专利名称：检测肺炎支原体IgM抗体的化学发光免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检测试剂，特别是一种检测肺炎支原体IgM抗体的化学发光免疫
试齐U盒。
背景技术：
肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia, MP)于1962年自非典型肺炎患者痰液中分离首次分离出，是一类介于细菌与病毒之间、无细胞壁、能在无生命培养基上生长繁殖的原核细胞生物，属于原生生物门、柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属，是引起儿童气管炎、支气管炎、原发性非典型肺炎、社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP) 的重要病原体，感染后还可引起脑炎、心肌炎、免疫性溶血性贫血、神经系统损害、肾脏损害、传染性单核细胞增多症和川崎病等并发症。MP通过飞沫以气溶胶微粒的形式传播，可在全球范围内引起散发呼吸道感染或小流行，每间隔3-7年可发生一次地区性流行。MP感染发病率随研究对象、季节、诊断方法不同而变化。人类对MP普遍易感，其中5-20岁为高发人群。据估计，在门诊患儿中约有 20-40 %患J L感染MP，而住院CAP患儿中感染率为10-20 %，CAP患儿MP感染阳性率与患J L 年龄增高呈正相关。MP与其他病原的混合感染常使病程迁延，与肺炎链球菌混合感染率约为10%，与肺炎支原体混合感染率约为8. 8%。肺炎支原体感染人体后，经过2-3周的潜伏期，表现临床症状。发病初期有咽痛、 头痛、发热、乏力、肌肉酸痛、食欲减退、恶心、呕吐等症状，一般中等热度，2-3天后出现明显的呼吸道症状，突出表现为阵发性刺激性咳嗽，以夜间为重，咳少量黏痰或黏液脓性痰，有时痰中带血，也可有呼吸困难、胸痛。除呼吸系统的表现外，支原体肺炎可伴发多系统、多器官损害。皮肤损害可表现为斑丘疹、结节性红斑、水疱疹等，胃肠道系统可见呕吐、腹泻和肝功损害，血液系统损害较常见溶血性贫血，中枢神经系统损害可见多发性神经根炎、脑膜脑炎及小脑损伤等，心血管系统病变偶有心肌炎及心包炎。因此，MP感染早期诊断对于尽早发现和治疗MP感染性疾病非常重要。目前对MP的实验室诊断方法主要有病原体分离培养技术、核酸检测技术、血清学诊断技术等方法。其中病原体分离培养技术由于技术条件要求高，操作繁琐，所需时间长等限制，不能解决临床快速诊断的需要，已逐渐为其他快速检测方法所取代。PCR法敏感性高、 特异性强，尤其适用于MP早期快速诊断。但PCR因其敏感易受污染、易出现假阳性结果，且技术要求高，需要专门的仪器设备和技术人员，价格昂贵等原因限制了其在临床的普及发展。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)具有快速、敏感、 简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用，成为最广泛应用的检测方法之
ο化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)是近年来继放射免疫分析和酶免疫分析之后发展起来的一种高灵敏度的微量测定技术，具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速等优点，作为放射性免疫分析、酶免疫分析的替代者，是当前最理想的免疫分析方法。目前没有见到基于化学发光免疫分析检测肺炎支原体的灵敏度高，稳定性好的试剂盒。
发明内容
本发明根据上述领域的存在的空白和需求，提供一种检测肺炎支原体IgM抗体的试剂盒，实验证明，具有本底背景低、特异性高、亲和力强，同时有效降低批间差异，在免疫检测领域具有较大的应用价值。检测肺炎支原体IgM抗体的化学发光免疫试剂盒，包括抗异硫氰酸荧光素的单抗包被的固相载体，异硫氰酸荧光素标记的肺炎支原体抗原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgM 和化学发光底物，所述化学发光底物包括底物液A和底物液B，其中A液为的组成为pH值为7. 2 8. 5，浓度为10 30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(W/V)为0. 02 0. 1 % Proclin300,0. 1 1. 0%吐温-20和IOmM过氧化脲溶液；B液为50mM的iTris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0. 02 0. 1% Proclin300,1. 0 3. OmM的4-碘苯酚，0.
的BSA，0. 1 的溴化十六烷基三甲基铵，10 50mM鲁米诺溶液。所述抗异硫氰酸荧光素的单抗包被微孔板的包被浓度为2ug/ml。所述抗异硫氰酸荧光素的单抗包被的微孔板通过以下步骤制得用pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液配制成2ug/ml的抗异硫氰酸荧光素单抗包被液包被微孔板。所述异硫氰酸荧光素标记的肺炎支原体抗原通过以下步骤制得(1)肺炎支原体抗原用50mmol/L pH 9. 6碳酸缓冲液在2 8°C条件下透析，(2)异硫氰酸荧光素溶于二甲基亚砜中，终浓度为lmg/mL，(3)按肺炎支原体抗原异硫氰酸荧光素为Img 150 Ug的比例将步骤O)的溶液缓慢加入肺炎支原体抗原溶液中混合均勻，避光4V反应8小时，加入NH4C1至终浓度 50mmol/L，4°C终止反应2小时，(4)将异硫氰酸荧光素标记抗原溶液在0. 05mol/L pH 7. 2的磷酸盐缓冲液中透析，加入含0.1% (W/ff)NaN3U% (ff/ff)牛血清白蛋白，浓度为10mmol/L pH 7. 2的磷酸盐缓冲液中，4°C避光保存。所述试剂盒还包括稀释液，洗涤液，支原体抗体IgM阴性对照、阳性对照、校准品， 辣根过氧化物酶标记的抗人IgM。所述抗人IgM为羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM单抗。本发明以异硫氰酸荧光素(FITC)标记肺炎支原体抗原，同时以抗FITC单抗包被固相载体，建立间接包被肺炎支原体化学发光检测方法，该方法优势在于本底背景低、特异性高、亲和力强，同时有效降低批间差异，在免疫检测领域具有较大的应用价值。本发明的试剂盒采用FITC单抗包被微孔板，与FITC标记抗原和待测样本中肺炎支原体IgM形成固相FITC单抗-FITC标记抗原-抗体复合物，再与标记的抗人IgM形成固相FITC单抗-FITC标记抗原-抗体-标记二抗夹心复合物，然后加入化学发光底物，利用化学发光仪检测相对发光强度，定性或半定量检测待测样本中肺炎支原体IgM抗体，从而避免了酶免试剂存在的灵敏度低、部分底物有毒或致癌等缺点，该试剂盒具有反应速度快、光信号不受温度变化影响、成本低、易储存、特异性高、产品批间差异小、生产方便等优势，可为临床肺炎支原体相关的急性呼吸道疾病辅助诊断提供更为特异、快速、可靠的诊断依据。
本发明的了一个主要的贡献在于提供了一种新的化学发光底物液配方，与采用现有常规底物液配方的试剂盒相比，具有灵敏度高，稳定性好等优点。
具体实施例方式实施例1、本发明的试剂盒制备方法1、本发明的试剂盒包括1)肺炎支原体IgM阳性对照；2)肺炎支原体IgM阴性对照；3)肺炎支原体IgM校准品；4)包被FITC单抗的微孔板；5) FITC标记的肺炎支原体抗原；6)抗人IgM酶标记物； 7) 20倍浓缩洗涤液；以及8)化学发光底物液。其中，微孔板为M、48或96孔的微孔板条；所述抗人IgM为羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM单抗；所述酶辣根过氧化物酶。2、本发明I号试剂盒的制备方法以肺炎支原体IgM阳性血清配制阳性对照，以健康人血清配制阴性对照，以肺炎支原体IgM阳性血清配制校准品，微孔板包被FITC单抗，FITC标记肺炎支原体抗原，酶标记抗人IgM，配制化学发光底物，分装上述组份，以及组装为成品。2. 1微孔板包被抗FITC单抗2. 1. 1 包被用50mM pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液配制成包被浓度为2ug/ml的FITC单抗包被液，并将包被液负载于微孔板(IOOul/孔)，2-8°C包被18-M小时。
名称数量无水碳酸钠1.6g碳酸氢钠2.9g双蒸水定容至IOOOmL调整pH值至pH9.6 2. 1. 2封闭用含5% BSA, pH值为7. 0-7. 5，浓度为IOmM的Tris缓冲液作为封闭液封闭上述洗涤后的固相载体。
名称数量Tris1.212gBSA5gProclin 300ImL双蒸水定容至IOOOmL调整pH值至pH7.4 2. 2酶标抗人IgM抗体的制备采用改良的过碘酸钠法。具体步骤参见《生物化学与生物物理学报》16卷1984年第6期，骆加里等“过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶(HRP)中的若干问题及高效果的标记方法”
2. 3FITC标记肺炎支原体抗原的制备将肺炎支原体(购自广州贵翔)2mg用50mmol/L pH 9. 6碳酸缓冲液在2 8°C条件下透析，将FITC溶于二甲基亚砜(DMSO)中，终浓度为lmg/mL，按抗原FITC = Img 150 yg的比例将FITC 二甲基亚砜溶液缓慢加入待标记抗原溶液中混合均勻，暗处 4°C反应8小时，加入5mol/L的NH4C1溶液至终浓度50mmol/L，4°C终止反应2小时，将FITC 标记抗原溶液在0. 05mol/L pH 7. 2的磷酸盐缓冲液中透析至透析液清亮，加入0. (重量)NaN3、l% (重量)牛血清白蛋白(BSA)pH 7. 2的lOmmol/L磷酸盐缓冲液中，4°C暗处保存。2. 4FITC标记抗原、酶标记抗体稀释液的配制
权利要求
1.检测肺炎支原体IgM抗体的化学发光免疫试剂盒，包括抗异硫氰酸荧光素的单抗包被的微孔板，异硫氰酸荧光素标记的肺炎支原体抗原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgM和化学发光底物，所述化学发光底物包括底物液A和底物液B，其中A液为的组成为pH值为7. 2 8. 5，浓度为10 30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(W/V)为0. 02 0. 1 % Proclin300,0. 1 1. 0%吐温-20和IOmM过氧化脲溶液；B液为50mM的iTris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0. 02 0. 1% Proclin300,1. 0 3. OmM的4-碘苯酚，0. 的BSA，0. 1 的溴化十六烷基三甲基铵，10 50mM鲁米诺溶液。
2.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，所述抗异硫氰酸荧光素的单抗包被微孔板的包被浓度为2ug/ml。
3.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，所述抗异硫氰酸荧光素单抗包被的微孔板通过以下步骤制得用PH值为9. 6的碳酸盐缓冲液配制成2ug/ml的抗异硫氰酸荧光素单抗包被液包被微孔板。
4.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，所述异硫氰酸荧光素标记的肺炎支原体抗原通过以下步骤制得(1)肺炎支原体抗原用50mmol/LpH 9. 6碳酸缓冲液在2 8°C条件下透析，(2)异硫氰酸荧光素溶于二甲基亚砜中，终浓度为lmg/mL，(3)按肺炎支原体抗原异硫氰酸荧光素为Img 150yg的比例将步骤O)的溶液缓慢加入肺炎支原体抗原溶液中混合均勻，避光4°C反应8小时，加入NH4C1至终浓度 50mmol/L，4°C终止反应2小时，(4)将异硫氰酸荧光素标记抗原溶液在0.05mol/L pH 7. 2的磷酸盐缓冲液中透析，加入含0. (W/ff)NaN3U% (ff/ff)牛血清白蛋白，浓度为lOmmol/L pH 7. 2的磷酸盐缓冲液中，4°C避光保存。
5.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，所述试剂盒还包括稀释液，洗涤液，支原体抗体IgM阴性对照、阳性对照、校准品，辣根过氧化物酶标记的抗人IgM。
6.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，所述抗人IgM为羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM单抗。
全文摘要
本发明“检测肺炎支原体IgM抗体的化学发光免疫试剂盒”，属于医学检测试剂。包括抗异硫氰酸荧光素的单抗包被的微孔板，异硫氰酸荧光素标记的肺炎支原体抗原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgM和化学发光底物。该方法优势在于本底背景低、特异性高、亲和力强，同时有效降低批间差异，在免疫检测领域具有较大的应用价值。
文档编号G01N33/533GK102368071SQ201110183669
公开日2012年3月7日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者彭京胜, 李全, 焦守恕 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司