一种肺炎支原体培养鉴定试剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种肺炎支原体培养鉴定试剂及其制备方法，属于临床医学领域。所述试剂中含有基础培养液、标准小牛血清、酵母浸液、葡萄糖、Eagle培养液、酚红、亚甲蓝和青霉素，基础培养液包括母液、NaCl、胰蛋白胨和Na2HPO4。所述试剂的制备方法包括：提取牛心浸液、提取酵母浸液、制备基础培养液后与其他成分溶解混合得到所述试剂。所述试剂通过添加快速生长因子、抑菌剂及复合指示剂，增强试剂培养专一性、快速繁殖和颜色变化高分辨率特性，使检测时间缩短为3h，对满足临床对Mp支原体感染疑似病例的快速筛查及辅助诊断有着重要的参考价值和指导意义。
【专利说明】一种肺炎支原体培养鉴定试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种肺炎支原体培养鉴定试剂及其制备方法，属于临床医学领域。
技术背景
[0002]肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae Mp)是人类新近发现的一种病原微生物。它是一种由患者口鼻分泌物经空气飞沫传播，易引起散发性或区域性流行，其主要症状为呼吸道感染伴肺炎即肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia MPP)的病原体，对人类有明显的致病性。Mp感染四季皆可发病，但秋冬季居多，婴幼儿和青少年为易感染人群，发病率为小儿肺炎类的20-30%，人口稠密及流行季节可达50%，流行周期为3-7年，近年来有流行周期缩短，发病率升高的趋势。Mp感染潜伏期长，病情发展缓慢，症状表现不明显，与常见细菌、病毒感染所致呼吸道症状相似，临床不易诊断或鉴别诊断而治疗药物又大不相同，临床治疗周期长，往往延误病情导致严重的并发症，故Mp感染的快速检测，准确诊断，及时诊治有着重要的临床意义。
[0003]目前用于Mp感染的实验室检测方法主要有两大类:一是血清Mp特异性抗体检测；二是Mp的培养、鉴定检测；其次有分子生物学检测，如PCR、基因探针等。分子生物学方法检测Mp，目前由于对扩增模板、方法等还无统一标准，临床只限于探索性研究，其单独用于疾病检测不多。血清特异性抗体检测有酶免法和凝集法，主要检测Mp-1gM或Mp-1gG ；Mp-1gM产生快(7-10天)，一个月后到达高峰，3-6月消退;Mp_IgG产生慢(3个月)，维持时间长(1-3年)只适用于回顾性诊断。特异性抗体是Mp感染后机体通过其免疫系统进行免疫而产生的免疫应答 物。因此患者的个体差异，样本是否采集于窗口期以及以往机体残留抗体对现时感染诊断的干扰等，都给临床感染患者的诊断及鉴别诊断带来困难，所以血清抗体检测强调必须双份血清，相邻抗体滴度相差4倍以上才有诊断价值。而培养鉴定法是根据Mp繁殖代谢的需求，科学合理调制培养基，根据Mp生物特性设计检测原理，根据指示剂颜色变化提示判定患者是否感染，方法准确、快速、灵敏。目前有关Mp检测试剂盒及药敏已有申报专利(申请号:10254575.5)但检测时间为24h，且未涉及基础原料提取。本发明Mp支原体快速培养鉴定试剂盒及制备方法检测时间为3h且包括基础原料提取，专利检索未见相关产品及专利文献。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种肺炎支原体培养鉴定试剂及其制备方法，所述试剂能选择性培养肺炎支原体(Mp)，抑制杂菌，利用指示剂颜色变化判定患者是否感染肺炎支原体。主要用于临床疑似Mp感染患者筛查及临床辅助诊断，为及时有效药物治疗提供参考。
[0005]为达到上述目的，本发明采取如下技术方案予以实现。
[0006]一种肺炎支原体培养鉴定试剂，所述试剂中各组分的质量百分比如下:
[0007]基础培养液60.0-80.0%
标准小牛血清10.0-30.0%
酵母浸液5.0-15.0%
葡萄糖0.5-1.5%
Eagle 培养液0.8-5.0%
酚红0.004-0.02%
亚甲蓝0.001-0.005%
[0008]所述试剂中还包括青霉素10-50万单位/100ml。
[0009]所述试剂pH 为 7.0-8.0。
[0010]其中，所述基础培养液中各组分的质量百分比如下:
[0011]
母液96.0-99.0%
NaCI0.1-1.0%
胰蛋白胨0.5-3.0%
Na2HPO40.1-0.5%
[0012]其中，母液为牛心浸液。
[0013]一种所述的肺炎支原体培养鉴定试剂的制备方法包括下述步骤:
[0014](I)牛心浸液的提取:取刚屠宰(或新鲜冷冻)的健康黄牛牛心一个，去筋膜、油脂绞碎成糜状，按质量比为1:5-1:15的比例加入双蒸水混匀，低温连续搅拌12-20小时，煮沸，补齐水，保温10-15分钟，过滤，滤液调pH为7.0-8.0，再次煮至微沸，冷却、过滤、分装，121°C下15分钟高压蒸汽灭菌，冷至室温，冷藏备用，效期3个月。
[0015](2酵母浸液提取:取新鲜高活性干酵母粉按质量比为1:10-1:20比例加入双蒸水溶解，煮沸，冷却至室温。低温连续搅拌12-20小时，4000-5000r/min，离心15-20分钟，取上清液调PH为7.0-8.0,煮至微沸，保温10-15分钟，冷却，再次离心15分钟，121°C下15分钟高压蒸汽灭菌，冷冻贮存备用，效期3个月。
[0016](3)将⑴提取的新鲜牛心浸液与NaCl、胰蛋白胨、Na2HPO4溶解、混合；调pH为
7.0-8.0,过滤，分装，灭菌冷却，得到基础培养液。
[0017](4)将步骤(3)得到的基础培养液与标准小牛血清、酵母浸液、葡萄糖、Eagle培养液、酚红、亚甲蓝、青霉素、溶解混合。
[0018]除已经灭菌的组分外，其余试剂需过滤除菌，无菌加入混匀调pH为7.0-8.0，得到肺炎支原体培养鉴定试剂，无菌分装到经洗净、灭菌干燥后的西林瓶中，每瓶l_5ml，经抽样检验合格后用于临床疑似Mp感染病例的检测。
[0019]本发明的有益效果为:
[0020]本发明通过自提基础原料，自创提取方法，保证了培养基的新鲜及高营养性；通过改进配方组成及比例，使营养成分更趋合理；通过添加快速生长因子、抑菌剂及复合指示剂，增强试剂培养专一性、快速繁殖和颜色变化高分辨率特性，使检测时间缩短为3h。[0021]所述试剂是一种富含高营养的紫红色液体介质，其检测原理为:通过接种患者样本，若样本中含有可检测量的Mp，则Mp利用介质中的营养成分及生长因子，快速生长繁殖，同时分解葡萄糖，还原亚甲蓝产酸，使介质的PH值降低，介质中的指示剂随pH值变化而由原来的紫红色变为草绿色(阳性)，反之则紫红色(阴性)不变，介质中的抑菌剂则抑制杂菌生长，以保证试剂培养的特异性。
【具体实施方式】
[0022]以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0023]一种肺炎支原体快速培养鉴定试剂，包括下述组分:基础培养液，标准小牛血清，酵母浸液，葡萄糖，Eagle培养液，外加微量的酚红、亚甲蓝及青霉素。
[0024]以下实施例中肺炎支原体培养鉴定试剂的制备方法包括以下步骤:
[0025](1)牛心浸液的提取:取刚屠宰(或新鲜冷冻)的健康黄牛牛心一个，去筋膜、油脂绞碎成糜状，按质量比为1:15的比例加入双蒸水搅散混匀，低温连续搅拌15小时，煮沸，补水，保温10分钟，过滤，滤液调pH为8.0。再次煮至微沸，冷却过滤，滤液分装，121°C下15分钟高压蒸汽灭菌，待用。
[0026](2)酵母浸液的提取:取新鲜高活性干酵母粉15g/包X25包，按质量比为1:15比例加入双蒸水搅拌，溶解，煮沸，冷却，低温连续搅拌提取20小时后，于5000r/min，离心20分钟，取上清液调pH为8.0，补水煮至微沸，冷却，再次8000r/min离心20分钟，取上清液，121°C下15分钟高压蒸汽灭菌，待用。
[0027](3)将步骤⑴提取的新鲜牛心浸液与NaCl、胰蛋白胨、Na2HPO4溶解、混合；调pH为8.0,过滤，分装，灭菌冷却，得到基础培养液。
[0028](4)将步骤(3)得到的基础培养液与标准小牛血清、酵母浸液、葡萄糖、Eagle培养液、酚红、亚甲蓝、青霉素、溶解混合:
[0029]除已经灭菌的组分外，其余试剂需过滤除菌，无菌加入混匀调pH为7.8，得到肺炎支原体培养鉴定试剂，无菌分装到经洗净、灭菌干燥后的西林瓶中，每瓶l_5ml，经抽样检验合格后用于临床疑似Mp感染病例的检测。
[0030]实施例1
[0031]一种肺炎支原体培养鉴定试剂，所述试剂中各组分的质量百分比如下:
[0032]
基础培养液78.0%
[0033]
标准小牛血清11.0%
酵母浸液10.0%
葡萄糖0.5%
Eagle培养液1.2%
酚红0.008%
亚甲蓝0.005%[0034]所述试剂中还包括青霉素15万单位/100ml。
[0035]其中，所述基础培养液中各组分的质量百分比如下:
[0036]
母液99.0%
NaCI0.4%
胰蛋白胨0.5%
Na2HPO40.1%
[0037]实施例2
[0038]一种肺炎支原体培养鉴定试剂，所述试剂中各组分的质量百分比如下:
[0039]
基础培养液65.0%
标准小牛血清25.0%
酵母浸液8.0%
葡萄糖1.2%
Eagle培养液 1.5%
酚红0.01%
亚 m0.003%
[0040]所述试剂中还包括青霉素20万单位/100ml。
[0041]其中，所述基础培养液中各组分的质量百分比如下:
[0042]
母液97.0%
NaCI0.7%
胰蛋白胨2.0%
Na2HPO40.3%
[0043]实施例3
[0044]一种肺炎支原体培养鉴定试剂，所述试剂中各组分的质量百分比如下:
[0045]基础培养液70.0%
标准小牛血凊16.0%
酵母浸液12.0%
葡萄糖0.8%
Eagie培养液1.0%
酚红0.02%
亚甲蓝0.002%
[0046]所述试剂中还包括青霉素10万单位/100ml。
[0047]其中，所述基础培养液中各组分的质量百分比如下:
[0048]
母液96.0%
NaCI0.6%
胰蛋白胨3.0%
Na2HPO40.4%
[0049]实施例4
[0050]一种肺炎支原体培养鉴定试剂，所述试剂中各组分的质量百分比如下:
[0051]
基础培养液75.0%
标准小牛血清18.0%
酵母浸液6.0%
葡萄糖1.0%
Eagle培养液0_8%
酚红0.015%
亚甲蓝0.004%
[0052]所述试剂中还包括青霉素15万单位/100ml。
[0053]其中，所述基础培养液中各组分的质量百分比如下:
[0054]
吋液98.0%
[0055]
NaCI0.5%
胰蛋白胨1.0%
Na2HPO40.5%
[0056]肺炎支原体培养鉴定试剂现有多家上市产品，检测时间除我公司现有的“6h快检试剂”产品外，其余都为24h或24h以上。肺炎支原体培养鉴定试剂包括特异性、灵敏度、检测时间等指标主要取决于培养基的营养性，配方组成、比例的合理性以及添加成分(如快速生长因子、抑杂菌剂)的科学性。
[0057]本发明通过自提基础原料，自创提取方法，保证了培养基的新鲜及高营养性；通过改进配方组成及比例，使营养成分更趋合理；通过添加快速生长因子、抑菌剂及复合指示剂，增强试剂培养专一性、快速繁殖和颜色变化高分辨率特性，使检测时间缩短为3h。所述试剂是一种富含高营养的紫红色液体介质，其检测原理为:通过接种患者样本，若样本中含有可检测量的Mp，则Mp利用介质中的营养成分及生长因子，快速生长繁殖，同时分解葡萄糖，还原亚甲蓝产酸，使介质的pH值降低，介质中的指示剂随pH值变化而由原来的紫红色变为草绿色(阳性)，反之则紫红色(阴性)不变，介质中的抑菌剂则抑制杂菌生长，以保证试剂培养的特异性。上述实施例制备的4种肺炎支原体培养鉴定试剂经用IO4~107CFU/mlMp标准菌株培养物加样检验均为阳性(草绿色)，而用正常健康人(非Mp感染)样本加样检验均为阴性(紫红色)，重复性试验均为100%。这对满足临床对Mp支原体感染疑似病例的快速筛查及辅助诊断有着重要的参考价值和指导意义。
[0058]对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
【权利要求】
1.一种肺炎支原体培养鉴定试剂，其特征在于，所述试剂中各组分的质量百分比如下:
2.一种制备如权利要求1所述的肺炎支原体培养鉴定试剂的方法，其特征在于，包括下述步骤: (1)牛心浸液的提取:取牛心，去筋膜、油脂绞碎成糜状，按质量比为1:5-1:15的比例加入双蒸水混匀，搅拌12-20小时，煮沸，补水，保温10-15分钟，过滤，滤液调pH为.7.0-8.0，再次煮至微沸，冷却、过滤、分装，1211:下15分钟高压蒸汽灭菌，冷至室温，得到牛心浸液； (2)酵母浸液的提取:取高活性干酵母粉按质量比为1:10-1:20比例加入双蒸水溶解，煮沸，冷却至室温；低温搅拌12-20小时，离心，取上清液调pH为7.0-8.0，煮至微沸，保温.10-15分钟，冷却，再次离心，121°C下15分钟高压蒸汽灭菌，冷至室温，得到酵母浸液； (3)将步骤(1)提取的牛心浸液与NaCl、胰蛋白胨、Na2HPO4溶解、混合；调pH为.7.0-8.0,过滤，分装，灭菌冷却，得到基础培养液； (4)将步骤(3)得到的基础培养液与标准小牛血清、酵母浸液、葡萄糖、Eagle培养液、酚红、亚甲蓝、青霉素、溶解混合； 除已经灭菌的组分外，其余试剂过滤除菌，无菌加入混匀调pH为7.0-8.0，得到肺炎支原体培养鉴定试剂。
【文档编号】C12Q1/04GK103849673SQ201410118844
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】杨会宣, 牛涛 申请人:武汉菁华时间科技有限公司