用基因突变或合成法获得突变体基因，再通过营养缺陷型原核表达系统或营养缺陷型和SPP低温联合表达系统，将两个或多个GPX的催化基团SeCys引入到突变体的底物结合部位，结果赋予其高的GPX活性；或者先将靶基因连同SeCys插入序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上，再将SeCys插入序列结合蛋白2组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上，将两种载体共转染同一哺乳细胞株，在亚硒酸钠存在下用哺乳细胞合成GPX。本发明方法简单，突变体活力和产量高、稳定性好，避免包涵体复性造成的产率下降和失活，从而解决天然GPX来源有限和性质不稳定问题。
【专利说明】一种含有两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体及其制备方法
[0001]本专利申请是中国专利“高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体及其制备方法”的分案申请，原申请的申请日为:2013-07-18，原申请的申请号为:201310302778.3，原申请的公布号为:CN103320406A。
【技术领域】
[0002]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种含有两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体及其制备方法。
【背景技术】
[0003]含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基团是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物体内，GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)—起构成了机体抗氧化防御体系。GPX在该体系中发挥着重要的作用，它以底物GSH为还原剂，分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物，因而能清除体内活性氧(R0S)，防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的各种疾病，如衰老、紫外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，还能降解脂质过氧化物，防止细胞过氧化损伤，这种独特的保护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而，由于天然GPX的来源相当有限、稳定性差，致使它的人工产物及其模拟物的研究备受关注。
[0004]小分子模拟物主要有PZ51 (ebSelen)、AL3823A、BXT系列产品，它们的弱点是活力低，仅为天然GPX的千分之一左右。大分子的模拟物主要有抗体酶(中国专利94102481.4和96112628.0)和以谷胱甘肽硫转移酶(GST)为蛋白模板制备的GPX模拟酶，其活力显著高于小分子模拟物。显然，以具有谷胱甘肽(GSH)结合部位的蛋白为模板制备的大分子GPX模拟酶收到了更好的效果，因此开发制备这些高活力的GPX模拟酶制备技术就成了学术界的研究热点，对于分子生物学、生物工程学及医学等领域具有广阔的应用前景。迄今已成功开发的方法有:用化学法(中国专利94102481.4,96112628.0)或营养缺陷型原核表达系统(中国专利200810050556.6)在非GPX类模板蛋白中引入GPX的催化基团硒代半胱氨酸(SeCys)。
[0005]中国专利94102481.4,96112628.0,99104234.4,200810050556.6 公开的各类含
硒抗体酶的制备方法就是应用化学突变(修饰)法在抗体类模板蛋白中引入GPX的催化基团SeCys，有以下缺点:(I)在制备过程中，仅化学突变(修饰)这一步就会损失20_40%的酶蛋白，导致模拟酶产率显著下降；(2)制备模拟酶的周期长，操作繁琐，时间长；(3)在化学突变过程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，这些物质为有毒性的物质；(4)缺乏靶向性，对于大的蛋白分子而言，一次化学反应常在不同位点引入多个非特异性催化基团，因此化学突变引入催化基团无法达到基因突变法那样的专一性。
[0006]中国专利200810050556.6也公开了人源单链含硒抗体酶的另一种制备方法是用营养缺陷型原核表达系统(大肠杆菌)和基因突变法引入催化基团，但其仅限于人源单链含硒抗体酶的制备，不包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)突变体及其它GPX模拟酶的制备方法。具有GPX活性的谷胱甘肽硫转移酶(GST)的制备方法(Yu，H.J.，Liu，J.Q.，Bock,A.，Li, J.，Luo, G.M.，and Shen, J.C.J.Biol.Chem.2005，280，11930-11935)亦见报道，这种方法虽然也采用营养缺陷型原核表达系统和基因突变法引入催化基团，但其仅限于以GST为模板蛋白制备GPX模拟酶，不包括以天然GPX为模板制备GPX突变体。用营养缺陷型原核表达系统在非GPX类模板蛋白中引入催化基团制备模拟酶的方法是将催化基团引入到与GPX有相同底物GSH结合部位的它种蛋白中使其产生GPX活力。
[0007]然而由于这些模板蛋白不具备天然GPX自身的催化基团，因此很难找到理想而准确的催化基团的位置；同时由于这些模板蛋白中也没有象天然GPX那样理想的催化三联体，因此这类模拟酶的催化效率不高。如果以天然GPX为模板用基因工程方法来制备GPX突变体则可克服这些缺点。由于编码GPX的催化基团SeCys的密码子UGA是终止密码子，在普通原核表达系统中，需在GPX基因的开放阅读框内、紧邻SeCys的密码子UGA下游引入颈环结构才能将UGA翻译成SeCys而不是终止密码子，而开放阅读框内颈环的引入必然会引起GPX空间构象的改变，进而影响酶活性。因此普通原核表达系统不适于直接表达具有GPX活性的含硒蛋白。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体及其制备方法。
[0009]应用基因工程技术、细胞培养技术、营养缺陷型原核表达技术和SPP (Singleprotein production,单一蛋白生产)系统低温表达技术制备具有极高GPX活力的GPXl突变体。是用基因工程技术在哺乳动物细胞株或营养缺陷型原核表达系统及其SPP低温表达系统中直接表达具有高酶活性的GPXl突变体蛋白的方法。本方法不需化学修饰即可制备具有极高GPX活力的新型人工酶。本发明方法在生物制药方面具有广阔的应用前景。
[0010]本发明以人GPXl (参见NCBI，NM_000581.2)为模板，通过计算机模拟和定点突变，得到一种新型的高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体，其由203个氨基酸组成，与人GPXl相比较，其不含有半胱氨酸，具有更高的GPX活力和更好的稳定性，其是将GPXl中所有半胱氨酸突变成丝氨酸，但第49位仍然是硒代半胱氨酸(SeCys，单字母缩写为U，序列表中写成Xaa)。所述的GPXl突变体的氨基酸序列(SEQ ID No:1)如下所示:
[0011]MSAARLAAAAAAAQSVYAFSARPLAGGEPVSLGSLRGKVLLIENVASLUGTTVRDYTQMN ELQRRLGPRGLVVLGFPSNQFGHQENAKNEEILNSLKYVRPGGGFEPNFMLFEKSEVNGAGAHP LFAFLREALPAPSDDATALMTDPKLITWSPVSRNDVAWNFEKFLVGPDGVPLRRYSRRFQTIDIEP DIEALLSQGPSSA
[0012]进一步，所述的GPXl突变体的具体氨基酸序列还包括，将上述氨基酸序列中任何一个或多个丙氨酸(Ala)突变为丝氨酸(Ser)所形成的任何一个新型GPXl突变体。比如将87位丙氨酸(Ala)突变为丝氨酸(Ser)，所形成的序列为SEQ ID No:2 (实施例9)。
[0013]进一步，所述的GPXl突变体的具体氨基酸序列还包括，将上述氨基酸序列中第2、78、115、156、202位5个丝氨酸的任何一个或多个被硒代半胱氨酸取代后所形成的任何一个新型GPXl突变体。比如第2位丝氨酸被硒代半胱氨酸(序列表中写成Xaa)取代后所形成的序列SEQ ID No:3 (实施例10)。[0014]进一步，所述的GPXl突变体的具体氨基酸序列还包括，由于使用了便于靶蛋白纯化的pColdl (TAKARA公司)等分泌型原核或真核表达载体而在上述氨基酸序列的氨基端或羧基端引入该载体上的组氨酸纯化标签和其它的氨基酸等所形成的任何一个新型GPXl突变体。比如在序列SEQ ID No:USEQ ID No:2和SEQ ID No: 3的氨基端引入pCo IdKTAKARA公司)原核表达载体的组氨酸纯化标签和凝血因子Xa切割位点的氨基酸后所形成的序列SEQ ID No:4, SEQ ID No:5 和 SEQ ID No:6 (实施例 11)。
[0015]本发明的制备高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体的方法，具体包括如下方法:
[0016]方法1:
[0017]先合成靶基因并组装到分泌型原核表达载体上或先将GPXl基因组装到分泌型原核表达载体上，用基因突变(或氨基酸替换)法获取靶基因，再通过营养缺陷型原核表达系统或通过营养缺陷型原核和SPP低温联合表达系统，将GPX的催化基团硒代半胱氨酸(SeCys)引入到GPXl突变体的底物结合部位，因而在该蛋白上既有GPX的底物结合部位，又有GPX的催化基团和催化三联体，结果赋予其极高的GPX的活性，就产生了高活力的谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体。方法2:[0018]或先将编码GPXl突变体的基因连同硒代半胱氨酸插入序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上，再将硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2 (SBP2)组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上，将两种载体共转染同一哺乳类细胞株，然后用筛选得到的同时含有GPXl突变体和SBP2两种基因的阳性细胞株制备GPXl突变体蛋白，就在体外产生了高活力的基因工程谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体，从而解决天然GPX来源有限的问题。
[0019]本发明的具体制备步骤:
[0020]本发明的第一种方法是先在生物公司用DNA合成仪人工合成能够表达本发明所述的GPXl突变体蛋白的基因，确保基因中不含ACA序列，再用单一蛋白生产系统和营养缺陷型原核表达系统联合制备GPXl突变体蛋白。
[0021]I)、表达载体的构建:根据本发明所述GPXl突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达GPXl突变体蛋白的基因，确保靶基因的5'端含有起始密码子(ATG)，3'端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保靶基因的49位硒代半胱氨酸(SeCys)的编码序列替换为半胱氨酸(Cys)的密码子(可以是TGC等)，且基因全长不含有ACA序列；具体的基因序列可以是将GPXl基因(参见NCBI,NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子，第49位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的密码子，并根据密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，将基因中所有的ACA序列全部替换为非ACA序列所得到的编码基因，也可以是其它任何一种能在营养缺陷型菌株中表达GPXl突变体蛋白，且全长不含有ACA序列的编码基因(由于密码子的简并性，同一氨基酸序列可以有多种不同的编码基因)；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPXl突变体基因和分泌型原核表达载体(如PCold系列等)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl突变体基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPXl突变体基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；[0022]2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化:
[0023]用步骤I)中构建的含有GPXl突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将含有表达核酸内切酶MazF的pMazF (TAKARA, Cat#3367)质粒转化阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经IPTG低温4-25°C诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密码子合成SeCys，直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPXl突变体，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，透析冻干后即得GPXl突变体蛋白纯品。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定目标蛋白。[0024]该方法通过低温下诱导营养缺陷型原核表达系统在GPXl突变体的底物结合部位引入了催化基团，因而产生高活力的GPXl突变体。
[0025]所述的用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，是用pH7.5,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含lOmmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。
[0026]所述的将液体低温离心，可以在4°C，8000_12000g离心15_30min。
[0027]本发明的第二种方法是先扩增GPXl基因，然后以其为模板，用基因突变法获得能表达本发明所述的GPXl突变体蛋白的基因，并在保证其氨基酸序列不变的前提下突变掉基因中的ACA序列，获得不含ACA的GPXl突变体基因，再用单一蛋白生产系统和营养缺陷型原核表达系统联合制备GPXl突变体蛋白。
[0028]I)、表达载体的构建:
[0029]根据基因文库中公开的GPXl的基因序列(参见NCBI，NM_000581.2)设计引物，扩增其编码基因，在设计引物时，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)，3'端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保第2和202位Cys的密码子替换成Ser的密码子，其它氨基酸序列不变；用相同的限制性核酸内切酶切割载体和靶基因后，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl基因组装到分泌型原核表达载体上(如pCold系列等);在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPXl中要突变为半胱氨酸的49位硒代半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在原核表达载体上的GPXl基因中的硒代半胱氨酸的编码序列突变成半胱氨酸的密码子；同理，用上述定点突变的方法在确保不引入ACA序列的前提下，将GPXl基因中的其它半胱氨酸的编码序列突变成丝氨酸的密码子，再根据密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，将GPXl基因中所有ACA序列突变掉；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能在营养缺陷型菌株中表达本发明所述的GPXl突变体蛋白；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
[0030]2)阳性转化子的筛选及突变体蛋白的表达与纯化
[0031]用步骤I)中构建的含有GPXl突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含半胱氨酸的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将表达核酸内切酶MazF的质粒pMazF转化阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有硒代半胱氨酸、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β -D-半乳糖苷低温4-25°C诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用半胱氨酸的密码子合成硒代半胱氨酸，直接表达出在底物谷胱甘肽的结合部位含有硒代半胱氨酸的重组GPXl突变体，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得含GPXl突变体的上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPX，透析冻干后即得酶蛋白纯品。
[0032]该方法通过低温下诱导营养缺陷型原核表达系统联合SPP单一蛋白生产系统在GPXl突变体的底物结合部位引入了催化基团，因而产生高活力的GPXl突变体蛋白。
[0033]所述的用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含lOmmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。
[0034]所述的将液体低温离心，可以在4°C，8000_12000g离心15_30min。
[0035]本发明的第三种方法是先在生物公司用DNA合成仪人工合成能够表达本发明所述的GPXl突变体蛋白基因，再用营养缺陷型原核表达系统制备GPXl突变体蛋白。
[0036]1)、表达载体的构建:
[0037]根据本发明所述GPXl突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达GPXl突变体蛋白的基因，确保靶基因的5'端含有起始密码子(ATG)，3,端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保靶基因的49位硒代半胱氨酸(SeCys)的编码序列替换为半胱氨酸(Cys)的密码子(可以是TGC等)；具体的基因序列可以是将GPXl基因(参见NCBI，NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子，第49位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的密码子所得到的编码基因，也可以是其它任何一种能在营养缺陷型菌株中表达GPXl突变体蛋白的编码基因(由于密码子的简并性，同一氨基酸序列可以有多种不同的编码基因)；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPXl突变体基因和分泌型原核表达载体(如PCold系列等)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl突变体基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有而GPXl突变体基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
[0038]2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化:
[0039]用步骤I)中构建的含有GPXl突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)诱导，营养缺陷型菌株_BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，最后直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPXl突变体蛋白，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，透析冻干后即得GPXl突变体蛋白纯品。
[0040]该方法通过基因突变和营养缺陷型原核表达系统在GPXl突变体的底物结合部位引入了催化基团，因而产生高活力的GPXl突变体蛋白。
[0041]所述的用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，是用pH7.5,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含lOmmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。
[0042]所述的将液体低温离心，可以在4°C，8000_12000g离心15_30min。
[0043]本发明的第四种方法是先扩增GPXl基因，然后以其为模板，用基因突变法获得能表达本发明所述的GPXl突变体蛋白的基因，再用营养缺陷型原核表达系统制备GPXl突变体蛋白。
[0044]I)、表达载体的构建:
[0045]根据基因文库中公开的GPXl的基因序列(参见NCBI，NM_000581.2)设计引物，扩增其编码基因，在设计引物时，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)，3'端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保第2和202位Cys的密码子替换成Ser的密码子，其它氨基酸序列不变；用相同的限制性核酸内切酶切割载体和靶基因后，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl基因组装到分泌型原核表达载体上(如pCold系列等);在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPXl中要突变为半胱氨酸(Cys)的49位SeCys和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp ;用定点突变引物和快速定点突变试剂盒(InvitiOgen公司，按试剂盒说明书操作)，将构建在原核表达载体上的GPXl基因中的SeCys的编码序列突变成Cys的密码子(比如TGC);同理，用上述定点突变的方法将GPXl基因中的其它半胱氨酸的编码序列突变成丝氨酸的密码子；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能在营养缺陷型菌株中表达本发明所述的GPXl突变体蛋白；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
[0046]2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化:
[0047]用步骤I)中构建的含有GPXl突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)诱导，营养缺陷型菌株_BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，最后直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPXl突变体蛋白，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，透析冻干后即得GPXl突变体蛋白纯品。
[0048]该方法通过基因突变和营养缺陷型原核表达系统在GPXl突变体的底物结合部位引入了催化基团，因而产生高活力的GPXl突变体蛋白。
[0049]所述的 用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，是用pH7.5,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含lOmmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。
[0050]所述的将液体低温离心，可以在4°C，8000-12000g离心15_30min。
[0051]第五种方法:用合成的靶基因和哺乳细胞表达系统制备GPXl突变体蛋白[0052]I)、表达载体的构建:
[0053]根据本发明所述的GPXl突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成GPXl突变体的编码基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和特定的酶切位点，3'端在终止密码子下游引入GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI，NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位点；具体的基因序列可以是将GPXl基因(参见NCBI，NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子所得到的编码基因，也可以是其它任何一种编码GPXl突变体蛋白的基因(由于密码子的简并性，同一氨基酸序列可以有多种不同的编码基因)，但靶基因的3'端必须含有GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI，NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS);用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPXl突变体基因和哺乳类细胞表达载体(如pSecTag2A等，Invitrogen公司),再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl突变体基因连同其3'端非翻译区或硒代半胱氨酸插入序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；根据基因文库中硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2 (SBP2，见NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512个氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成仪人工合成其编码基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和特定的酶切位点，3'端含有终止密码子和特定的酶切位点，用特定的酶切位点将SBP2基因组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
[0054]2)、阳性细胞株的筛选:
[0055]用含有SBP2和GPXl突变体基因的载体在转染试剂的介导下共转染哺乳类细胞，用两个载体上的抗性基因通过抗生素浓度从高到低逐级递减法筛选兼具两种抗性的阳性细胞克隆，再用多孔培养板逐级放大培养阳性克隆，最终获得同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的阳性细胞株；检测GPXl突变体蛋白的表达量并筛选靶蛋白表达量高的细胞株；
[0056]3)、靶蛋白的表达与纯化:
[0057]在摇瓶中将同时表达两种外源蛋白的细胞株放大培养，在含有亚硒酸钠的培养基里用哺乳类细胞表达GPXl突变体，酶蛋白以可溶性形式分泌到培养基里，用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，透析冻干后即得酶蛋白纯品。
[0058]所述的检测GPXl突变体蛋白的表达量，可以用抗GPXl的多克隆抗体和ELISA或GPX活力测定技术进行检测；
[0059]所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含lOmmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。
[0060]本发明的第六种方法是分步用含有SBP2基因的载体和含有GPXl突变体基因的载体转染同一哺乳类细胞。
[0061]1)、表达载体的构建:
[0062]根据本发明所述的GPXl突变体的氨基酸序列在生物公司用DNA合成仪人工合成GPXl突变体的编码基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和特定的酶切位点，3'端在终止密码子下游引入GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI，NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位点；具体的基因序列可以是将GPXl基因(参见NCBI，NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子所得到的编码基因，也可以是其它任何一种编码GPXl突变体蛋白的基因(由于密码子的简并性，同一氨基酸序列可以有多种不同的编码基因)，但靶基因的3'端必须含有GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI，NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS);用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPXl突变体基因和哺乳类细胞表达载体(如pSecTag2A等，Invitrogen公司),再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl突变体基因连同其3'端非翻译区或硒代半胱氨酸插入序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；根据基因文库中硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2 (SBP2，见NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512个氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成仪人工合成其编码基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和特定的酶切位点，3'端含有终止密码子和特定的酶切位点，用特定的酶切位点将SBP2基因组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
[0063]2)、阳性细胞株的筛选:
[0064]先用含有SBP2基因的载体转染哺乳类细胞，通过该载体上的抗性基因筛选稳定表达SBP2的细胞株。再用含有GPXl突变体基因的载体转染稳定表达SBP2的细胞株，用两个载体上的抗性基因筛选同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的细胞株；检测GPXl突变体蛋白的表达量并筛选靶蛋白表达量高的细胞株；
[0065]3)、靶蛋白的表达与纯化:
[0066]在摇瓶中将同时表达两种外源蛋白的细胞株放大培养，在含有亚硒酸钠的培养基里用哺乳类细胞表达GPXl突变体，酶蛋白以可溶性形式分泌到培养基里；用谷胱甘肽亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，透析冻干后即得酶蛋白纯品。
[0067]在阳性细胞株的筛选中，所述的阳性细胞株的筛选，也可先转染GPXl突变体基因，后转染SBP2基因，再用两个载体上的抗性基因筛选同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的细胞株。所述的检测GPXl突变体蛋白的表达量，可以用抗GPXl的多克隆抗体和ELISA或GPX活力测定技术进行检测。
[0068]所述的用谷胱甘肽亲和层析纯化GPXl突变体，是用ρΗ7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含lOmmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。
[0069]第七 种方法:用扩增的靶基因和哺乳细胞表达系统制备GPXl突变体蛋白
[0070]I)、表达载体的构建:
[0071]根据基因文库中GPXl基因序列(参见NCBI，NM_000581.2)设计引物扩增GPXl的编码基因及其3'端非翻译区的碱基序列，在设计引物时，确保靶基因的5'端含有起始密码子(ATG)和特定的酶切位点，靶基因的3'端在终止密码子下游引入GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI, NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位点，确保第2位Cys的密码子替换成Ser的密码子，其它氨基酸序列不变；用相同的限性核酸内切酶切割两端有特定酶切位点的靶基因和哺乳类细胞表达载体(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl基因连同其3'端非翻译区组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPXl中要突变为丝氨酸的半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在真核表达载体上的GPXl基因中的全部半胱氨酸的编码序列突变成丝氨酸的密码子；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能编码本发明所述的GPXl突变体蛋白。根据基因文库中硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2 (SBP2，见NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512个氨基酸的基因序列设计引物扩增其编码基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和特定的酶切位点，端含有终止密码子和特定的酶切位点；同样经酶切连接后用特定的酶切位点将SBP2基因组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；
[0072]2)、阳性细胞株的筛选:[0073]用含有SBP2和GPXl突变体基因的载体在转染试剂的介导下共转染哺乳类细胞，用两个载体上的抗性基因通过抗生素浓度从高到低逐级递减法筛选兼具两种抗性的阳性细胞克隆，再用多孔培养板逐级放大培养阳性克隆，最终获得同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的阳性细胞株；检测GPXl突变体蛋白的表达量并筛选靶蛋白表达量高的细胞株；
[0074]3)、靶蛋白的表达与纯化:
[0075]在摇瓶中将同时表达两种外源蛋白的细胞株放大培养，在含有亚硒酸钠的培养基里用哺乳类细胞表达GPXl突变体，酶蛋白以可溶性形式分泌到培养基里，用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，透析冻干后即得酶蛋白纯品。
[0076]所述的检测GPXl突变体蛋白的表达量，可以用抗GPXl的多克隆抗体和ELISA或GPX活力测定技术进行检测；
[0077]所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含lOmmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。
[0078]本发明的第八种方法是分步用含有SBP2基因的载体和含有GPXl突变体基因的载体转染同一哺乳类细胞。
[0079]I)、表达载体的构建:
[0080]根据基因文库中GPXl基因序列(参见NCBI, NM_000581.2)设计引物扩增GPXl的编码基因及其3'端非翻译区的碱基序列，在设计引物时，确保靶基因的5'端含有起始密码子(ATG)和特定的酶切位点，靶基因的3'端在终止密码子下游引入GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI, NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位点，确保第2位Cys的密码子替换成Ser的密码子，其它氨基酸序列不变；用相同的限性核酸内切酶切割两端有特定酶切位点的靶基因和哺乳类细胞表达载体(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl基因连同其3'端非翻译区组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPXl中要突变为丝氨酸的半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在真核表达载体上的GPXl基因中的全部半胱氨酸的编码序列突变成丝氨酸的密码子；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能够编码本发明所述的GPXl突变体蛋白。根据基因文库中硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2 (SBP2，见NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512个氨基酸的基因序列设计引物扩增其编码基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和特定的酶切位点，端含有终止密码子和特定的酶切位点；同样经酶切连接后用特定的酶切位点将SBP2基因组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；[0081]2)、阳性细胞株的筛选:
[0082]先用含有SBP2基因的载体转染哺乳类细胞，通过该载体上的抗性基因筛选稳定表达SBP2的细胞株；再用含有GPXl突变体基因的载体转染稳定表达SBP2的细胞株，用两个载体上的抗性基因筛选同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的细胞株；检测GPXl突变体蛋白的表达量并筛选靶蛋白表达量高的细胞株；
[0083]3)、靶蛋白的表达与纯化:
[0084]在摇瓶中将同时表达两种外源蛋白的细胞株放大培养，在含有亚硒酸钠的培养基里用哺乳类细胞表达GPXl突变体，酶蛋白以可溶性形式分泌到培养基里；用谷胱甘肽亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，透析冻干后即得酶蛋白纯品。
[0085]在阳性细胞株的筛选中，所述的阳性细胞株的筛选，也可先转染GPXl突变体基因，后转染SBP2基因，再用两个载体上的抗性基因筛选同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的细胞株。所述的检测GPXl突变体蛋白的表达量，可以用抗GPXl的多克隆抗体和ELISA或GPX活力测定技术进行检测。
[0086]所述的用谷胱甘肽亲和层析纯化GPXl突变体，是用ρΗ7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含lOmmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。
[0087]本发明的第九种方法与第一种方法完全相同，只是合成GPXl突变体的编码基因时将第87位丙氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子，最后获得的GPXl突变体蛋白的第87位是丝氨酸(SEQ ID No:2)，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列与第一种方法完全相同。
[0088]本发明的第十种方法与第一种方法完全相同，只是合成GPXl突变体的编码基因时将第二位丝氨酸的编码序列替换为半胱氨酸的密码子，最后获得的GPXl突变体蛋白的第二位是硒代半胱氨酸(SEQ ID No: 3)，而不是丝氨酸，其它氨基酸序列与第一种方法完全相同。
[0089]本发明的第十一种方法与第一种方法完全相同，只是由于使用了便于靶蛋白纯化的pColdl (TAKARA公司)等分泌型原核或真核表达载体而在靶蛋白的氨基端或羧基端引入该载体上的组氨酸纯化标签和其它的氨基酸等所形成的任何一个新型GPXl突变体。比如在序列 SEQ ID No: K SEQ ID No:2, SEQ ID No:3 的氨基端引入 pColdl (TAKARA 公司)原核表达载体的组氨酸纯化标签和凝血因子Xa切割位点的氨基酸后所形成的序列SEQ IDNo:4, SEQ ID No:5, SEQ ID No:6。本发明具有以下特点:
[0090]⑴本发明使用简单的基因合成或扩增、基因突变和表达等基因工程技术，制备方法简单。
[0091]⑵本发明方法制备的GPXl突变体蛋白活力高，已超过天然GPX活力的一个数量级，细胞生物学实验已证实对过氧化氢损伤的心肌细胞有更强的保护作用。
[0092]⑶本发明所述的GPXl突变体蛋白具有超强的稳定性，不易失活，这一特性弥补了天然GPX的缺陷。
[0093]⑷本发明使用的分泌型表达载体，能将GPXl突变体蛋白以可溶性形式表达并分泌到大肠杆菌的周质腔或哺乳类细胞的体外，引导蛋白分泌表达的前导信号肽由菌体或细胞自动切除，所表达的蛋白为可溶性，具有天然蛋白的空间构象和更高的活性，不需复性，可避免包涵体复性过程造成的产率下降和失活，因而生产周期短。[0094](5)本发明使用的SPP低温表达系统能利用MazF蛋白酶特异性识别并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌体只能合成编码基因中无ACA序列的蛋白质，因此新合成的蛋白主要是外源蛋白，从而提高产率和Cys向SeCys的转化率，因此具有活力高、产率高的双重优势。
[0095](6)本发明所用的真核表达直接使用GPX自身的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)，不需另外引入SECIS进入表达载体，因而操作简单且可用常规真核表达载体实施。
[0096]这些优点均有利于大规模生产，为今后的实际应用打下了坚实的基础，解决了天然GPX来源不足、性质不稳定和活力低的问题，在生物制药方面有广阔的应用前景。
[0097]说明书附图
[0098]图1:纯化得到的GPXl突变体蛋白的SDS-PAGE (上)和Western blot (下)结果:其中M是蛋白分子量Marker，1-11泳道是实施例1~11制备的靶蛋白。
【具体实施方式】
[0099]实施例1:用合成的基因联合SPP和营养缺陷型原核表达系统制备基因工程人GPXl突变体蛋白
[0100]根据本发明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突变体蛋白的基因，确保GPXl突变体基因的5/端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，
端含有终止密码子和Hind III酶切位点，GPXl突变体基因的第49号SeCys的编码序列TGA替换为Cys的密码子(TGC)，且基因全长不含有ACA序列；具体的靶基因序列是将GPXl基因(参见NCBI，NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密码子替换为丝氨酸的编码序列(依次是:AGT、AGC、AGC、AGT、AGT)，第49位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的编码序列(TGC)，并将基因中第168、537、561和573号碱基C全部替换为T所得到的不含有ACA序列的GPXl突变体基因，确保该基因能编码本发明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突变体蛋白，且靶基因的5/端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3/端含有终止密码子和Hind III酶切位点；用限制性核酸内切酶Nde I和Hind III双酶切后，连接到同样酶切的pCold III (TAKARA，Cat.#3369)载体上。
[0101]用装有GPXl突变体基因的载体(pCold II1-GPXl突)转化营养缺陷型大肠杆菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株。再将表达核酸内切酶MazF的质粒pMazF (TAKARA, Cat.#3369)转化到该阳性菌株中。将菌液均匀涂布在含100 μ g/mLAmp>25 μ g/mL Kana和25 μ g/mL的M9-CAA固体培养基中筛选阳性转化子。将阳性转化子接种于1.2L M9缺陷表达培养基(在M9培养基中加入100 μ g/ml氨苄青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50μg/ml Cys和除了 Cys之外的19种氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600为0.5。将菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷却，之后将菌液置于15°C中继续振荡培养45min。15°C 5000rpm离心5min,弃上清。用0.9%NaCl重悬菌体沉淀，15°C 5000rpm离心5min,弃上清，重复该步骤。然后用生产培养基(在M9培养基中加入除了 Cys之外的19种氨基酸各50-400 μ g/ml)重悬菌体，加入终浓度为lmmol/L IPTG和终浓度为200 μ g/mL SeCys, 15°C振荡培养16-72h，使GPXl突变体蛋白以可溶性形式表达在菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达。收集菌体(6000rpm，IOmin)并用等体积的 bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆两次。用 BufferT 重悬菌体沉淀，加入终浓度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超声破碎菌体，4°C，12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，将上清液加入GSH亲合柱上，用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用lOmmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得人GPXl突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为24.2kDa，且与抗GPXl抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第I泳道。其GPX活力为21786U/ym0l，超过天然GPX 一个数量级。
[0102]本实施例使用的SPP低温表达系统能利用MazF蛋白酶特异性识别并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌体只能合成编码基因中无ACA序列的蛋白质，因此新合成的蛋白主要是外源重组蛋白，从而提高产率和Cys向SeCys的转化率，因此具有高活高产双重优势。
[0103]实施例2:用基因扩增及突变法和SPP联合营养缺陷型原核表达系统制备基因工程人GPXl突变体蛋白
[0104]用mRNA 小量提取试剂盒(Sigma, Cat#MRN_10)从人 H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌细胞中提取mRNA，在逆转录酶(AMV RT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通过RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)将其转录成cDNA。根据基因文库中公开的人GPXl的基因(参见NCBI，NM_000581.2)序列设计引物扩增其编码基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3'端含有终止密码子和Hind III酶切位点，并将第2和202号Cys的密码子替换成Ser的密码子，其它氨基酸序列不变；具体的5'端引物是5’ -GGAATTCCATATGAGTGCTGCT CGGC-3 ’，3 '端引物是 5 ’ -CCCAAGCTTCTAGGCACTGCTGGGC-3 ’。用限制性核酸内切酶Nde I和Hind III双酶切后，用DNA连接酶连接到同样酶切的pCold III(TAKARA, Cat.#3369)载体上。在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据49号SeCys比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，引物长25-50bp，以49号SeCys的密码子(TGA)为中心，正义引物的序列是5’ -GAATGTGGCGTCCCTCTGCGGCACCACGGTCCGGGAC-3’。用这两条完全互补的引物和快速定点突变试剂盒(InvitiOgen公司，按试剂盒说明书操作)，将构建在原核表达载体pCold III上的GPXl基因的第49号SeCys的编码序列TGA突变成Cys的密码子(TGC)，通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生。用同样方法将人GPXl基因中其它所有Cys的密码子突变成Ser的密码子；对应的正义引物分别是:C78S5’ -GTGCTCGGCTTCCCGAGCAACCAGITTGGGC-3’，C115S5’ -CATGCTCTTCGAGAAGAGCGAGGTGAACGGTGC-3’，C156S5’ -CACCTGGTCTCCGGTGAGTCGCAACGATGTTGC-3’。最后在保持GPXl突变体氨基酸序列不变的前提下突变掉基因中所有ACA序列，即将第168、537、561和573号碱基C全部突变为T，共用3条引物，其正义序列分别是5’-CACGGTCCGGGACTATACCCAGATGAACGAG-3’，5’-CCCCTACGCAGGTATAGCCGCCGCTTCC-3’，5’-CGCTTCCAGACCATTGATATCGAGCCTGATATCGAAGCCCTGCTGTC-3’;通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能编码本发明序列I (Seql)所述的GPXl突变体蛋白。
[0105]用装有GPXl突变体基因的载体(pCold II1-GPXl突)转化营养缺陷型大肠杆菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株。再将表达核酸内切酶MazF的质粒pMazF (TAKARA, Cat.#3369)转化到该阳性菌株中。将菌液均匀涂布在含100 μ g/mLAmp>25 μ g/mL Kana和25 μ g/mL的M9-CAA固体培养基中筛选阳性转化子。将阳性转化子接种于1.2L M9缺陷表达培养基(在M9培养基中加入100 μ g/ml氨苄青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19种氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600为0.5。将菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷却，之后将菌液置于15°C中继续振荡培养45min。15°C 5000rpm离心5min,弃上清。0.9%NaCl重悬菌体沉淀，15°C 5000rpm离心5min,弃上清，重复该步骤。然后用生产培养基(在M9培养基中加入除了 Cys之外的19种氨基酸各50-400 μ g/ml)重悬菌体，加入终浓度为lmmol/L IPTG和终浓度为200 μ g/mL SeCys, 15°C振荡培养16-72h，使GPXl突变体蛋白以可溶性形式表达在菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达。收集菌体(6000rpm，IOmin)并用等体积的 bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆两次。用 BufferT 重悬菌体沉淀，加入终浓度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超声破碎菌体，4°C，12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，将上清液加入GSH亲合柱上，用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用lOmmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得人GPXl突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为24.2kDa，且与抗GPXl抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第2泳道。其GPX活力为21560U/ymOl，超过天然GPX 一个数量级。
[0106]本实施例使用的SPP低温表达系统能利用MazF蛋白酶特异性识别并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌体只能合成编码基因中无ACA序列的蛋白质，因此新合成的蛋白主要是外源重组 蛋白，从而提高产率和Cys向SeCys的转化率，因此具有高活高产双重优势。
[0107]实施例3:用合成的基因和营养缺陷型原核表达系统制备基因工程人GPXl突变体蛋白
[0108]根据本发明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达序列1(SEQ ID No:1)所述的GPXl突变体蛋白的基因，确保GPXl突变体基因的5'端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3'端含有终止密码子和Hind III酶切位点，GPXl突变体基因的第49号SeCys的编码序列TGA替换为Cys的密码子(TGC);具体的靶基因序列是将GPXl基因(参见NCBI, NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密码子替换为丝氨酸的编码序列(依次是:AGT、AGC、AGC、AGT、AGT)，第49位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的编码序列(TGC)所得到的能编码本发明序列I (SEQ ID No:l)所述的GPXl突变体蛋白的基因，且靶基因的5'端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3'端含有终止密码子和Hind III酶切位点；用限制性核酸内切酶Nde I和HindIII双酶切后，连接到同样酶切的pCold III(TAKARA, Cat.#3369)载体上。
[0109]用装有GPXl突变体基因的载体(pCold II1-GPXl突)转化营养缺陷型大肠杆菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的营养琼脂平板，筛选阳性转化子。将阳性转化子接种于1.2L M9缺陷表达培养基(在M9培养基中加入100 μ g/ml氨苄青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19种氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600为0.1，培养至0D600约为0.3-1，加入终浓度0.1-1mM的IPTG，IOmin后加入终浓度10 μ g/ml的氯霉素。加入氯霉素五分钟后培养液离心，低温6000rpm离心5分钟，用冰浴的生理盐溶液洗两次，每次用1.2L，然后用生产培养基(在M9培养基中加入除了 Cys之外的19种氨基酸各50-400 μ g/ml)重悬，并向培养基中补充终浓度400 μ g的利福平和600 μ M SeCys。继续培养2_12h，使GPXl以可溶性形式表达在菌体的周质腔里。收集菌体(6000rpm, IOmin)并用等体积的bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆两次。用 BufferT 重悬菌体沉淀，加入终浓度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超声破碎菌体，4°C，12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，将上清液加入GSH亲合柱上，用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用lOmmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得人GPXl突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为24.2kDa，且与抗GPXl抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第3泳道。其GPX活力为5320υ/μ mol，达到天然GPX的数量级水平。
[0110]营养缺陷型大肠杆菌BL21 (DE3) Cys来源于题目为“Structure of theCathelicidin Motif of Protegrin_3Precursor: Structural Insights into theActivation Mechanism of an Antimicrobial Protein，，的文章，2002年发表在Structure第10卷，1363 - 1370页。该菌种的获取可以由文章作者或August Bock教授赠予。
[0111]实施例4:用基因扩增及突变法和营养缺陷型原核表达系统制备基因工程人GPXl突变体蛋白
[0112] 用mRNA 小量提取试剂盒(Sigma, Cat#MRN_10)从人 H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌细胞中提取mRNA，在逆转录酶(AMV RT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通过RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)将其转录成cDNA。根据基因文库中公开的人GPXl的基因(参见NCBI，NM_000581.2)序列设计引物扩增其编码基因，确保基因的5 '端含有起始密码子(ATG)和Nde I酶切位点，3'端含有终止密码子和Hind III酶切位点，并将第2和202号Cys的密码子替换成Ser的密码子，其它氨基酸序列不变；具体的5'端引物是5’ -GGAATTCCATATGAGTGCTGCTCGGC-3 ’，3 '端引物是 5 ’ -CCCAAGCTTCTAGGCACTGCTGGGC-3，。用限制性核酸内切酶Nde I和Hind III双酶切后，用DNA连接酶连接到同样酶切的pColdIII (TAKARA，Cat.#3369)载体上。在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据49号SeCys比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，引物长25_50bp，以49号SeCys的密码子(TGA)为中心。用这两条完全互补的引物和快速定点突变试剂盒(Invitrogen公司，按试剂盒说明书操作)，将构建在原核表达载体pCold III上的GPXl基因的第49号SeCys的编码序列TGA突变成Cys的密码子(TGC)，通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，用同样方法将人GPXl基因中其它所有Cys的编码序列突变成Ser的密码子，将87位Ala的编码序列突变为Ser的密码子(TCC)，对应的正义引物分别是:C78S5，-GTGCTCGGCTTCCCGAGCAACCAGTTTGGGC-3，，C115S5，-CATGCTCTTCGAGAAGAGCGAGGTGAACGGTGC-3’，C156S5’ -CACCTGGTCTCCGGTGAGTCGCAACGATGTTGC-3’ 和 A87S5’ -GTTTGGGCATCAGGAGAACTCCAAGAACGAAGAGATTC-3’。通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能编码本发明序列2 (SEQ ID No:2)所述的GPXl突变体蛋白。
[0113]用装有GPXl突变体基因的载体(pCold II1-GPXl突)转化营养缺陷型大肠杆菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的营养琼脂平板，筛选阳性转化子。将阳性转化子接种于1.2L M9缺陷表达培养基(在M9培养基中加入100 μ g/ml氨苄青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19种氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600为0.1，培养至0D600约为0.3-1，加入终浓度0.1-1mM的IPTG，IOmin后加入终浓度10 μ g/ml的氯霉素。加入氯霉素五分钟后培养液离心，低温6000rpm离心5分钟，用冰浴的生理盐溶液洗两次，每次用1.2L，然后用生产培养基(在M9培养基中加入除了 Cys之外的19种氨基酸各50-400 μ g/ml)重悬，并向培养基中补充终浓度400 μ g的利福平和600 μ M SeCys。继续培养2_12h，使GPXl以可溶性形式表达在菌体的周质腔里。收集菌体(6000rpm, IOmin)并用等体积的bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆两次。用 BufferT 重悬菌体沉淀，加入终浓度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超声破碎菌体，4°C，12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，将上清液加入GSH亲合柱上，用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用lOmmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得人GPXl突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为24.2kDa，且与抗GPXl抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第4泳道。其GPX活力为5130υ/μ mol，达到天然GPX的数量级水平。(本方法也可用于制备87位Ala不突变为丝氨酸即具有序列I (SEQ ID No:l)的氨基酸序列的GPXl突变体，具体方法除省去将87位Ala的编码序列突变为Ser的密码子这一步外，其它与本法完全相同。)
[0114]实施例5:用合成的基因和哺乳细胞表达系统一步转染制备人GPXl突变体蛋白
[0115]1.人GPXl突变体蛋白表达载体的构建:根据本发明序列1(SEQ ID No:1)所述的GPXl突变体的氨基酸序列在生物试剂公司用DNA合成仪人工合成GPXl突变体基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和Hind III酶切位点，3'端在人GPXl突变体基因终止密码子下游GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI，NM_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一个碱基后插入BamHI酶切位点；具体的靶基因序列是将GPXl基因(参见NCBI,NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密码子替换为丝氨酸的编码序列(依次是:AGT、AGC、AGC、AGT、AGT)所得到的能编码本发明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突变体蛋白的基因，且靶基因的3'端含有GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI,NM_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一个碱基后插入BamHI酶切位点。用先酶切后连接的方法，通过Hind III/BamHI酶切位点将GPXl突变体基因连同硒代半胱氨酸插入序列连接到同样酶切的哺乳类细胞表达载体pSecTag2A (Invitrogen公司)上；同理根据基因文库中人硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2 (SBP2，NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512个氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成仪人工合成其编码基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和XbaI酶切位点，3'端含有终止密码子和EcoRI酶切位点。用先酶切后连接的方法，通过Xbal/EcoRI酶切位点将SBP2的羧基端(343_854aa)基因组装到同样酶切的胞内型哺乳类细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A(Invitrogen公司)上。[0116]2.人GPXl突变体基因阳性细胞株的筛选:当细胞生长到IXlO6Ail的密度时，用含有SBP2和GPXl突变体基因的表达载体在Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen,按说明书使用)介导下共转染293F细胞(Invitrogen，R79007)，转染后72小时将细胞转入培养皿中开始贴壁培养，贴壁培养48 (通常2-50)小时后换含有G418和Zeocin的培养液，筛选具有两种抗性即同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的阳性细胞克隆，期间G418和Zeocin浓度分别从800-200 μ g/ml和400-100 μ g/ml逐步递减,每次分别减200 μ g/ml和100 μ g/ml，每个浓度使用5天，2-3天换一次培养液，筛选培养20天后将阳性细胞克隆用96、48、24、12和6孔培养板逐级放大培养。用抗GPXl多克隆抗体和ELISA技术检测GPXl突变体蛋白的表达量，挑选靶蛋白表达量高的细胞株用于扩培养和冻存。
[0117]3.人GPXl突变体蛋白的表达与纯化:在大容量含有1-10 μ M亚硒酸钠的293F表达培养基中扩培养2中筛选获得的同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的细胞株。在SBP2、SECIS和293细胞中其它蛋白因子的共同参与下，GPXl突变体蛋白以可溶性形式表达并分泌于培养基中，每48小时收集一次培养液。培养液经IOKDa分子量超滤膜浓缩20倍后，用GSH亲和层析柱纯化GPXl突变体蛋白，收集含有GPX4的洗脱液，透析除去小分子物质，冻干即得人GPXl突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为24.2kDa，且与抗GPXl抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第5泳道。其GPX活力为22689υ/μπι01，超过天然GPX—个数量级。
[0118]实施例6:用合成的基因和哺乳细胞表达系统分步转染制备人GPXl突变体蛋白
[0119]1.人GPXl突变体蛋白表达载体的构建:根据本发明序列1(SEQ ID No:1)所述的GPXl突变体的氨基酸序列在生物试剂公司用DNA合成仪人工合成GPXl突变体基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和Hind III酶切位点，3'端在人GPXl突变体基因终止密码子下游GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI，ΝΜ_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一个碱基后插入BamHI酶切位点；具体的靶基因序列是将GPXl基因(参见NCBI,NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密码子替换为丝氨酸的编码序列(依次是:AGT、AGC、AGC、AGT、AGT)所得到的能编码本发明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突变体蛋白的基因，且靶基因的3'端含有GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI,NM_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一个碱基后插入BamHI酶切位点。用先酶切后连接的方法，通过Hind III/BamHI酶切位点将GPXl突变体基因连同硒代半胱氨酸插入序列连接到同样酶切的哺乳类细胞表达载体pSecTag2A (Invitrogen公司)上；同理根据基因文库中人硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2 (SBP2，NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512个氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成仪人工合成其编码基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和XbaI酶切位点，3'端含有终止密码子和EcoRI酶切位点。用先酶切后连接的方法，通过Xbal/EcoRI酶切位点将SBP2的羧基端(343_854aa)基因组装到同样酶切的胞内型哺乳类细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A (Invitrogen公司)上。
[0120]2.人GPXl突变体基因阳性细胞株的筛选:当细胞生长到IXlO6Ail的密度时，用含有SBP2基因的表达载体在Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen,按说明书使用)介导下转染293F细胞(Invitrogen，R79007)，转染后72小时将细胞转入培养皿中开始贴壁培养，贴壁培养48 (通常2-50)小时后换含有G418的培养液，筛选具有G418抗性即稳定表达SBP2的阳性细胞克隆，期间G418浓度从800 μ g/ml逐步递减到200 μ g/ml，每次减200 μ g/ml，每个浓度使用5天，2-3天换一次培养液，筛选培养20天后将阳性细胞克隆用96、48、24、12和6孔培养板逐级放大培养。再用含有GPXl突变体基因的表达载体在lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen,按说明书使用)介导下转染稳定表达SBP2的293F细胞(Invitrogen，R79007)，转染后72小时将细胞转入培养皿中开始贴壁培养，贴壁培养48 (通常2-50)小时后换含有G418和Zeocin的培养液筛选具有两种抗性即同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的阳性细胞克隆，期间G418浓度维持在200 μ g/ml,Zeocin浓度从400 μ g/ml逐步递减到100 μ g/ml,每次减100 μ g/ml,每个浓度使用5天，2-3天换一次培养液，筛选培养20天后将具有两种抗性的阳性细胞克隆用96、48、24、12和6孔培养板逐级放大培养。用抗GPXl的多克隆抗体和ELISA技术检测GPXl突变体蛋白的表达量，挑选靶蛋白表达量高的细胞株用于扩培养和冻存。
[0121]上述方法也可以先转染GPXl突变体基因，后转染SBP2基因。
[0122]3.人GPXl突变体的表达与纯化:在大容量含有1-10 μ M亚硒酸钠的293F表达培养基中扩培养2中筛选获得的同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的细胞株。在SBP2、SECIS和293F细胞中其它蛋白因子的共同参与下，GPXl突变体以可溶性形式表达并分泌于培养基中，每48小时收集一次培养液。培养液经IOKDa分子量超滤膜浓缩20倍后，用GSH亲和层析柱纯化GPXl突变体，收集含有GPXl突变体的洗脱液，透析除去小分子物质，冻干即得人GPXl突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为24.2kDa，且与抗GPXl抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第6泳道。其GPX活力为21968υ/μπι01，超过天然GPX —个数量级。 [0123]实施例7:用扩增的靶基因和和哺乳细胞表达系统一步转染制备人GPXl突变体蛋白
[0124]1.人GPXl突变体蛋白表达载体的构建:用mRNA小量提取试剂盒(Sigma, Cat#MRN-10)从人H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌细胞中提取mRNA，在逆转录酶(AMVRT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通过RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)将其转录成cDNA。根据基因文库中公开的人GPXl的基因序列(参见NCBI，NM_000581.2)设计引物扩增GPXl的编码基因及其3'端非翻译区的碱基序列，在设计引物时，确保靶基因的端含有起始密码子(ATG)和Hind III酶切位点，第2位Cys的密码子替换为Ser的编码序列，其它氨基酸序列不变，3'端在终止密码子下游引入GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI，NM_000581.2)和Hind III酶切位点；用相同的限性核酸内切酶切割两端有特定酶切位点的祀基因和哺乳类细胞表达载体(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl基因连同其3'端非翻译区组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；具体的5'端引物是5’ -CCCAAGCTTCATATGAGTGCTGCTCGGC-3’，3'端引物是5’-CGGGATCCAGT GGGGAAACTCG-3’。用先酶切后连接的方法，通过Hind III/BamHI酶切位点将GPXl基因连同硒代半胱氨酸插入序列连接到同样酶切的哺乳类细胞表达载体pSecTag2A (Invitrogen公司)上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下,根据GPXl中要突变为丝氨酸的半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在原核表达载体上的人GPXl基因中的全部半胱氨酸的编码序列突变成丝氨酸的密码子；具体的正义引物分别是:C78S5’ -GTGCTCGGCTTCCCGAGCAACCAGTTTGGGC-3’，Cl15S5，-CATGCTCTTCGAGAAGAGCGAGGTGAACGGTGC-3，,C156S5，-CACCTGGTCTCCGGTGAGTCGCMCGATGTTGC-3’ 和 C202S5’ -GTCTCAAGGGCCCAGCTCTGCCTAGGGCGCCCCTC-3’ ；通过 DNA 测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能编码本发明序列I (SEQ ID No:l)所述的GPXl突变体蛋白。根据基因文库中人硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2 (SBP2,NCBI, NM_024077.3)羧基端343-854位的512个氨基酸的基因序列，设计引物扩增其编码基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和XbaI酶切位点，3'端含有终止密码子和EcoRI酶切位点；具体的Y端引物是5 ’ -GCTCTAGAATGGAAGCTTTATCTTC-3 ’，3 ^端引物是5’ -CGGAATTCTAAATTCAAATTC-3’。用先酶切后连接的方法，通过Xbal/EcoRI酶切位点将SBP2的羧基端(343-854aa)基因组装到同样酶切的胞内型哺乳类细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A (Invitrogen 公司)上。
[0125]2.人GPXl突变体基因阳性细胞株的筛选:当细胞生长到IXlO6Ail的密度时，用含有SBP2和GPXl突变体基因的表达载体在Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen,按说明书使用)介导下共转染293F细胞(Invitrogen，R79007)，转染后72小时将细胞转入培养皿中开始贴壁培养，贴壁培养48 (通常2-50)小时后换含有G418和Zeocin的培养液，筛选具有两种抗性即同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的阳性细胞克隆，期间G418和Zeocin浓度分别从800-200 μ g/ml和400-100 μ g/ml逐步递减,每次分别减200 μ g/ml和100 μ g/ml，每个浓度使用5天，2-3天换一次培养液，筛选培养20天后将阳性细胞克隆 用96、48、24、12和6孔培养板逐级放大培养。用抗GPXl多克隆抗体和ELISA技术检测GPXl突变体蛋白的表达量，挑选靶蛋白表达量高的细胞株用于扩培养和冻存。
[0126]3.人GPXl突变体蛋白的表达与纯化:在大容量含有1-10 μ M亚硒酸钠的293F表达培养基中扩培养2中筛选获得的同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的细胞株。在SBP2、SECIS和293细胞中其它蛋白因子的共同参与下，GPXl突变体蛋白以可溶性形式表达并分泌于培养基中，每48小时收集一次培养液。培养液经IOKDa分子量超滤膜浓缩20倍后，用GSH亲和层析柱纯化GPXl突变体蛋白，收集含有GPX4的洗脱液，透析除去小分子物质，冻干即得人GPXl突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为24.2kDa，且与抗GPXl抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第7泳道。其GPX活力为22689υ/μπι01，超过天然GPX—个数量级。
[0127]实施例8:用扩增的靶基因和和哺乳细胞表达系统分步转染制备人GPXl突变体蛋白
[0128]1.人GPXl突变体蛋白表达载体的构建:用mRNA小量提取试剂盒(Sigma, Cat#MRN-10)从人H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌细胞中提取mRNA，在逆转录酶(AMVRT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通过RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)将其转录成cDNA。根据基因文库中公开的人GPXl的基因序列(参见NCBI，NM_000581.2)设计引物扩增GPXl的编码基因及其3'端非翻译区的碱基序列，在设计引物时，确保靶基因的 端含有起始密码子(ATG)和Hind III酶切位点，第2位Cys的密码子替换为Ser的编码序列，其它氨基酸序列不变，3'端在终止密码子下游引入GPXl基因的3'端非翻译区的全部碱基序列(从GPXl基因的终止密码子后第一个碱基到多聚寡核苷酸A前一个碱基，具体序列参见NCBI，NM_000581.2)和Hind III酶切位点；用相同的限性核酸内切酶切割两端有特定酶切位点的祀基因和哺乳类细胞表达载体(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl基因连同其3'端非翻译区组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；具体的5'端引物是5’ -CCCAAGCTTCATATGAGTGCTGCTCGGC-3’，3'端引物是5’ -CG GGA TCCAGT GGGGAAACTCG-3’。用先酶切后连接的方法，通过Hind III/BamHI酶切位点将GPXl基因连同硒代半胱氨酸插入序列连接到同样酶切的哺乳类细胞表达载体pSecTag2A (Invitrogen公司)上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下,根据GPXl中要突变为丝氨酸的半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在原核表达载体上的人GPXl基因中的全部半胱氨酸的编码序列突变成丝氨酸的密码子；具体的正义引物分别是:C78S5’ -GTGCTCGGCTTCCCGAGCAACCAGTTTGGGC-3’，Cl15S5’-CATGCTCTTCGAGAAGAGCGAGGTGAACGGTGC-3，,C156S5，-CACCTGGTCTCCGGTGAGTCGCAACGATGTTGC-3’ 和 C202S5’ -GTCTCAAGGGCCCAGCTCTGCCTAGGGCGCCCCTC-3’ ；通过 DNA 测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能编码本发明序列I (SEQID No:1)所述的GPXl突变体蛋白。根据基因文库中人硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2(SBP2,NCBI,NM_024077.3)羧基端343-854位的512个氨基酸的基因序列，设计引物扩增其编码基因，确保基因的5'端含有起始密码子(ATG)和XbaI酶切位点，3'端含有终止密码子和EcoRI酶切位点；具体的Y端引物是5 ’ -GCTCTAGAATGGAAGCTTTATCTTC-3 ’，3 ^端引物是5’-CGGAATTCTAAATTCAAATTC-3’。用先酶切后连接的方法，通过Xbal/EcoRI酶切位点将SBP2的羧基端(343-854aa)基因组装到同样酶切的胞内型哺乳类细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A (Invitrogen 公司)上。
[0129]2.人GPXl突变体基因阳性细胞株的筛选:当细胞生长到IXlO6Ail的密度时，用含有SBP2基因的表达载体在Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen,按说明书使用)介导下转染293F细胞(Invitrogen，R79007)，转染后72小时将细胞转入培养皿中开始贴壁培养，贴壁培养48 (通常2-50)小时后换含有G418的培养液，筛选具有G418抗性即稳定表达SBP2的阳性细胞克隆，期间G418浓度从800 μ g/ml逐步递减到200 μ g/ml，每次减200 μ g/ml，每个浓度使用5天，2-3天换一次培养液，筛选培养20天后将阳性细胞克隆用96、48、24、12和6孔培养板逐级放大培养。再用含有GPXl突变体基因的表达载体在lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen,按说明书使用)介导下转染稳定表达SBP2的293F细胞(Invitrogen，R79007)，转染后72小时将细胞转入培养皿中开始贴壁培养，贴壁培养48 (通常2-50)小时后换含有G418和Zeocin的培养液筛选具有两种抗性即同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的阳性细胞克隆，期间G418浓度维持在200 μ g/ml,Zeocin浓度从400 μ g/ml逐步递减到100 μ g/ml,每次减100 μ g/ml,每个浓度使用5天，2-3天换一次培养液，筛选培养20天后将具有两种抗性的阳性细胞克隆用96、48、24、12和6孔培养板逐级放大培养。用抗GPXl的多克隆抗体和ELISA技术检测GPXl突变体蛋白的表达量，挑选靶蛋白表达量高的细胞株用于扩培养和冻存。
[0130]上述方法也可以先转染GPXl突变体基因，后转染SBP2基因。
[0131]3.人GPXl突变体的表达与纯化:在大容量含有1-10 μ M亚硒酸钠的293F表达培养基中扩培养2中筛选获得的同时稳定表达SBP2和GPXl突变体两种外源蛋白的细胞株。在SBP2、SECIS和293F细胞中其它蛋白因子的共同参与下，GPXl突变体以可溶性形式表达并分泌于培养基中，每48小时收集一次培养液。培养液经IOKDa分子量超滤膜浓缩20倍后，用GSH亲和层析柱纯化GPXl突变体，收集含有GPXl突变体的洗脱液，透析除去小分子物质，冻干即得人GPXl突变体蛋白。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)鉴定靶蛋白，其分子量为24.2kDa，且与抗GPXl抗体特异性结合，证明成功获得了目标蛋白，见图1的第8泳道。其GPX活力为20968U/μ mol，超过天然GPX —个数量级。
[0132]实施例9:
[0133]与实施例1制备方法完全相同，只是合成GPXl突变体的编码基因时将第87位丙氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子(TCC)，最后获得的GPXl突变体蛋白的第87位是丝氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列与第一种方法完全相同，即本发明序列2 (SEQ IDNo:2)所述的GPXl突变体蛋白。该突变体分子量仅有微小的变化，在SDS-PAGE和WesternBlot结果上没有区别，见图1的第9泳道。但其GPX活力为23619υ/μπι01，高于实施例1，超过天然GPX —个数量级。
[0134]实施例10:
[0135]与实施例1制备方法完全相同，只是合成GPXl突变体的编码基因时将第2位丝氨酸的编码序列替换为半胱氨酸的密码子，最后获得的GPXl突变体蛋白的第二位是硒代半胱氨酸，而不是丝氨酸，其它氨基酸序列与第一种方法完全相同，即本发明序列3 (SEQ IDNo:3)所述的GPXl突变体蛋白。该突变体分子量仅有微小的变化，在SDS-PAGE和WesternBlot结果上没有区别，见图1的第10泳道。但其GPX活力为15358U/ymol，低于实施例1，但仍然超过天然GPX —个数量级。
[0136] 实施例11:[0137] 除将实施例1所用的表达载体pCold III (TAKARA，Cat.#3369)换成带组氨酸纯化标签的PCold I (TAKARA, Cat.#3367)，其余与实施例1完全相同，即最终将获得本发明序列4 (SEQ ID No:4)所述的GPXl突变体蛋白。该突变体在氨基端引入了载体上包括6个组氨酸在内的16个外源氨基酸，因此分子量有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot结果上可以看到，见图1的第11泳 道，其优点是也可以用镍亲和层系纯化靶蛋白。其GPX活力为20532U/ymol，略低于实施例1，证明纯化标签对蛋白的活力没有明显影响，活力超过天然GPX —个数量级。
【权利要求】
1.一种含有两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。
2.一种含有两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
3.权利要求1所述的含有两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体的制备方法，其步骤如下: 1)、表达载体的构建: 根据氨基酸序列SEQ ID No: 1，用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达GPXl突变体蛋白的基因，确保靶基因的5'端含有起始密码子ATG，3'端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保靶基因的49位硒代半胱氨酸SeCys的编码序列替换为半胱氨酸Cys的密码子，第二位丝氨酸的编码序列替换为半胱氨酸的密码子，且基因全长不含有ACA序列；然后用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPXl突变体基因和分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl突变体基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPXl突变体基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的喊基组成的DNA序列； 2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化: 用步骤I)中构建的含有GPXl突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将含有表达核酸内切酶MazF的pMazF质粒转化 阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经IPTG低温4_25°C诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPXl突变体，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPXl突变体蛋白，透析冻干后即得GPXl突变体蛋白纯品，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE和蛋白印迹Western blot鉴定目标蛋白。
4.权利要求2所述的含有两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体的制备方法，其特征在于:是在序列SEQ ID No:3的氨基端引入pColdl原核表达载体的组氨酸纯化标签和凝血因子Xa切割位点的氨基酸后所形成序列SEQ ID No:6。
【文档编号】C12N15/70GK103898074SQ201410138374
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年7月18日 优先权日:2013年7月18日
【发明者】魏景艳, 郭笑, 宋健 申请人:吉林大学