检测全血中氮末端脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片的制作方法

检测全血中氮末端脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种检测全血中氮末端脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，所述微流控芯片包括顶板(1)结构和底板(2)结构，其中顶板(1)上的气泵(3)、加样口(4)、样本填充区(12)、标记抗体存储池(5)和样本混合区(13)依次相连；底板(2)上的过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、清洗区(14)、检测区(8)依次连接，底板(2)上检测区(8)通过液体释放通道(16)与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)连接。
【专利说明】
检测全血中氮末端脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种利用磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术实现NT-proBNP高灵敏定量检测的方法，特别公开了一种检测全血中氮末端脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，实现了心脑血管疾病尤其是心力衰竭中NT-proBNP的快速准确定量检测，可广泛用于基层医院和诊所，属于微流控芯片化学发光免疫检测技术领域。
【背景技术】
[0002]目前用于临床检测的BNP有NT-proBNP和BNP两种。虽两者有相同生物学来源，但生物学效应和临床意义不完全相同。心肌细胞受刺激后，产生初始基因产物前BNP前体，该肽的一个26氨基信号肽被立即切除，生成BNP前体(proBNP，108个氨基酸)，前体在内切酶作用下裂解为无生物活性的NT-proBNP(76个氨基酸)和有活性的BNP(32个氨基酸hBNP清除主要通过与清除受体结合，半衰期短(22min)，体外稳定性差;而NT-proBNP则主要由肾小球滤过，半衰期较长(120min)，体外稳定性强。
[0003 ] BNP和NT-Prο BNP已广泛用于临床实践，成为心衰诊断的生物标志物。测定NT-proBNP主要方法有放射免疫法、电化学发光法和胶体金法等。放射免疫法存在放射线辐射和污染等问题。电化学发光法较放射免疫法更为敏感、准确，精密，但成本昂贵，需要配套化学发光仪才能检测。胶体金免疫层析法虽简便快速，但灵敏度低、重复性差。
[0004]中国专利200720140928.5，公布了一种氮末端脑钠肽前体/C-反应蛋白/肌钙蛋白I诊断试纸，利用快速免疫层析法，定性检测临床标本中NT-proBNP/C-反应蛋白/肌钙蛋白
I。该法灵敏度低、线性范围窄。中国专利201010241048.3公布了一种免疫层析试纸条的测试使用及应用这种测试方法的NT-proBNP快速定量试剂。其采用上转发光材料作为生物标记物，检测NT-proBNP，但仍未解决试纸条重复性差的缺陷。
[0005]因此开发快速、准确、灵敏度高的检测方法，具有巨大发展潜力和应用前景。与荧光和吸收光相比，化学发光没有外来激发光源背景信号干扰，交叉干扰小，灵敏度高、线性范围宽。微流控芯片技术把样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，可完成全过程分析。
[0006]针对现有NT-proBNP检测方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化学发光方法利用磁微粒化学发光和微流控技术，可实现对NT-proBNP准确、高灵敏定量检测。

【发明内容】

[0007]本发明要解决的技术问题为针对现有快速诊断方法灵敏度低、重复性差、受干扰明显，以及现有化学发光配套仪器昂贵、检测时间长的问题，提供一种检测全血中氮末端脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，通过集成化芯片(把除测试样本外所有组分均集成到芯片内)并配套小型便携设备，从而实现现场样本中NT-proBNP的快速、准确、高灵敏定量检测。
[0008]为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为:
[0009]—种检测全血中氮末端脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括顶板(I)结构和底板(2)结构，其中顶板(I)上的气栗(3)、加样口(4)、样本填充区(12)、标记抗体存储池(5)和样本混合区(13)依次相连;底板(2)上的过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、清洗区(14)、检测区(8)依次连接，底板(2)上检测区(8)通过液体释放通道(16)与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)连接;所述标记配体存储池(5)、清洗液存储池(9)、发光基底液存储池(10)和磁颗粒包被区(7)中存储预封装试剂;所述标记配体存储池(5)、清洗液存储池(9)、发光基底液存储池(10)为液体密封池，可通过外力挤压而局部破裂，释放液体;所述标记抗体存储池(5)中存储酶或发光剂标记抗NT-proBNP抗体溶液；所述磁颗粒包被区(7)包被磁颗粒标记抗NT-proBNP抗体；
[0010]所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集。
[0011 ]具体地，所述酶标记抗NT-proBNP抗体使用的酶包含过氧化氢酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)0
[0012]具体地，所述发光剂标记抗NT-proBNP抗体使用的发光剂包含吖啶酯和吖啶磺酰胺。
[00?3] 具体地，所述磁颗粒标记抗NT-proBNP抗体优选的磁颗粒为超顺磁性颗粒，颗粒尺寸为0.1?ΙΟμπι，磁感应强度为500?30000高斯。
[0014]优选地，所述磁颗粒为超顺磁性颗粒，包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，颗粒尺寸为I?3μπι，磁感应强度为1000?8000高斯。
[0015]具体地，所述酶或发光剂标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl缓冲液;所述磁颗粒标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐温_20和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl缓冲液。
[0016]本发明所述微流控芯片制备方法如下:
[0017]步骤I)酶或发光剂标记抗NT-proBNP抗体，磁颗粒标记抗NT-proBNP抗体，这两种抗体可相同或不同；
[0018]步骤2)将酶或发光剂标记抗体溶液放入顶板的存储池中，密封，将磁颗粒标记抗体溶液放入底板的包被区中，干燥，将清洗液和发光基底液分别注入清洗液存储池和发光基底液存储池中，密封，用胶带(19和20)密封顶板和底板，并组装成微流控芯片。
[0019]本发明提供的检测全血中氮末端脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片是一种以化学发光为基础、在微流控芯片上实现氮末端脑钠肽快速、准确、高灵敏检测的新方法。[°02°] 这种方法是将抗NT-proBNP抗体修饰酶，抗NT-proBNP抗体修饰在磁颗粒上，利用抗原抗体作用，如双抗体夹心法原理结合磁颗粒富集、化学发光检测样本中是否含有NT-ProBNP，并准确分析其含量。
[0021]本发明中所述的发光基底液为酶对应的发光底物(如鲁米诺或金刚烷)和发光增强液(如苯衍生物等增强剂)，其中发光底物和发光增强液可合并，如图1所示混合均匀后注入一个发光基底液存储池(10);但当混合液保质期少于I年时应分开，如图3所示分别注入发光基底液存储池A( 23)和发光基底液存储池B (24),通过预混合通道(25)混合均匀。本发明一个实施例采用过氧化氢酶。
[0022]本发明所述发光剂与发光基底液作用后，不需酶的催化作用，直接参与发光反应。本发明的一个实施例采用吖啶酯。发光基底液包含H2O2溶液和碱性溶液，可合并成碱性H2O2溶液，注入发光基底液存储池(10);但当稳定性不好时，H2O2溶液和碱性溶液应分别注入发光基底液存储池A( 23)和发光基底液存储池B(24)，通过预混合通道(25)混合均匀，如图3所不O
[0023]本发明采用的标记方法包含化学交联或生物分子间特异性作用将抗NT-proBNP抗体连接到酶/发光剂或磁颗粒表面，得到抗体标记的酶/发光剂或抗体标记的磁颗粒。
[0024]本发明的NT-proBNP抗体包含单克隆抗体和多克隆抗体。该抗体可与NT-proBNP结合(如双抗体夹心法)。其中酶/发光剂标记的抗体与磁颗粒标记的抗体可以相同，也可以不同。
[0025]本发明的酶或发光剂标记抗体溶液和磁颗粒标记抗体溶液均包含缓冲液、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，且磁颗粒标记抗体溶液还包含糖类。其中HRP标记的配体，缓冲体系中不能含有NaN3; ALP标记配体，缓冲体系不能是磷酸体系。
[0026]本发明的微流控芯片如图1所示，包含顶板结构(I)和底板结构(2)，以胶带(19和20)密封后，组装形成微流控芯片。顶板和底板的成型材料为聚合物，包含但不限于聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、环氧树脂等，胶带可为双面胶或单面胶，其中双面胶可用两片单面胶替代。如图1所示，顶板结构由气栗(3)、加样口(4)、标记抗体存储池(5)、盖子(11)、样本填充区(12)和样本混合区(13)组成。底板结构由过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、检测区(8)、清洗液存储池(9)、发光基底液存储池(1)、清洗区(14)、废液池(15)和液体释放通道(16)。如图2所示，在发光基底液和清洗液存储池区域，以及磁铁滑轨区域，在顶板上需留出存储池和磁铁滑轨的让位孔(分别为17和18)，在双胶带上应留出存储池和样本混合液流入过滤区时的让位孔(分别为21和22)。
[0027]本发明的存储池为液体密封池，所用密封材料包含玻璃、塑料、橡胶、铝箔和高阻隔薄膜，其中密封材料可为同种材料组成，也可为多种材料组合而成。在物理挤压下，存储池可局部破裂，从而把密封的液体释放出来。其中酶标配体存储池、清洗液存储池、发光基底液存储池可采用相同或不同材料和方法制作。在本发明的一个实施例中，酶标配体存储池、清洗液存储池、发光基底液存储池均采用塑料和弹性橡胶密封而成。本发明的另一个实施例中，酶标配体存储池采用塑料和弹性橡胶密封而成，而清洗液存储池、发光基底液存储池采用高阻隔薄膜密封而成。
[0028]本发明的过滤区包含滤血膜，其中滤血膜可通过物理孔径或生物/化学试剂使液体与细胞分离，实现血浆与红细胞分离，血浆流到磁颗粒包被区，而红细胞停留在滤血膜上，从而减少红细胞对试验结果的干扰。其中所述生物/化学试剂包含凝血剂等，可使红细胞间连接，形成凝块，增大尺寸，更容易被滤血膜的网状结构阻挡。
[0029]本发明的微流控芯片，当存在发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)，应在底板上增加发光基底液预混合通道(25)，该预混合通道可为蛇形通道或上下结构混合通道，如图3所示。
[0030]在一个实施例中，标记抗体存储池(5)封入HRP标记抗NT-proBNP抗体，包被区包被磁颗粒标记抗NT-proBNP抗体(与酶标抗体不同)，以磁微粒酶促化学发光法检测NT-proBNP。另一个实施例中，标记抗体存储池(5)封入吖啶酯标记抗NT-proBNP抗体，包被区包被磁颗粒标记抗NT-proBNP抗体(与吖啶酯标记抗体不同)，以磁微粒酶促化学发光法检测NT-proBNP。
[0031]本发明的清洗液，用于清洗磁颗粒，去除非特异性吸附的NT-proBNP、酶或发光剂标记物及其他影响检测结果的物质。清洗液主要包含缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，其中缓冲体系包含但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐等。清洗液pH 6.0?10.0，当检测样本为强酸或强碱性时，pH范围可放宽。其中蛋白质包含但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白等。其中表面活性包含但不限于可包括吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙稀基卩比略烧酬等。
[0032]作为优选，本发明一个实施例中，清洗液为包含牛血清白蛋白、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.0 Tris_HCl缓冲液。另一个实施例中，清洗液为牛血清白蛋白、吐温20、曲拉通X-100和Proclin30(^9pH7.4磷酸盐缓冲液。
[0033]本发明的样本体积在10?500μ1，优选20?ΙΟΟμΙ。作为优选，在实施例中加样体积为50μ1。
[0034]本发明的微流控芯片为快速检测，检测时间应小于30分钟，作为优选，实施例中采用15分钟。
[0035]本发明的抗体仪器包含挤压气栗和存储池，磁铁移动，发光检测系统等功能，应可包含挤压装置、磁铁及移动装置、检测系统、控制分析模块和软件系统。
[0036]本发明所述微流控芯片的测试流程包括:
[0037]步骤I)将全血样本滴入加样口(4)后，微流控芯片放入配套仪器中，从标记配体存储池(5)释放酶或发光剂标记抗NT-proBNP抗体，挤压气栗(3)使样本经样本填充区(I 2)和酶或发光剂标记抗NT-proBNP抗体在样本混合区(13)混合均匀，然后注入底板过滤区(6)；
[0038]步骤2)样本经过滤区后，溶解磁颗粒包被区(7)包被的磁颗粒标记抗NT-proBNP抗体，充分反应后磁铁收集磁颗粒，清洗液存储池(9)释放清洗液，将磁颗粒清洗后，移至检测区，发光基底液存储池(10)释放发光基底液，仪器检测系统检测发光信号强度，进而实现NT-proBNP的定量检测。
[0039]本发明可应用于心血管疾病尤其是心力衰竭中NT-proBNP的定量检测。
[0040]本发明的核心是采用磁微粒化学发光免疫检测技术在微流控芯片实现NT-proBNP的快速、高灵敏度、准确定量检测。
[0041]微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。
[0042]本发明在微流控芯片将检测过程所需的所有试剂组分(酶标抗体、磁颗粒标记抗体、清洗液、发光基底液等)均集成、内置到微流控芯片中，并通过巧妙沟道设计，在配套仪器的操作下，实现微流控芯片的一键式检测(只需按开始键就能实现检测，无需复杂操作)，实现全血分离、免疫反应、清洗分离、化学发光检测，从而避免了现有微流控芯片中结构设计简单、检测时操作复杂等不足和缺陷。还克服了传统化学发光仪只能进行血清或血浆检测，而不能对全血样本进行检测的缺点。
[0043]由于磁颗粒易沉淀，传统化学发光仪采用手工混合，并以持续振荡维持磁颗粒的悬浮状态，但微流控芯片内磁颗粒混均操作难以在小型便携仪器中实现。
[0044]本发明将磁颗粒包被、干燥于微流控芯片沟道中，并设计了磁铁主动驱动磁颗粒(而传统微流控芯片一般采用流体驱动或电驱动)，从而使磁颗粒复溶，并在微流控芯片不同区域实现免疫反应、清洗、发光。此设计不仅解决了磁颗粒应用于微流控芯片时易沉淀、重复性差等问题，还实现了更可控的免疫反应和物理清洗，提高了灵敏度和重复性。其中磁铁磁性和磁颗粒尺寸对检测效果了明显影响，本发明选择磁铁磁感应强度为500?30000高斯，优选1000?8000高斯;磁颗粒尺寸为0.1?10μ??，优选I?3μηι。
[0045]本发明中微流控芯片配套仪器与微流控芯片无液体接触，无需要清洗的部件，避免了传统大型化学发光仪需要搅拌或加样、清洗等操作而产生的交叉干扰及污染。
[0046]所以本发明并非简单叠加磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术，而是通过液体密封设计、沟道设计，把检测所需所有化学组分集成、内置到微流控芯片中，并以磁铁主动驱动，实现一键式的磁微粒化学发光免疫检测，从而在便携配套仪器中实现NT-proBNP的快速、高灵敏度、准确定量检测。
[0047]本发明的主要优点如下:
[0048]I)本发明采用化学发光方法，具有背景低、灵敏度高、线性范围宽的优点。
[0049]2)本发明采用磁颗粒技术，具有磁富集功能，增强并放大信号;并能利用磁铁把磁颗粒转移区域(如由包被区-清洗区-检测区)，减少样本基质的影响。
[0050]3)本发明采用微流控芯片技术，把样本混合、反应、分离和检测集成在芯片上，并把反应所需的所有试剂组分集成到芯片上。
[0051]4)本发明操作简便，检测时，只需加入样本，盖上盖子，把芯片放入小型便携配套仪器中即可。
[0052]5)本发明配套仪器是小型便携仪器，仪器只与芯片发生物理接触，芯片内液体不与仪器接触，不会污染仪器而产生交叉干扰。
【附图说明】
[0053]图1为微流控芯片主体结构示意图，其中I为顶板，2为底板，3为气栗，4为加样口，5为标记抗体存储池，6为过滤区，7为磁颗粒包被区，8为检测区，9为清洗液存储池，10为发光基底液存储池，11为盖子，12为样本填充区，13为样本混合区，14为清洗区，15为废液池，16为液体释放通道，17为发光基底液和清洗液存储池让位孔(于顶板)，18为磁铁滑轨让位孔。
[0054]图2为完整微流控芯片的结构示意图，其中I为顶板，2为底板，19为双面胶带，20为单面胶带，21为发光基底液和清洗液存储池让位孔(于双面胶带)，22为混合液流入过滤区时的让位孔。
[0055]图3为双发光基底液的微流控芯片底板结构示意图，其中23为发光基底液存储池A，24为发光基底液存储池B，25为预混合通道。
【具体实施方式】
[0056]本发明公开了一种检测全血中氮末端脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0057]为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0058]实施例1:酶促化学发光测定NT-proBNP
[0059](— )抗体标记
[0060]取5yg HRP溶解于ImL蒸馏水中，再加入0.2mL0.1M新配Na14溶液，室温避光反应20min后，以ImM pH4.4醋酸钠缓冲液透析纯化溶液。再以0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液调节pH至9.0，加入1yg抗NT-proBNP单抗，室温避光反应2h。加0.1mL新配的4mg/mL NaBH4液，混匀，于4 °C反应2h ο将上述溶液装入透析袋，以0.15M pH7.4 PBS透析，4 °C过夜，得到HRP标记NT-proBNP 抗体。
[0061 ] 向磷酸缓冲液中加入Img磁颗粒(尺寸为2μπΟ、1yg EDC和15yg NHS溶液和10?30yg抗NT-proBNP单抗(与HRP标记的抗体不同)溶液，混合均勾并于室温下反应4h，加入Img甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到磁颗粒标记NT-proBNP抗体。
[0062](二)微流控芯片组装
[0063]HRP标记NT-proBNP抗体溶液中含0.2%牛血清白蛋白、0.I %吐温20和0.02%Proclin30(^tlpH7.4 Tris-HCl缓冲液;磁颗粒标记NT-proBNP抗体溶液为包含0.5 %牛血清白蛋白、I %葡萄糖、0.2 %吐温20和0.02 %Procl in300的pH7.4 Tris_HCl缓冲液。
[0064]将HRP标抗体溶液放入顶板标记抗体存储池中，密封。将磁标抗体溶液放入底板磁颗粒包被区中，室温干燥。
[0065]清洗液为0.3 %牛血清白蛋白、0.2 %曲拉通X-100和0.02% Procl in300的pH7.0Tri s-HCl缓冲液。将清洗液注入清洗液存储池。发光基底液分为HRP底物(鲁米诺的双氧水溶液)和碱性增强液(苯衍生物的碱性溶液)，分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)中，密封。按图1所示，将滤血膜粘入底板过滤区中，将存储池内置入底板。然后按图2所示，以单面胶带和双面胶带，将顶板和底板组装成微流控芯片。装入铝箔袋中，密封4°保存。
[0066](三)样本检测
[0067]用正常人血楽作稀释液，将NT-proBNP标准品稀释成如下浓度:0pg/ml、5pg/ml、50pg/ml、500pg/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、lOOOng/ml和5000ng/ml。
[0068]将50μ1样本滴入加样口后，盖上盖子。将微流控芯片放入配套仪器(磁铁磁感应强度为6000高斯)中，仪器挤出HRP标记单抗，并使样本和HRP标记单抗混合均匀后注入底板过滤区。样本过滤后，到达微通道，并溶解磁颗粒标记单抗，磁铁加速样本反应，形成HRP标记单抗-NT-proBNP抗原-磁颗粒标记单抗的三明治结构，然后磁铁收集磁颗粒。清洗液存储池释放清洗液，将磁颗粒清洗后，发光基底液释放，仪器检测系统检测发光信号强度。总检测时间15min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线。
[0069]将50μ1全血样本滴入加样口，15分钟内仪器检测系统检测发光信号强度，依据标准曲线获得样本中NT-proBNP浓度。
[0070]检测原理为:当全血加入微流控芯片后，全血先与HRP标记抗体混合，然后经过滤区后，混合了HRP标记抗体的血浆到达微通道，血浆溶解磁标记抗体。当血样中含有NT-proBNP，则形成HRP标记抗体-NT-proBNP-磁颗粒标记抗体的三明治结构(双抗体夹心法)。经清洗后，再发光基底液作用下发光，仪器检测系统测试发光信号。依据配套仪器获取的标准曲线，进而分析血样中NT-proBNP浓度。样本中NT-proBNP含量越高，则发光信号越强。[°071 ]结果表明，其最低检测限为1.0pg/ml，最低定量限为10pg/ml，定量检测范围为1.0?35000pg/ml，线性相关系数R2>0.99 ；在检测范围内，未出现HOOK效应;且批内与批间重复性均小于10%。可为心梗心衰疾病诊断提供参考。
[0072]实施例2:直接化学发光测定NT-proBNP
[0073](一)抗体标记
[0074]向磷酸缓冲液中加入适量活化的吖啶酯和10yg抗NT-proBNP单抗溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入Img甘氨酸封闭。透析后，得到吖啶酯标记NT-proBNP抗体。
[0075]向Iml 1mM pH7.4磷酸缓冲液中加入Img磁颗粒(尺寸为Ιμπι)、1yg EDC和15ygNHS溶液和20yg链霉亲和素，混合均匀并于室温下反应4h，加入Img甘氨酸封闭。以磁铁吸附富集，去除未反应的链霉亲和素，得到磁颗粒标记链霉亲和素。
[0076]将1yg抗NT-proBNP单抗加入5yL0.25mg/mL Sulfo-NHS-LC-b1tin溶液中，反应I h。以超滤离心管纯化，去除未反应的生物素。得到生物素化抗NT-proBNP抗体。
[0077]通过亲和素-生物素间的相互作用，把抗NT-proBNP抗体连接到磁颗粒表面，得到磁颗粒标记NT-proBNP抗体。其中亲和素标记的磁颗粒和生物素化的抗体比例为1:1O4。
[0078](二)微流控芯片组装
[0079]吖啶酯标记NT-proBNP抗体溶液中含0.1 %牛血清白蛋白、0.05 %吐温20和0.05 %Proclin30(^^pH7.4磷酸缓冲液;磁颗粒标记NT-proBNP抗体溶液为包含0.2 %牛血清白蛋白、0.1%酪蛋白、2%蔗糖、0.2%吐温20、0.1%曲拉通父-100和0.02%卩抓(31111300的？!17.4磷酸缓冲液。将口丫啶酯标记抗体溶液放入顶板标记抗体存储池中，密封。将磁标抗体溶液放入底板磁颗粒包被区中，室温干燥。
[0080]清洗液为0.3%牛血清白蛋白、0.1 %吐温20、0.2%曲拉通X-100和0.02%Proclin300的pH7.0磷酸盐缓冲液。将清洗液注入清洗液存储池。发光基底液分为包含H2O2溶液和碱性溶液，分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)，密封。按图1所示，将滤血膜粘入底板过滤区中，将存储池内置入底板。然后按图2所示，以单面胶带和双面胶带，将顶板和底板组装成微流控芯片。装入铝箔袋中，密封4°保存。
[0081](三)样本检测
[0082]用正常人血楽作稀释液，将NT-proBNP标准品稀释成如下浓度:0pg/ml、5pg/ml、50pg/ml、500pg/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、lOOOng/ml和5000ng/ml。
[0083]将50μ1样本滴入加样口后，盖上盖子。将微流控芯片放入配套仪器(磁铁磁感应强度为2000高斯)中，仪器挤出吖啶酯标记单抗，并使样本和吖啶酯标记单抗混合均匀后注入底板过滤区。样本过滤后，到达微通道，并溶解磁颗粒标记单抗，磁铁加速样本反应，形成吖啶酯标记抗体-NT-proBNP抗原-磁颗粒标记抗体的三明治夹心结构，然后磁铁收集磁颗粒。清洗液存储池释放清洗液，将磁颗粒清洗后，发光激发液释放，仪器检测系统检测发光信号强度。总检测时间15min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线。
[0084]将50μ1全血样本滴入加样口，15min内仪器检测系统检测发光信号强度，依据标准曲线获得样本中NT-proBNP浓度。
[0085]检测原理为:当全血加入微流控芯片后，全血先与吖啶酯标记抗体混合，然后经过滤区后，混合了吖啶酯标记抗体的血浆到达微通道，血浆溶解磁标记抗体。当血样中含有NT-proBNP，贝Ij形成吖啶酯标记抗体-NT-proBNP-磁颗粒标记抗体的三明治结构(双抗体夹心法)。经清洗后，发光基底液释放，经混合后与吖啶酯作用产生直接化学发光，仪器检测系统测试发光信号。依据配套仪器获取的标准曲线，进而分析血浆中NT-proBNP浓度。血浆中NT-proBNP含量越高，则发光信号越强。
[0086]结果表明，其最低检测限为5.0pg/ml，最低定量限为20pg/ml，定量检测范围为5.0?35000pg/ml，线性相关系数R2>0.99 ；在检测范围内，未出现HOOK效应;且批内与批间重复性均小于10%。可为心梗心衰疾病诊断提供参考。
[0087]实施例3:磁微粒颗粒尺寸筛选
[0088]其他的实验条件参见实施例2，磁颗粒尺寸和磁铁磁感应强度按照以下方案进行。
[0089]颗粒尺寸为0.1μπι、0.5μηι、0.7μηι、1μηι、2.4μηι、3μηι、ΙΟμπι。磁铁磁感应强度为500高斯、1000尚斯、4000尚斯、8000尚斯、12000尚斯、30000尚斯。分别以这八种磁铁分别驱动七种尺寸的磁颗粒。
[O(M)] 实验结果显示:0.Ιμπι磁颗粒和500高斯磁铁组合使用时，其最低检测限为40pg/ml，定量检测范围为40?20000pg/ml，线性相关系数R2>0.90;批内与批间重复性均小于
20 %。即:化学发光信号较弱，灵敏度不高，重复性较差。
[0091]ΙΟμπι磁颗粒和30000高斯磁铁组合使用时，其最低检测限为50pg/ml，定量检测范围为50?15000pg/ml，线性相关系数R2>0.92;批内与批间重复性均小于20%。即:阴性样本信号较高(清洗不充分)，线性范围不宽。
[0092]I?3μπι的磁颗粒为和1000?8000高斯的磁铁组合使用时，其最低检测限均小于30?8/!111，定量检测范围可达到30?3000(^8/1111，线性相关系数1?2>0.95;批内与批间重复性均小于12%。满足为临床心梗心衰疾病诊断提供参考的需要。
[0093]根据以上结果，磁颗粒尺寸优选I?3μηι，磁铁磁感应强度优选1000?8000高斯。可根据磁颗粒所用尺寸，进一步确定磁铁磁感应强度。
[0094]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种检测全血中氮末端脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括顶板(I)结构和底板(2)结构，其中顶板(I)上的气栗(3)、加样口(4)、样本填充区(12)、标记抗体存储池(5)和样本混合区(13)依次相连;底板(2)上的过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、清洗区(14)、检测区(8)依次连接，底板(2)上检测区(8)通过液体释放通道(16)与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)连接;所述标记配体存储池(5)、清洗液存储池(9)、发光基底液存储池(10)和磁颗粒包被区(7)中存储预封装试剂;所述标记配体存储池(5)、清洗液存储池(9)、发光基底液存储池(10)为液体密封池，可通过外力挤压而局部破裂，释放液体;所述标记抗体存储池(5)中存储酶或发光剂标记抗NT-proBNP抗体溶液；所述磁颗粒包被区(7)包被磁颗粒标记抗NT-proBNP抗体;所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集。2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述磁颗粒标记抗NT-proBNP抗体使用的磁颗粒为超顺磁性颗粒，磁颗粒尺寸为0.1?ΙΟμπι，与磁颗粒匹配的磁感应强度为500-30000高斯。3.如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述磁颗粒为超顺磁性颗粒，磁颗粒尺寸为I?3μπι，与磁颗粒匹配的磁感应强度为1000-8000高斯。
【文档编号】G01N33/68GK205484063SQ201520828567
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年10月26日
【发明人】王东, 李泉
【申请人】深圳华迈兴微医疗科技有限公司