专利名称：人工合成人肠激酶基因及其表达纯化方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体属于一种重组人肠激酶轻链(HumanEnterokinaselight chain, hEKL)的制备方法,包括其工程菌细胞的构建、重组人肠激酶的表达和纯化。
背景技术：
利用融合表达往往能实现目的蛋白的高效表达及分离纯化。但有时目的蛋白不能以融合蛋白的形式使用，因此在目的蛋白与标签蛋白之间设计特异的蛋白酶酶切位点，融合蛋白经过特异性的切割或断裂，才得到完整的目的蛋白。目前常见的工具蛋白酶有凝血酶、肠激酶或Xa因子等，其中肠激酶特异性最好。
目前已经采用原核或真核表达系统成功得到了有生物活性的重组牛、小鼠等肠激酶轻链蛋白，但很少见关于人肠激酶轻链基因工程方面的研究。肠激酶是哺乳动物十二指肠的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶，由一条重链(82-140kD)和一条轻链(35-62kD)组成，通过一对二硫键连接。重链起锚定肠道细胞膜、识别蛋白质的作用；轻链则有全酶催化活性，是该酶的催化亚基。人肠激酶(HumanEnterokinase,hEK)除了含有以上两个亚基外，还包括一个迷你小亚基，为异源三聚体。主要特点是对Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-丨_X(丨表示切割位点,X代表任意氨基酸)序列具有很高的识别和切割特异性。由于肠激酶酶切反应条件相对温和宽泛，在PH值(4.5-9.5)及温度(4-45° C)均有良好酶切活性，因此成为融合蛋白表达体系中常用的切割工具。但是天然的人肠激酶不仅来源有限，而且成本高，得率低，也容易被其它蛋白酶污染，从而导致目的产物降解。因此运用基因工程的方法生产人肠激酶已成为趋势。国内外已有大量关于牛肠激酶研究的报道，但有关人肠激酶研究还很少。有研究表明，人肠激酶的KMt/Km值约为牛肠激酶的10倍，具有更高的切割效率，因此，如果能利用基因工程方法得到重组人肠激酶，其应用价值将比重组牛肠激酶更高。目前，人肠激酶轻链在毕赤酵母中的重组表达为3. 8mg/L，活力为Invitrogen商品化的肠激酶催化亚基产品EKMax 的3倍，而在大肠杆菌中的重组表达为包涵体，经变复性处理后每升发酵液可纯化得到IOmg有活性的人肠激酶轻链蛋白，活力为EKMax 的5倍。由于肠激酶轻链含有9个Cys残基，其中形成4对二硫键，只有一个游离的Cys残基未参加配对，因此在重组表达时，极易形成二硫键错配，导致产物以包涵体形式出现。MBP已经被证实具有很强的助溶作用，可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。这一特点尤其适用于本实验hE&的表达与纯化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能在大肠杆菌中高效表达人肠激酶基因及其产物的表达纯化方法，该方法适合于人肠激酶的大规模制备。本发明根据已报道(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)的人肠激酶轻链的核苷酸序列和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与人肠激酶轻链氨基酸序列一致的人肠激酶轻链的核苷酸序列，进行体外合成，在大肠杆菌中得到高效表达，并利用亲和纯化得到高活力的MBP-hEKL融合蛋白。本发明提供的一种人工合成的人肠激酶轻链(hEKj基因，它是序列表中SEQ NO I的核苷酸序列。 一种表达载体，它含有SEQ NO I的核苷酸序列，并含有Tac启动子。一种工程菌，它含有上述的表达载体。所述工程菌是大肠杆菌。一种人工合成人肠激酶轻链基因在大肠杆菌中的表达纯化方法，包括如下步骤(I)构建含有人工合成的hEKL基因的重组质粒pMAL-s-hEKL ；(2)将重组质粒pMAL-s-hEI^转化至大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株；(3)将工程菌接种到LB培养基溶液中培养，当工程菌培养液浓度OD6tltol达到
O.6-0. 8时，加入终浓度为O. 1-1. OmM的IPTG，37°C诱导表达3_7小时，离心收集菌体，超声破碎后离心，取上清，用Amylose亲和层析的方法纯化得到目的蛋白MBP-hEl。用10%SDS_PAGE分析纯化的目的蛋白，结果显示，本发明得到了电泳纯的目的蛋白质。以Invitrogen公司的同类产品EKMax 为标准对本发明生产的MBP-hEKL活性进行标定，12%Tricine SDS-PAGE分析表明，本发明生产的MBP-hEI^的酶活力达到EKMax 的7倍。与现有技术相比，本发明的有点和效果本发明首次实现了人肠激酶在大肠杆菌中的大量可溶表达，经亲和层析纯化后每升发酵液可以获得40mg带有MBP标签的融合蛋白MBP-hEKp活性检测表明其活力为EKMax 的7倍，达到6. OX IO5U/μ M，无论在表达量和活力都是目前已有报道中最高的。另外我们在MBP-tag和目标蛋白之间还设计有人鼻病毒3C蛋白酶的酶切位点，可以在需要时将MBP标签除去。而且纯化得到的含有重组人肠激酶催化亚基的融合蛋白MBP-hEl有切割含有人肠激酶切割位点的蛋白质多肽和重组融合蛋白的活性。本发明提供的一种高效生产重组人肠激酶的生产方法，采用大肠杆菌表达系统，采用亲和纯化方法，获得快速、简便、稳定、高活性的重组人肠激酶轻链蛋白。该酶适用于生物工程、基因工程、生物化学和分子生物学等方面的研究。
四
图I人工合成hE&基因与人体内表达的野生型基因核苷酸序列比对，图中黑色阴影的碱基为密码子优化后改变的碱基。图2重组质粒pMAL-s-hEKL的PCR和酶切鉴定电泳分析泳道I为DNA makerDL5000酶切鉴定电泳分析；泳道2为重组质粒pMAL-s-hEI^的PCR鉴定；泳道3为空质粒pMAL-s ;泳道4为重组质粒pMAL-s-hEI^ ;泳道5为重组质粒pMAL-s-hEI^的BamH I单酶切电泳分析；泳道6为重组质粒pMAL-s-hEI^的BamH I/Hind III双酶切鉴定。图3重组质粒pMAL-s_hEKL构建示意4重组人肠激酶催化亚基表达及纯化的SDS-PAGE分析图谱泳道I为Proteinmaker;泳道 2 为 pMAL_s/BL21 (DE3)未诱导；泳道 3 为 pMAL_s/BL21 (DE3)诱导；泳道 4 为pMAL-s-hEKL/BL21 (DE3)未诱导；泳道 5 为 pMAL-s_hEKL/BL21 (DE3)诱导；泳道 6 为超声上清；泳道 为沉淀；泳道8为经Amylose亲和层析纯化的MBP-hEI^图5重组肠激酶催化亚基切割重组GST-melittin的SDS-PAGE分析图谱泳道I为Proteinmaker ;泳道2为GST蛋白；泳道3为GSTielittin融合蛋白；泳道4-7为MBP-hEl和GST-melittin在摩尔比分别为1:1000、1:3000、1:5000和1:7000的比例下进行切割；泳道8为EKMax 和GST-melittin在摩尔比为1:1000的比例下进行切割。
五具体实施例方式I.通过查找GenBank中人肠激酶序列U09860. 1，利用大肠杆菌的密码子偏爱性对其进行序列优化，设计编码与人体内肠激酶轻链氨基酸序列一致的人肠激酶轻链的核苷酸序列，见序列表中SEQ ID NOl的核苷酸序列，其核苷酸与人体内野生型基因序列比较见图
I。该人工合成人肠激酶轻链基因长度为708bp，编码235个氨基酸。 2.合成下述PCR引物Fff(hEKL) 5/ -CGGGATCCATTGTTGGAGGAAGTAAT-3'；RV(hEKL) 5/ -GCAAGCTTCTCGAGCTAATGTAGAAAACTTTG-3'；其中引物FW (hEig和RV (hEKL)分别引入了 BamH I和Hind III的酶切位点，以Fff(hEKL)和RV(hEKj为PCR引物，以人工合成的人肠激酶基因为模板，用Prime STAR高保真酶进行PCR扩增hEI^基因，程序如下98°C 10秒，60°C 10秒，72°C I分钟，30个循环，72° ClO分钟，4°C保温。3.用限制性内切酶BamH I、Hind III酶切hEI^ PCR产物，同样用BamH I、HindIII酶切原核表达质粒PMAL-S (由PMAL-P2X质粒改造所得，将Factor Xa识别序列改为PreScissionProtease识别序列),酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收得到相应的核酸片段，利用T4DNA连接酶在16°C进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，37° C培养，PCR筛选阳性克隆并提取质粒进行双酶切及PCR鉴定(见图2)，并进行DNA序列分析确定。4.将构建好的重组质粒pMAL-s-hEI^ (见图3)转化至宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的工程菌株。5.挑取工程菌单菌落于5mL LB培养基，37°C、180转/分钟振荡培养过夜，按2%接种量转至ILLB培养基中，37°C振荡培养至OD6tltlnm=O. 6-0. 8时，加IPTG(终浓度为O. 2mM),37°C继续振荡培养4小时，SDS-PAGE检测蛋白表达情况(见图4)。6. MBP-hEK 的分离纯化8000r/min，IOmin 离心收集菌体，用 20mM Tris-HCl (含500mM NaCl, pH8. O)洗菌体两次，再重悬于25mL相同缓冲液中，冰上超声破碎，IlOOOr/min，4° C离心30min。收集上清，上样于预先用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8. 0)平衡好的Amylose亲和层析柱，冰浴振荡2h。用30mL平衡缓冲液进行洗脱除去杂蛋白，然后用 IOmL 洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, IOmM Maltose, pH 8.0)将目标蛋白洗脱下来。Bradford法测定蛋白浓度。用PEG20000浓缩目的蛋白至3g/L，并将目的蛋白在透析缓冲液(20mM Tris-HCl, 50mM NaCl,2mM CaCl2,0. l%Tween-20,pH 7.4)中搅拌透析24h，所有操作均在4° C层析柜中进行。IL发酵液所得菌体经纯化后最终可得到40mg纯度在97%以上的MBP-hEKj浓度为3mg/mL)融合蛋白(见图4)。
7. MBP-hEKL的活性分析以含有人肠激酶酶切位点的融合蛋白GST-Melittin为底物测定重组人肠激酶的活性。在ImL Eppendorf管中加入90 μ L GST-Melittin融合蛋白(浓度lmg/mL，纯度>95%), MBP_hEKL 和底物以 1:1000、1:3000、1:5000、1:7000 的摩尔比进行切割，酶切缓冲液为20mM Tris-HCl pH 7. 4、100mM NaCl，置25° C恒温水浴，酶切20h后Tricine SDS-PAGE检测。MBP_hEKL活性单位标定以Invirogen公司的产品EKMax (比活力为2000U/mg，浓度为O. 5gL)为基准对纯化的MBP_hE&活性进行标定，TricineSDS-PAGE图谱基本一致的稀释酶样其活性相当，以此推算纯化的MBP-hEI^活性(U/ μ Μ)。结果如图5，MBP-hEl和底物以1:5000的摩尔比进行切割时，融合蛋白仍然能够被完全酶解，得到分子量分别为26kD(GST)和2. 8kD(Melittin)的两条带。在1:7000时，融合蛋白的酶解率也在90%以上，与EKMax 在1:1000时酶切效果基本相当，即纯化 的MBP-hEKL的比活力为EKMax (Invitrogen公司)的7倍。上述结果表明我们通过基因工程方法得到了具有生物活性的重组人肠激酶轻链蛋白，酶活力达到6. OX IO5U/μ M。
权利要求
1.一种人工合成的人肠激酶轻链(hEKL)基因，其特征在于核苷酸序列是SEQ NO I。
2.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求I所述的人肠激酶轻链基因。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，它含有Tac启动子。
4.一种工程菌,其特征在于,它含有权利要求3所述的表达载体。
5.如权利要求4所述的工程菌，其特征在于，它是大肠杆菌。
6.如权利要求I所述的人工合成的人肠激酶轻链基因的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤 1)构建含有人工合成的hE&基因的重组质粒pMAL-s-hEI^； 2)将重组质粒pMAL-s-hEKL转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株； 3)将工程菌接种到LB培养基溶液中培养，当工程菌培养液浓度OD6tltlnm达到O.6-0. 8时，加入终浓度为O. 1-1. OmM的IPTG，37°C诱导表达3_6小时，离心收集菌体，超声破碎后离心，取上清， 4)用Amylose亲和层析的方法纯化得到目的蛋白MBP-hEKp
全文摘要
本发明提供了一种能在大肠杆菌中高效表达人肠激酶基因及其产物的表达纯化方法，具体是根据已报道的人肠激酶轻链的核苷酸序列和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与人肠激酶轻链氨基酸序列一致的人肠激酶轻链的核苷酸序列，进行体外合成，在大肠杆菌中得到高效表达，并利用亲和纯化得到高活力的MBP-hEKL融合蛋白。该方法适合于人肠激酶的大规模制备。该重组蛋白能特异性识别和切割含有肠激酶切割位点的底物，能够作为工具蛋白酶用于重组融合蛋白融合标签的去除，且适用于生物工程制药业、基因工程、生物化学和分子生物学等方面的研究。
文档编号C12N15/70GK102911955SQ20121041015
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者钮利喜, 杨斌盛, 石亚伟, 李娇, 吉雪雪 申请人:山西大学