专利名称：一种用金磁微粒纯化植物种子基因组dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取植物种子基因组DNA的方法。
背景技术：
转基因技术自70年代问世以来，已在多种作物品种改良得到应用。利用该项技术，不仅在品种间，而且在不同科属种间可以进行性状转移；克服远缘杂交的不亲合性；改良作物品质；提高作物抗逆性；从而实现多种目标性状的转移。实践证明，该项技术在作物品种改良方面具有广阔的应用前景，是一种行之有效的育种新途径。在该技术实现过程中， 对植物种子基因组DNA提取及纯化非常关键。核酸纯化方法大体上可分为两种，一种是酚氯仿抽提液相纯化法，一种是固相纯化法。酚氯仿抽提法主要通过有机相-水相分配来除去杂质达到纯化核酸的目的。固相纯化法则通过核酸与固相介质的非特异可逆性结合，从而达到纯化核酸的目的，其结合方式主要包括吸附结合和离子交换结合。传统的几种植物种子基因组DNA提取方法存在一些缺点。如CTAB法和SDS法需要酚氯仿反复抽提与离心，耗费大量的时间，人力、物力。此外，现有的植物种子基因组DNA 纯化的文献报道基本上都是针对一种植物，如针对含多糖较高的植物如水稻、含脂质较多的植物如棉花籽或含蛋白较多的植物如黄豆等开发的有针对性的方法。因为不同植物的组织材料，由于其化学成分、组织结构等差异，在提取基因组DNA时需选择不同的方法或作一些特殊的处理，这为实验带来极大的不便。目前，从植物种子样本中纯化DNA的试剂盒还较少，其中又以离心柱法为其主流的手动操作方法，价格昂贵且步骤繁琐，不利于广大科研系统使用，纯化效果也不理想。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用磁性纳米复合材料进行简便、快速纯化多种植物种子基因组DNA的方法，以解决背景技术操作不便、成本较高、纯度低、纯化率低等问题。本发明的技术方案一种用金磁微粒纯化植物种子基因组DNA的方法，包括以下步骤1)制备含有基因组DNA的样品裂解液取植物种子样本，加入200 800 μ 1含有质量体积比为2 0Z0 5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2 % 5 %的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0. 5 % 2 % β -巯基乙醇的裂解液；混勻后于水浴中充分裂解5 30min，再加入10 50 μ 1的10mg/ml RNase 溶液，得到含有基因组DNA的样品裂解液；(“质量体积比”的单位即g/ml，表示该溶质的质量与该种裂解液的体积的比)2)用氯仿抽提后离心用0.6ml 1.2ml氯仿在所述样品裂解液中进行样本抽提，然后SOOOrpm 13000rpm离心5min，得到含有基因组DNA的上清；
3)结合取400 1000 μ g金磁微粒与含有基因组DNA的上清混合，在结合缓冲液的作用下，形成含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液；4)清洗对含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液进行磁性分离，弃去上清液，再加入清洗液混勻，磁性分离，弃上清，得到金磁微粒-基因组DNA复合物；5)洗脱将洗脱液与金磁微粒-基因组DNA复合物混勻，使基因组DNA从金磁微粒上转到洗脱液中，磁性分离直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即为纯化得到的基因组DNA溶液。上述步骤1)中所述裂解液含有质量体积比为2% 5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 2% 5%的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0.5% 2% β-巯基乙醇、 0. 005 0. OlM 乙二胺四乙酸(EDTA)、0· 5 2Μ NaCl 和 0. 05 0. 2MTris_HCl。上述步骤幻中的结合缓冲液优选聚乙二醇与氯化钠的混合溶液，其中氯化钠的终浓度为IM 3M，聚乙二醇(PEG)的分子量在6000 10000之间，浓度为10% 30% ； 也可以采用公知的其他结合缓冲液。上述步骤5)中所述洗脱液优选含有IOmM Tris-HCl和ImM EDTA、pH = 8. 0的TE 溶液或无核酶水。上述步骤2、采用氯仿只需进行一次样本抽提。上述步骤4)中所述清洗液是50% 85%的乙醇。上述步骤1)中所述水浴的最佳温度为50 65°C。本发明的优点1、本发明采用的裂解液，适用于所有植物种子。2、得到的基因组DNA不含有抑制下游PCR反应的抑制剂；DNA质量高、得率高，DNA
完整性好。3、不需要反复抽提与离心，减少了机械使用中的物理性剪切，亦避免了离心过程对基因组DNA的破坏。4、不需要分步裂解，步骤简便，时间短，全部过程只需要45 60min左右(根据不同种子，只需调整裂解时间即可)，从而大大缩短了提取DNA的时间。5、该纯化方法操作简便，纯化过程快速，成本低廉。
图1是从种子中提取的基因组DNA的电泳图；其中泳道M XHind III ；泳道1 从黄豆中提取的基因组DNA ；泳道2 从油菜籽中提取的基因组DNA ；泳道3 从玉米中提取的基因组DNA。
具体实施方式
利用磁性载体进行核酸纯化是近年来发展起来的一种DNA纯化的思路，即利用具有超顺磁性的纳米或微米级球形颗粒作为固相介质来非特异性的吸附核酸，在外加磁场的作用下将DNA-磁性微粒复合体与蛋白质、多糖等杂质分离开来，可省去反复离心、过滤等繁杂的操作，减少了过多的机械剪切作用对核酸造成的损伤，而当撤去磁场后，磁性微粒很快均勻分散于溶液中。由于它具有操作简便、纯度高等特点，越来越受到人们的亲睐，并且它易于实现自动化，满足了样本中大规模建库等高通量操作的需求。金磁微粒是指采用以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包裹单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒。所述磁性纳米粒子包括狗304、Y -Fe2O3等铁的氧化物粒子，单质i^、Co、Ni粒子，或由!^e与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性纳米粒子的聚集体是指经修饰后形成的狗304、y -Fe203等铁的氧化物粒子聚集体，经修饰后形成的单质i^、c0、m粒子聚集体，或经修饰后形成的狗与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子聚集体。以下结合实施例对本发明即金磁微粒纯化植物种子基因组DNA的方法进一步的说明。实施例1 用金磁微粒从黄豆中纯化基因组DNA的方法1)植物样本裂解1. 1)称取大于IOOmg的黄豆，用研钵研磨至细粉状，后准确称取IOOmg置于2ml离心管中，加入300 μ 1裂解液2% 5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2% 5%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0. 5% 2% β-巯基乙醇、0. 005 0. OlM乙二胺四乙酸(EDTA)、0. 5 2Μ NaCl, 0. 05 0. 2Μ Tris-HCl，涡旋混勻，于65°C水浴25min (期间每隔5min颠倒离心管1次)，取出离心管，室温静置Imin ；1. 2)在离心管中加入30 μ 1 10mg/ml的RNase溶液，吹吸混勻，于37°C水浴5min， 取出离心管。2)氯仿抽提在离心管中加入0. 7ml氯仿，轻摇5min充分混勻离心管中成分，于室温， 8000rpm 13000rpm 离心 5min。3)结合3. 1)充分摇勻金磁微粒，用移液器移取100 μ 1金磁微粒于2ml离心管中，磁性分离lmin，弃上清。从磁性分离器上取出离心管，加入200 μ 1结合液，吹吸混勻。3. 2)从离心机中取出离心管，吸取上清(此步骤尽量小心吸取上清约300 μ 1，勿吸取到有机相)于步骤3. 1)的离心管中，吹吸混勻，于室温充分结合，室温静置5min，磁性分离2min，弃上清。4)清洗4. 1)在离心管中加入200 μ 1清洗液1，移液器吹吸混勻，磁性分离2min，尽量弃上清。4. 2)在离心管中加入200 μ 1清洗液2，移液器吹吸混勻，磁性分离2min，尽量弃上清。重复此步骤一次。5)洗脱
打开离心管盖，将离心管置于磁性分离器上室温晾干5min。在离心管中加入 100 μ 1 洗脱液(IOmM Tris-HClUmM EDTA、pH = 8. 0)，移液器吹打混勻，于 60°C水浴 5min。 磁性分离直至上清澄清，上清即为纯化的基因组DNA，将上清转移到另一离心管中，可直接用于后续实验或于-20°C低温保存。根据紫外测得结果显示，从IOOmg的黄豆中可以得到15 25 μ g的基因组DNA，纯度在1.7 1.9之间。实施例2 用金磁微粒从油菜籽中纯化基因组DNA的方法1)植物样本裂解1. 1)称取大于IOOmg的油菜籽，用研钵研磨至细粉状，后准确称取IOOmg置于2ml 离心管中，加入200 μ 1裂解液2% 5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2% 5%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0. 5% 2% β-巯基乙醇、0. 005 0. OlM乙二胺四乙酸(EDTA)、0. 5 2Μ NaCl, 0. 05 0. 2Μ Tris-HCl，涡旋混勻，于65°C水浴25min (期间每隔5min颠倒离心管1次)，取出离心管，室温静置Imin ；1. 2)在离心管中加入40 μ 1 10mg/ml的RNase溶液，吹吸混勻，于37°C水浴5min， 取出离心管。2)氯仿抽提在离心管中加入0. 6ml氯仿，轻摇5min充分混勻离心管中成分，于室温， 8000rpm 13000rpm 离心 5min。3)结合3. 1)充分摇勻金磁微粒，用移液器移取100 μ 1金磁微粒于2ml离心管中，磁性分离lmin，弃上清。从磁性分离器上取出离心管，加入200 μ 1结合液，吹吸混勻。3. 2)从离心机中取出离心管，吸取上清(此步骤尽量小心吸取上清约300 μ 1，勿吸取到有机相)于步骤3. 1)的离心管中，吹吸混勻，于室温充分结合，室温静置5min，磁性分离2min，弃上清。4)清洗4. 1)在离心管中加入200 μ 1清洗液1，移液器吹吸混勻，磁性分离2min，尽量弃上清。4. 2)在离心管中加入200 μ 1清洗液2，移液器吹吸混勻，磁性分离2min，尽量弃上清。重复此步骤一次。5)洗脱打开离心管盖，将离心管置于磁性分离器上室温晾干5min。在离心管中加入 100 μ 1 洗脱液(IOmM Tris-HClUmM EDTA、pH = 8. 0)，移液器吹打混勻，于 60°C水浴 5min。 磁性分离直至上清澄清，上清即为纯化的基因组DNA，将上清转移到另一离心管中，可直接用于后续实验或于-20°C低温保存。根据紫外测得结果显示，从IOOmg的油菜籽中可以得到10 20 μ g的基因组DNA， 纯度在1.7 1.9之间。实施例3 用金磁微粒从玉米中纯化基因组DNA的方法1)植物样本裂解1. 1)称取大于IOOmg的玉米，用研钵研磨至细粉状，后准确称取IOOmg置于2ml离心管中，加入200 μ 1裂解液2% 5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2% 5%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0. 5% 2% β-巯基乙醇、0. 005 0. OlM乙二胺四乙酸(EDTA)、0. 5 2Μ NaCl, 0. 05 0. 2Μ Tris-HCl，涡旋混勻，于65°C水浴30min (期间每隔5min颠倒离心管1次)，取出离心管，室温静置Imin ；1. 2)在离心管中加入50 μ 1 10mg/ml的RNase溶液，吹吸混勻，于37°C水浴5min， 取出离心管。2)氯仿抽提在离心管中加入Oml氯仿，轻摇5min充分混勻离心管中成分，于室温，8000rpm 13000rpm 离心 5min。3)结合3. 1)充分摇勻金磁微粒，用移液器移取100 μ 1金磁微粒于2ml离心管中，磁性分离lmin，弃上清。从磁性分离器上取出离心管，加入200 μ 1结合液，吹吸混勻。3. 2)从离心机中取出离心管，吸取上清(此步骤尽量小心吸取上清约300 μ 1，勿吸取到有机相)于步骤3. 1)的离心管中，吹吸混勻，于室温充分结合，室温静置5min，磁性分离2min，弃上清。4)清洗4. 1)在离心管中加入200 μ 1清洗液1，移液器吹吸混勻，磁性分离aiiin，尽量弃上清。4. 2)在离心管中加入200 μ 1清洗液2，移液器吹吸混勻，磁性分离2min，尽量弃上清。重复此步骤一次。5)洗脱打开离心管盖，将离心管置于磁性分离器上室温晾干5min。在离心管中加入 100 μ 1 洗脱液(IOmM Tris-HClUmM EDTA、pH = 8. 0)，移液器吹打混勻，于 60°C水浴 5min。 磁性分离直至上清澄清，上清即为纯化的基因组DNA，将上清转移到另一离心管中，可直接用于后续实验或于-20°C低温保存。根据紫外测得结果显示，从IOOmg的玉米中可以得到5 10 μ g的基因组DNA，纯度在1.7 1.9之间。
权利要求
1.一种用金磁微粒纯化植物种子基因组DNA的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1)制备含有基因组DNA的样品裂解液取植物种子样本，加入200 800 μ 1含有质量体积比为2% 5%的聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、2% 5%的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0. 5% 2% β -巯基乙醇的裂解液；混勻后于水浴中充分裂解5 30min，再加入10 50 μ 1的10mg/ml RNase溶液，得到含有基因组DNA的样品裂解液；2)用氯仿抽提后离心用0. 6ml 1. 2ml氯仿在所述样品裂解液中进行样本抽提，然后8000rpm 13000rpm 离心5min，得到含有基因组DNA的上清；3)结合取400 1000 μ g金磁微粒与含有基因组DNA的上清混合，在结合缓冲液的作用下，形成含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液；4)清洗对含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液进行磁性分离，弃去上清液，再加入清洗液混勻，磁性分离，弃上清，得到金磁微粒-基因组DNA复合物；5)洗脱将洗脱液与金磁微粒-基因组DNA复合物混勻，使基因组DNA从金磁微粒上转到洗脱液中，磁性分离直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即为纯化得到的基因组DNA溶液。
2.根据权利要求1所述的用金磁微粒纯化植物种子基因组DNA的方法，其特征在于 步骤1)中所述裂解液含有质量体积比为2% 5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2% 5%的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0. 5% 2% β -巯基乙醇、0. 005 0. OlM乙二胺四乙酸(EDTA)、0. 5 2Μ NaCl 和 0. 05 0. 2Μ Tris-HCl。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤幻中的结合缓冲液是聚乙二醇与氯化钠的混合溶液，其中氯化钠的终浓度为IM 3Μ，聚乙二醇(PEG)的分子量在6000 10000之间，浓度为10% 30%。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤5)中所述洗脱液是含有IOmM Tris-HCl和ImM EDTA, pH = 8. O的TE溶液或无核酶水。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤幻采用氯仿只进行一次样本抽提。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤4)中所述清洗液是50% 85%的乙醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤1)中所述水浴的温度为50 65°C。
全文摘要
本发明提供一种利用磁性纳米复合材料进行简便、快速纯化多种植物种子基因组DNA的方法。本发明样品裂解是取植物种子样本，加入200～800μl含有质量体积比为2％～5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为0.5％～2％β-巯基乙醇的裂解液；混匀后于水浴中充分裂解5～30min，再加入10～50μl的10mg/ml RNase溶液，得到含有基因组DNA的样品裂解液。本发明采用的裂解液，适用于所有植物种子。得到的基因组DNA不含有抑制下游PCR反应的抑制剂；DNA质量高、得率高，DNA完整性好。
文档编号C12N15/10GK102344920SQ20111031497
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者崔亚丽, 张景阁, 晁旭, 李谭杰, 赵稳操, 魏旭旭 申请人:西安金磁纳米生物技术有限公司