专利名称：用于检测肺炎支原体抗体的方法、检测用的试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种检测肺炎支原体抗体的方法、采用此方法进行检测的试剂盒、以及该试剂盒的制备方法。
背景技术：
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, Mp)是人类原发性非典型肺炎的病原体，还可以引起其他呼吸道感染性疾病甚至机体其它组织疾病，且发病率日益增加并有流行趋势。由于Mp无细胞壁，故其引起感染的治疗与其它细菌和病毒感染在治疗方法上有所不同，因此，Mp感染的病原学诊断对于疾病的及时正确治疗有重要意义。目前检测肺炎支原体的方法虽然很多，但缺乏更为快速简易而又可靠的方法。X线征象均缺乏特异性，且须与病毒性肺炎、军团菌肺炎相鉴别，只能通过实验室检查病原体分离阳性和血清学试验进行鉴别诊断、确诊。血清中特异性IgM及IgG抗体可通过冷凝集试验(CAT)、明胶颗粒凝集实验(PLA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、金标免疫斑点法(DIM)等方法进行测定。CAT特异度和敏感度均为最低，因此其临床诊断价值不大；金标斑点法虽操作简便快捷，但敏感度略低，有漏诊的可能；明胶颗粒凝集试验试剂准备与操作过程较为繁琐费时，且需要专业操作人员。酶联免疫吸附法(ELISA)具有特异、敏感和简便等优点，已用于检查各种抗体或抗原，但此方法存在以下问题(1)每一批试验从加样、温育及洗板等步骤较多，操作繁琐，时间较长，且需专门操作人员及专用仪器，难以在基层医疗单位开展。(2)检测中需分别加入显色成分A液与B液，一定程度上增加了劳动强度与试剂盒成本。专利申请号200710075306. 3公开了一种可在一定时间使生色物与过氧化物内共存的显色体系，但此体系中的关键组分一生色物保护剂硫代硫酸钠，在此发明的PH低于6. O的酸性环境下不利于长期的稳定，溶液体系若存在C02、微生物或长期暴露在光照环境下也都不利于硫代硫酸钠的稳定，因此不能对生色物如TMB等起到有效的抗氧化保护作用。其中用于吸收紫外线的巴松-1789虽可以起到对紫外线的防护作用，但它遇金属离子即变红，干扰试验结果，因此增加了配制过程中对试剂纯度及操作的额外要求。(3) ELISA法无法做到对两种抗体的快速同时检测。目前利用HRP标记抗体技术大多采用的过碘酸钠法，少数学者利用HRP标记抗原的技术过程与标记抗体过程基本类似，但此标记过程存在以下问题(1)标记中需反复调节pH，且pH值调节范围较宽，不可避免地影响酶活性；(2)标记过程繁琐、操作耗时；(3)标记过程中不可避免发生酶自身的交联；(4)标记物不够稳定不易保存，反复冻融又会使标记物活性下降。因此，以此传统标记方法制备的肺炎支原体检测试剂盒的质量与稳定性不能得到保证。目前常规的酶标记物稀释缓冲液对酶标记物不能起到最大限度的保护作用，浓度较高的酶标记物在低温下相对稳定，但制备工作液时需复溶或再稀释，稀释后保存期较短，且增加了工作量。如果在运输过程中遇到持续高温气候，试剂盒中免疫酶标记物的活性将受到很大影和从而影响到试剂盒的质量，造成经济损失。专利申请号200910143637. 5公开了一种维护酶标记物稳定性的稀释液，但此溶液系统中所添加的木糖是一种带有醛基的还原性糖，同时此系统中还存在大量带有氨基基团的甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、酶及其其它生物分子，此种混合溶液中易发生美拉德反应一即羰基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)间的反应，经过复杂的历程最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素，所以又称羰胺反应(法国化学家L.C. Maillard在1912年提出)。美拉德反应在高温条件下进行较快，但在长期室温储存条件下也可以缓慢进行这种非酶促反应；且此稀释液诸多添加物都是动物源性，使用非动物源性的稳定剂以减少动物源性原辅料的潜在危害已引起生产厂家的广泛关注。因此以上保护性稀释液不利于长期保存酶标记物。某些诊断试剂盒的保存缓冲液出于商业原因等并未给出具体组分，给试剂盒的开发应用带来不便。因此应根据酶标抗原的分子量、酸碱性质、疏水性等寻找有效的保存缓冲液。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测肺炎支原体抗体的方法、试剂盒及其制备方法，使酶标抗原的过程更加快速高效，提高灵敏度，延长酶标记物及试剂盒的有效期。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种用于检测肺炎支原体抗体的方法，将抗人IgM与抗人IgG分别固定在膜上，力口入待检血清，待检血清中的肺炎支原体抗体和固定到膜上的抗人IgM与抗人IgG结合后，力口入酶标记肺炎支原体抗原溶液，最后加入显色液显色显示结果；所述酶标记肺炎支原体抗原溶液采用辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液，并采用以下步骤制备(1)将1g辣根过氧化物酶溶于25ml 30ml的0. 0lM磷酸盐缓冲液中，加入70 85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5. 0，所得溶液再与115 125mgl-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0. 0lM磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；(2)将步骤(1)制得的溶液配制成1ml、浓度为5 5. 2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60 85 μ I交联剂，混匀后于室温下反应25 35min ；(3)将所述反应物加入截留分子量为1OK的超滤管，并对反应物进行离心处理8 12min，再以0. 0lM的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8 12min,以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml ；(4)加入700 900 μ I浓度为1. 6mg/ml的肺炎支原体抗原溶液,并于室温下反应
25 35min ；(5)使步骤(4)制得的溶液通过SephadexG-200层析柱,收集第一峰的产物，即为酶标肺炎支原体抗原溶液。优选的，所述膜为硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。优选的，所述辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原所用交联剂分子结构如下
权利要求
1.一种用于检测肺炎支原体抗体的方法，其特征在于将抗人IgM与抗人IgG分别固定在膜上，加入待检血清，待检血清中的肺炎支原体抗体和固定到膜上的抗人IgM与抗人IgG结合后，加入酶标记肺炎支原体抗原溶液，最后加入显色液显色显示结果；所述酶标记肺炎支原体抗原溶液采用辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液，并采用以下步骤制备(1)将Ig辣根过氧化物酶溶于25ml 30ml的O.OlM磷酸盐缓冲液中，加入70 85mg乙二胺，用O.1M盐酸将pH值调节至5. 0，所得溶液再与115 125mgl-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用O. OlM磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；(2)将步骤(I)制得的溶液配制成1ml、浓度为5 5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60 85 μ I交联剂，混匀后于室温下反应25 35min ；(3)将所述反应物加入截留分子量为IOK的超滤管，并对反应物进行离心处理8 12min，再以O. OlM的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8 12min,以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至Iml ；(4)加入700 900μ I浓度为1. 6mg/ml的肺炎支原体抗原溶液，并于室温下反应25 35min ；(5)使步骤(4)制得的溶液通过SephadexG-200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标肺炎支原体抗原溶液。
2.如权利要求1所述的用于检测肺炎支原体抗体的方法，其特征在于，所述膜为硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。
3.如权利要求1所述的用于检测肺炎支原体抗体的方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原所用交联剂分子结构如下
4.如权利要求1所述的用于检测肺炎支原体抗体的方法，其特征在于，所述显色液为包括四甲基联苯胺、过氧化脲、抗氧化剂绿原酸、还原剂抗坏血酸、紫外线吸收剂2-氰基-3，3- 二苯基丙烯酸异辛酯和pH5. O的乙酸钠缓冲溶液体系。
5.如权利要求4所述的用于检测肺炎支原体抗体的方法，其特征在于，所述显色液采用如下方法制得⑴将8. 3 8. 5g三水合乙酸钠晶体溶于600ml超纯水中，振荡混匀，并调整溶液pH至5. O ；⑵再将O. 4 1. Og四甲基联苯胺溶于3ml无水乙醇中，制得四甲基联苯胺乙醇溶液；⑶将上述两种溶液混合，振荡混匀；⑷分别将70 90mg绿原酸与70 90mg抗坏血酸、8 12ml2_氰基-3，3- 二苯基丙烯酸异辛酯、2. 5 2. 9g磷酰甘氨酸及O. 2 O. 8g过氧化脲加入到步骤(3)所得到的混合溶液中，振荡混匀，得到所述显色液。
6.如权利要求1所述的用于检测肺炎支原体抗体的方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原使用前，加入酶标记物稳定性缓冲液，所述酶标记物稳定性缓冲液采用以下方法制备⑴褐藻提取物的制备新鲜海藻样品采集后，除去附生生物，用蒸馏水反复冲洗后取藻体顶部，称量后用组织捣碎机破碎，然后加入乙醇提取液提取，提取液除去乙醇，加入磷酸盐缓冲液，离心后取上清液，即制得褐藻提取物；⑵酶标记物稳定性缓冲液的配制向0. 0lM的磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0. 02 0.04wt%的甲基异噻唑啉酮与0. 04 0. 08wt%诊断试剂防腐剂PR0CLIN300，然后依次加入2 8wt%海藻糖、0. 01 0. 07wt%黄原胶、0. 9wt%甘氨酸与0. 7wt%丝氨酸,混勻后再加入0.3 1. 2wt%褐藻提取物、0.1 0. 6wt%基因重组的类人胶原蛋白，最后加入1. 8wt%的硫酸镁与0. 9wt%氯化锌、0. 1%维生素BI及3%体积比的甘油，混合均匀，得到所述酶标记物稳定性缓冲液。
7.用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒，其特征在于，包括设置在所述试剂盒内的检测盒、辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液瓶、洗涤液瓶和显色液瓶，所述辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液采用如权利要求1所述方法制备，所述检测盒内设有包被膜，所述包被膜上包被有两个检测点与质控点，所述两个检测点上分别包被有抗人IgM与抗人IgG抗体,所述质控点包被有抗肺炎支原体抗体。
8.如权利要求7所述的用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒，其特征在于，所述包被膜为硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。
9.制备如权利要求7所述的用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒的方法，其特征在于，采用以下步骤制备⑴采用如权利要求1所述方法制备辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液；⑵制备包被膜选用适合孔径的包被膜，裁成方片备用；⑶制备包被抗体将抗人1gM、抗人1gG与抗肺炎支原体抗体离心备用；⑷组装检测盒将盒盖、包被膜、吸水垫和盒体按照从上到下的顺序组装并扣紧，使上盖的窗口扣在包被膜中心位置，组成检测盒；(5)包被用添加了3wt％海藻糖的0. 0lM磷酸盐缓冲液稀释离心后的各抗体至100 500 μ g/ml，在包被膜的检测点位置分别包被O. 5 μ I浓度为0.1 1. Omg/ml的抗人IgM、0.5 μ I浓度为0.1 1. 0mg/ml抗人1gG,质控点位置包被0. 6 μ I浓度为0. 5 1. Omg/ml的抗肺炎支原体抗体；(6)干燥检测盒在湿度10% 40%的环境下室温干燥I小时；(7)包装干燥后的检测盒用铝箔带包装，并在袋内放置干燥剂，封口。
全文摘要
本发明涉及生物学技术领域，具体一种检测肺炎支原体抗体的方法、采用此方法进行检测的试剂盒，以及该试剂盒的制备方法，将抗人IgM与抗人IgG分别固定在膜上，加入待检血清，待检血清中的肺炎支原体抗体和固定到膜上的抗人IgM与抗人IgG结合后，加入酶标记肺炎支原体抗原溶液，最后加入显色液显色显示结果。本发明可使酶标肺炎支原体抗原的过程快速高效，延长试剂盒的保质期，提高检测灵敏度，降低试剂盒成本。
文档编号G01N33/569GK103033615SQ201210568379
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者杨致亭, 杨金红, 邓旭, 李升香, 武国威, 石中强, 丁兆明, 尚永明 申请人:青岛汉唐生物科技有限公司