专利名称：金磁微粒表面功能化修饰方法及其在生物分子检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于化学合成领域，尤其涉及一种对金磁微粒表面功能化修饰的方法及其
经功能化修饰后的金磁微粒用于生物分子的检测。
背景技术：
纳米技术在科技高速发展的今天，其应用领域日益广泛，纳米材料的光学性质用 于生物分子的检测已逐渐走上科技的舞台。目前利用纳米金粒子的特殊光学性质对生物分 子进行检测已有较多的报道，但其存在着纳米金粒子标记生物分子不方便且费时的缺点。
组装型磁性复合微粒和核/壳型超顺磁性复合微粒的制备方法以及结构组成已 经在中国专利ZL 03153486. 4和ZL 03124061. 5分别进行了公开，但未涉及纳米级磁性复 合微粒的表面修饰功能化修饰以便于偶联生物分子，且使其具有纳米金类似的光学性质以 便用于生物分子检测的相关内容。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简单，操作简便快捷的金磁微粒表面功能化修饰方 法，经表面功能化修饰后的金磁微粒理化性质良好，通过修饰后功能基团可以进一步连接 蛋白、核酸、药物等，从而将磁性纳米颗粒更好地应用于生物医药领域。
本发明的技术解决方案是 本发明通过用盐酸去除纳米金磁体系中未包裹的氧化物粒子，和Au与SH-的反应
使纳米金磁有了很好的分散性和具有纳米金类似的光学性质，同时在PBS，生理盐水的条件
下不发生团聚，能更便于偶联生物分子而仍然具有好的分散性和光学性质。
该金磁微粒表面功能化修饰方法，其特殊之处在于，该方法包括以下步骤 1)酸处理去除金磁微粒未包裹的氧化物粒子 1. 1)向烧杯中加入金磁微粒和盐酸，制得混合物； 1. 2)将烧杯置于可控温控速的摇床上反应； 1.3)反应过程中取样，将取样样品放入离心管中，置于磁铁上磁性分离，弃去上 清，下层沉淀物中再加入超纯水反复吹打混匀，磁性分离，去上清，反复清洗后，将沉淀物加 入超纯水中保存，所得沉淀物即为经酸处理后的金磁微粒；
2)酸处理后金磁微粒的表面功能化修饰 2. 1)取步骤1)得到的经酸处理后的金磁微粒加入圆底离心管中，加入十六烷基 三甲基溴化铵，充分混匀后置于可控温控速的摇床上反应；
2. 2)反应完后超声，边超声边摇动； 2. 3)超声完毕后，加入盐酸，使反应溶液的pH值为1. 0 1. 5，然后加入巯基化的
修饰试剂，立刻用铝箔纸将离心管包住，置于可控温控速的摇床上反应； 2. 4)反应完成后，将离心管置于磁铁上磁性分离，去上清，下层沉淀物中加入超纯水反复吹打混匀，置于磁铁上磁性分离，反复清洗后，将沉淀物放入超纯水中保存，所得沉 淀物即为表面功能化修饰的金磁微粒。 上述步骤1. 1)中在加入金磁微粒和盐酸后用水稀释，使金磁微粒在该混合液中 的最终浓度为2mg/ml，盐酸在该混合液中的的最终浓度为1. 0 1. 5M为宜，其中盐酸在该 混合液中的的最终浓度为1. 5M时为最佳。 上述步骤1. 2)摇床转速为80 120rpm，反应温度为20 25。C为宜，反应时间应 控制在30 90min范围内为宜，低于该反应时间范围不能将氧化物粒子除去，高于该反应 时间范围会影响金磁微粒的磁学性质。 上述步骤1. 3)沉淀物用超纯水至少清洗两次，否则残留的盐酸会影响后续的表 面修饰，其中该沉淀物用超纯水清洗三次为宜。 上述步骤2. 1)十六烷基三甲基溴化铵与步骤1. 1)金磁微粒的体积比为1 : 1 1 : 2，十六烷基三甲基溴化铵的摩尔浓度为50mM，摇床转速为150 200rpm，温度为20 25。C，反应时间为20 30min。
上述步骤2. 2)超声时间为10 15min。 上述步骤2. 3)所加盐酸的摩尔浓度为0. 2 0. 5M，所加的体积为50ul ;所加
巯基化的修饰试剂与步骤1. 1)金磁微粒的加入体积比的比例不小于l : 2;摇床转速为
180rpm，温度为20 25。C，反应时间至少为4h。 上述步骤1. 3)和步骤2. 4)的磁铁为5000高斯磁铁。 上述步骤2.3)超声完毕后，加入盐酸，使反应溶液的pH值为l.O为最佳。 上述步骤1. 3)所述的取样是在放入摇床后的40 90min内的任一时间取样，取
样的量为15ml，其中在放入摇床后的40min取样为最佳。 上述步骤2. 3)巯基化的修饰试剂为HS-PEG-NH2 、 HS_PEG_CH3、 HS-PEG-COOH、 HS-C2H4-CONH-PEG-0-C3H6-COOH、 HS-PEG-NHCO-C2H4-CONH-NH_Boc、 HS-PEG-HS、 HS-DNA、硫辛
酸或各种巯基末端的烷烃。 上述金磁微粒为核壳型金磁微粒。 步骤1)是将金磁微粒进行酸处理，目的除去未包裹的氧化物粒子，因为氧化物的 粒子的存在会严重干扰纳米金磁作为生物分子检测工具的性能，尤其是光学性质，酸处理 的的要求在于金磁微粒的终浓度是2mg/ml，盐酸的终浓度1. 5M，摇床转速是100rpm，温度 在20-25t:，在40min取样时最好，此时能得到氧化物粒子明显减少且磁性较好的金磁微 粒。 步骤2)是将金磁微粒表面功能化修饰，使金磁微粒分散且具有功能基团，在一定 量的表面活性剂和机械力的作用下，具体是加入的酸处理金磁微粒与浓度为50mM的十六 烷基三甲基溴化铵的体积比最好为1 : 1，然后在摇床上充分反应，摇床转速是180rpm，温 度控制在20 25°C ，反应时间20 30min，然后在超声10min作用下打开团聚的金磁微粒， 此过程要求在酸性条件下进行，且在高分子的巯基化合物条件下反应，具体是加入摩尔浓 度为O. 5M的盐酸50ul，使反应溶液的ra值在1. 0-1. 5的范围内，然后加入巯基化的修饰试 剂(HS-PEG-NH2， HS-PEG-CH3， HS-PEG-COOH等高分子巯基化试剂)加入量为200ul，摇床转 速为180rpm，温度控制在20 25。C，反应4h以上，得到表面功能化修饰的金磁微粒。
上述方法制备出的表面功能化修饰的金磁微粒可用于生物分子的检测。本发明的优点是 该金磁微粒表面功能化修饰方法工艺简单，操作简便快捷；并且通过修饰后的功 能基团可以进一步连接蛋白、核酸、药物等，从而将磁性纳米颗粒更好地应用于生物医药领 域。
图1是表面功能化修饰的金磁微粒的平面结构图之一。
图2是表面功能化修饰的金磁微粒的平面结构图之二。
图3是金磁微粒不经过酸处理和表面功能化修饰的TEM图。
图4是金磁微粒经60min酸处理后的TEM图片。
图5是金磁微粒经过巯基化修饰试剂修饰的TEM图片。 图6是金磁微粒酸处理修饰前后的颜色变化的图片。其中a为未处理的金磁微粒， b为经酸处理后的金磁微粒，c为表面功能化修饰的金磁微粒。 图7是金磁微粒经60min酸处理且表面功能化修饰前后的吸收光谱的变化的图 片，a线表示酸处理和表面功能化修饰前的吸收光谱，b线表示酸处理60min后的吸收光谱， c线表示表面功能化修饰后的吸收光谱。
具体实施方式
实施例1 : 在洗净的250ml的烧杯中加入金磁微粒100mg (固体物含量)，再加入一定量摩尔 浓度为2M的盐酸，加水稀释，使该混合液的总体积为50ml，使金磁微粒在混合液的终浓度 为2mg/ml，盐酸在混合液的终浓度为1. 5M。此时，金磁微粒还没有经过酸处理，该金磁微粒 的TEM图如图3所示。将烧杯至于可控温控速的摇床上反应，摇床转速为100rpm，温度在 20-25t:，反应开始时开始计时。在放入摇床后的40min时取样，取15ml。将取样样品置于 50ml离心管中，置于5000高斯磁铁上磁性分离，用5ml的微量加样器吸取上清液并弃去上 清，然后用5ml的微量加样器加入10ml的超纯水并反复吹打混匀，再次置于5000高斯磁铁 上磁性分离，重复上述清洗磁性分离弃去上清三遍后加入10ml的超纯水保存。这时发现经 过酸处理的金磁微粒变成了蓝色，如图6(b)所示。 取经酸处理后的金磁微粒200ul加入2ml的圆底离心管中，然后加入50mM的 十六烷基三甲基溴化铵200ml，充分混匀后，置于可控温控速的摇床上反应，摇床转速为 180rpm，温度控制在20 25。C，反应时间为20 30min。反应完后超声10 15min，边超 声边摇动，超声完后，加入摩尔浓度为0. 5M的盐酸50ul，使反应溶液的ra值在1. O，然后加 入巯基化的修饰试剂HS-PEG-CH3200ul，加入巯基化试剂后立刻用铝箔纸将反应离心管包 住，然后置于可控温控速的摇床上反应，摇床转速为180rpm，温度控制在20 25°C ，反应4h 以上。将离心管置于5000高斯磁铁上磁性分离，用lml的微量加样器吸取上清液并弃去上 清，然后用lml的微量加样器加入2ml的超纯水并反复吹打混匀，再次置于置于5000高斯 磁铁上磁性分离用，重复上述清洗磁性分离弃去上清三遍后加入lml的超纯水中。此时可 明显看见经表面功能化修饰后的金磁微粒由蓝色变成的粉红色，如图6(c)所示。图5是金 磁微粒经过巯基化修饰试剂修饰的TEM图，从图中看到修饰后的金磁微粒有了很好的分散性。图1和图2是表面功能化修饰后的金磁微粒的平面结构图。
实施例2 : 在洗净的250ml的烧杯中加入金磁微粒100mg(固体物含量)，再加入一定量摩尔 浓度为2M的盐酸，加水稀释，使该混合液的总体积为50ml，使金磁微粒在混合液的终浓度 为2mg/ml，盐酸在混合液的终浓度为1. 5M。此时，金磁微粒还没有经过酸处理，该金磁微粒 的TEM图如图3所示。将烧杯至于可控温控速的摇床上反应，摇床转速为100rpm，温度在 20-25t:，反应开始时开始计时。在放入摇床后的60min时取样，取15ml。将取样样品置于 50ml离心管中，置于5000高斯磁铁上磁性分离，用5ml的微量加样器吸取上清液并弃去上 清，然后用5ml的微量加样器加入10ml的超纯水并反复吹打混匀，再次置于5000高斯磁铁 上磁性分离，重复上述清洗磁性分离弃去上清三遍后加入10ml的超纯水保存。这时发现经 过酸处理的金磁微粒变成的蓝色，如图6所示。图4是经60min酸处理后的金磁微粒的TEM 图。 取经酸处理后的金磁微粒200ul加入2ml的圆底离心管中，然后加入50mM的 十六烷基三甲基溴化铵200ml，充分混匀后，置于可控温控速的摇床上反应，摇床转速为 180rpm，温度控制在20 25。C，反应时间为20 30min。反应完后超声10 15min，边超 声边摇动，超声完后，加入摩尔浓度为0. 5M的盐酸50ul，使反应溶液的ra值在1. O，然后加 入巯基化的修饰试剂HS-PEG-COOH 200ul，加入巯基化试剂后立刻用铝箔纸将反应离心管 包住，然后置于可控温控速的摇床上反应，摇床转速为180rpm，温度控制在20 25°C ，反应 4h以上。将离心管置于5000高斯磁铁上磁性分离，用lml的微量加样器吸取上清液并弃去 上清，然后用lml的微量加样器加入2ml的超纯水并反复吹打混匀，再次置于置于5000高 斯磁铁上磁性分离用，重复上述清洗磁性分离弃去上清三遍后加入lml[的超纯水中。此时 可明显看见经表面功能化修饰后的金磁微粒由蓝色变成的粉红色，说明修饰后的金磁微粒 有了很好的分散性，如图6所示。图5是金磁微粒经过巯基化修饰试剂修饰的TEM图，从图 中看到修饰后的金磁微粒有了很好的分散性。图1和图2是表面功能化修饰后的金磁微粒 的平面结构图。图7是金磁微粒经60min酸处理且表面功能化修饰前后的吸收光谱的变化 的图片，a线表示酸处理和表面功能化修饰前的吸收光谱，b线表面酸处理后的吸收光谱，c 线表示表面功能化修饰后的吸收光谱。 实施例1和实施例2得到的表面功能化修饰的金磁微粒可用于生物分子的检测。
权利要求
一种金磁微粒表面功能化修饰方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)酸处理去除金磁微粒未包裹的氧化物粒子1.1)向烧杯中加入金磁微粒和盐酸，制得混合物；1.2)将烧杯置于可控温控速的摇床上反应；1.3)反应过程中取样，将取样样品放入离心管中，置于磁铁上磁性分离，弃去上清，下层沉淀物中再加入超纯水反复吹打混匀，磁性分离，去上清，反复清洗后，将沉淀物加入超纯水中保存，所得沉淀物即为经酸处理后的金磁微粒；2)酸处理后金磁微粒的表面功能化修饰2.1)取步骤1)得到的经酸处理后的金磁微粒加入圆底离心管中，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀后置于可控温控速的摇床上反应；2.2)反应完后超声，边超声边摇动；2.3)超声完毕后，加入盐酸，使反应溶液的pH值为1.0～1.5，然后加入巯基化的修饰试剂，立刻用铝箔纸将离心管包住，置于可控温控速的摇床上反应；2.4)反应完成后，将离心管置于磁铁上磁性分离，去上清，下层沉淀物中加入超纯水反复吹打混匀，置于磁铁上磁性分离，反复清洗后，将沉淀物放入超纯水中保存，所得沉淀物即为表面功能化修饰的金磁微粒。
2. 根据权利要求1所述的金磁微粒表面功能化修饰方法，其特征在于步骤1. 1)加入金磁微粒和盐酸后用水稀释，使金磁微粒在该混合液中的最终浓度为 2mg/ml，盐酸在该混合液中的最终浓度为1. 0 1. 5M ;步骤1. 2)摇床转速为80 120rpm，反应温度为20 25°C，反应时间为30 90min ; 步骤1. 3)沉淀物用超纯水至少清洗两次；步骤2. 1)十六烷基三甲基溴化铵与步骤1. 1)金磁微粒的体积比为1 : 1 1 : 2， 十六烷基三甲基溴化铵的摩尔浓度为50mM，摇床转速为150 200rpm，温度为20 25°C， 反应时间为20 30min ;步骤2. 2)超声时间为10 15min ;步骤2. 3)所加盐酸的摩尔浓度为0.2 0. 5M，所加的体积为50ul ;加入巯基化的修饰 试剂与步骤1. 1)金磁微粒的体积比不小于1 : 2 ;摇床转速为180rpm，温度为20 25°C， 反应时间至少为4h ;步骤1. 3)和步骤2. 4)的磁铁为5000高斯磁铁。
3. 根据权利要求1或2所述的金磁微粒表面功能化修饰方法，其特征在于步骤1. 1)向烧杯中加入金磁微粒和盐酸，再加超纯水稀释使盐酸在该混合液中的最 终浓度为1. 5M ;步骤1. 3)沉淀物用超纯水清洗三次；步骤2. 3)超声完毕后，加入盐酸，使反应溶液的pH值为1.0。
4. 根据权利要求3所述的金磁微粒表面功能化修饰方法，其特征在于步骤1. 3)所述 的取样是在放入摇床后的40 90min内的任一时间取样，取样的量为15ml。
5. 根据权利要求4所述的金磁微粒表面功能化修饰方法，其特征在于步骤1. 3)所述 的取样是在放入摇床后的40min时取样。
6. 根据权利要求5所述的金磁微粒表面功能化修饰方法，其特征在于步骤2. 3)巯基化的修饰试剂为HS-PEG-NH2、 HS-PEG-CH3、 HS-PEG-COOH、 HS-C2H4-C0NH-PEG-0-C3H6_C00H、 HS-PEG-NHC0-C2H4-C0NH-NH-Boc、 HS-PEG-HS、 HS-DNA、硫辛酸或各种巯基末端的烷烃。
7. 根据权利要求6所述的金磁微粒表面功能化修饰方法，其特征在于所述金磁微粒 为核壳型金磁微粒。
8. 如权利要求1所述的方法制备出的表面功能化修饰的金磁微粒可用于生物分子的 检测。
全文摘要
本发明属于化学合成领域，尤其涉及一种对金磁微粒表面功能化修饰的方法及其经功能化修饰后的金磁微粒用于生物分子的检测。该修饰方法包括酸处理去除金磁微粒未包裹的氧化物粒子；酸处理后金磁微粒的表面功能化修饰。该方法工艺简单，操作简便快捷，经表面功能化修饰后的金磁微粒理化性质良好，通过修饰后功能基团可以进一步连接蛋白、核酸、药物等，可用于生物分子的检测，解决了现有纳米金粒子标记生物分子不方便且费时的缺点，从而将磁性纳米颗粒更好地应用于生物医药领域。
文档编号G01N33/15GK101694492SQ20091021843
公开日2010年4月14日 申请日期2009年10月21日 优先权日2009年10月21日
发明者崔亚丽, 惠文利, 晁旭, 石峰, 陈超 申请人:陕西北美基因股份有限公司;