纯化凝固蛋白的手段和实施其的方法

专利名称：纯化凝固蛋白的手段和实施其的方法
技术领域：
本发明涉及纯化可用作药物的活性成分的凝固蛋白的领域。 现有技术凝固蛋白构成药物的有效成分已有很长时间。在用作药物活性成分的凝固蛋白中，可特别提到因子VII、因子VIII、凝血酶或血管性血友病因子(von Willebrand factor)0直到最近，只能通过从人血浆中纯化得到凝固蛋白。在过去几年中，以重组蛋白的方式已得到一些凝固蛋白，这些重组蛋白在转基因哺乳动物的体液中，例如在转基因哺乳动物的奶中产生。在所有情况下，包含凝固蛋白的待纯化的起始材料由具有复杂构成的材料组成， 其中目的蛋白和非常大量的物质共同存在，这些物质包括蛋白质、脂类、碳水化合物、氨基酸、矿物盐、细胞碎片和代谢废物例如尿素、尿酸或胆红素。因此，考虑到供人使用的药物营销所需要的健康和管理特性，开发纯化凝固蛋白的方法是一项复杂的任务。可以理解，在计划用于预防或治疗凝血疾病的药物中，用作活性成分的凝固蛋白应当以高度纯化的形式存在，并且不与能够对有机体产生不利的不理想的物质包括其他凝固蛋白、白蛋白、免疫球蛋白或上述蛋白质的降解产物相关联。纯化多种凝固蛋白的方法是已知的，包括纯化因子VIII、抗-凝血酶-III、纤溶酶原、因子VII或血管性血友病因子。所有已知方法包括一连串基于蛋白质沉淀的步骤、通过层析基质的步骤、接着是连续洗脱步骤、深层过滤步骤、超滤步骤或浓缩步骤的选择-分离步骤。值得一提的是，开发纯化凝固蛋白的方法需要长时间的研究和对连续中间产物的一致性的多次控制，以保证将得到的终产物具有高纯度，为非修饰的形式，并且基本上不含不理想的物质，无论这些方法完全是新的，或这些方法是已知方法的改良，甚至是微小的改良。特别地，对具有酶活性的凝固蛋白，例如因子VII、VIII和XI，纯化的最终蛋白质必须是非激活的。然而，在纯化步骤的任一步中凝固蛋白倾向于被激活，包括在层析步骤中，如果没有坚持预设的设定状态(例如滤器或使用的层析基质的质量、盐浓度或温度)的话。上面提及的至少部分解释了为什么已知方法不包括基于下述原理的亲和层析步骤，即目的凝固蛋白在嫁接在层析底物上的配体上的特异性固定，然后在层析洗脱液中回收纯化的蛋白质。在纯化治疗目的的蛋白质的方法中缺乏亲和层析纯化步骤也可通过此技术的缺点解释，其中观察到嫁接在亲和基质上的配体分子的部分脱离，发现所述配体分子和纯化的治疗蛋白质在洗脱液体积中相结合。可以理解在用于治疗凝血障碍的药物中存在可能对有机体不利的层析基质的组成物质是被医学条例所禁止的。尽管纯化凝固蛋白的已知方法是符合要求的，在现有技术中需要替代方法或与先有方法相比改进的方法。发明概述本发明涉及用于选择性结合凝固蛋白的亲和基质，其包含在其上固定了特异性结合所述凝固蛋白的核酸适配子(nucleic aptamer)的固体基质材料。在一些实施方案中，所述核酸适配子由脱氧核糖核酸适配子组成。另外本发明的一个主题是在基质上固定凝固蛋白的方法，其包括下述步骤，即使包含所述凝固蛋白的样品与亲和基质接触。本发明也涉及纯化凝固蛋白的方法，其包括以下步骤a)使包含凝固蛋白的样品与如上定义的亲和基质接触，以在(i)在所述亲和基质上固定的核酸适配子和(ii)所述凝固蛋白之间形成复合物，和b)从在步骤a)中形成的复合物中释放所述蛋白，和c)回收纯化形式的所述凝固蛋白。本发明也涉及重组人凝固蛋白的纯化组合物，其包含至少99. 9%以重量计的所述重组人蛋白质，并且其基本上不含非人蛋白质。附图简述

图1显示了在使用固定了抗-人FVII核酸适配子的亲和基质纯化兔奶中产生的重组人因子VII的方法的实施中得到的层析谱。沿χ-轴时间；沿y_轴在254nm处的吸光度值(OD)。图2表示随时间变化的在^Onm处的吸光度测量值曲线。图3是SDS PAGE电泳凝胶图，其上具有能够相对定量条带的考马斯亮蓝染色。在图3中凝胶从左至右的泳道表示以下初始产物的迁移结果，图从左至右为-泳道‘‘2”或‘iMD"初始组合物Betafact ,
-泳道‘‘3”或‘‘NR”对应图2的层析谱的1号峰的非留存部分，
-泳道‘‘4” 或‘ 1”对应图2的层析谱的2号峰的洗脱部分。 图4表示随时间变化的在^Onm处的吸光度测量值曲线。 图5是SDS PAGE电泳凝胶图。在图5中凝胶从左至右的泳道表示以下初始产物
的迁移结果-泳道“E5”通过MEP HyperCel层析步骤纯化的包含转基因人因子IX的转基因母猪奶的初始组合物，-泳道‘ 6”对应图4的层析谱的1号峰的非留存部分，-泳道“E7”对应图4的层析谱的2号峰的洗脱部分，-泳道‘ 8”对应图4的层析谱的3号峰的再生部分，-泳道“TFIX” 纯化的人血浆因子IX对照。 图6表示随时间变化的在^Onm处的吸光度测量值曲线。在图6中，1号峰对应未在柱中留存的初始产物的部分。2号峰对应洗脱部分。图7表示初始产物和洗脱产物的凝胶图，通过SDS PAGE分析和硝酸银染色以显现杂质的消除1号泳道对应初始产物，2号泳道对应洗脱部分。尽管初始产物具有相当高的纯度，值得一提的是洗脱部分不再包含任何污染物或降解的形式。图8表示Mapt2固定适配子与转基因兔奶中产生的重组人因子VII的结合曲线。箭头对应不同注射的时间，在图8上从左至右分别为1 重组因子VII的注射；2 包含IM NaCl的缓冲液的注射；3 包含2M NaCl的缓冲液的注射；4 包含3M NaCl的缓冲液的注射； 5 包含IOmM EDTA的50mM Tris缓冲液的注射。沿χ-轴时间，以秒表示；沿y_轴响应信号的值，以任意单位(RU)表示。图9表示Mapt2固定适配子与转基因兔奶中产生的重组人因子VII的结合曲线。 箭头对应不同注射的时间，在图9上从左至右分别为1 :50%丙二醇；2 =IOmM的EDTA。发明详述在长时间的研究后，申请者开发了纯化凝固蛋白的方法，其包括层析步骤，其中目的蛋白与预固定在层析基质上的配体特异性结合，并然后释放留存在所述基质上的目的蛋白质，回收洗脱液中的纯化蛋白质。更具体地，根据本发明，提供了用于纯化凝固蛋白的方法，其包括目的凝固蛋白与上面固定了特异性结合所述目的蛋白质的核酸适配子的基质结合的步骤，和其后的回收所述纯化的目的蛋白质的步骤。令人惊讶地，根据本发明已显示在其上固定了特异性针对目的凝固蛋白的核酸适配子(即以包含这样的核酸适配子的固定化合物的形式)的亲和层析基质可成功地用于得到可用作药物活性成分的凝固蛋白的方法。本发明涉及选择性结合凝固蛋白的亲和基质，其包含在其上固定了特异性结合所述凝固蛋白的核酸适配子(即以包含这样的核酸适配子的固定化合物的形式)的固体基质材料。特异性结合目的凝固蛋白的核酸适配子分子以及包含这些核酸适配子的化合物构成了所述固体基质材料携带的特异性结合所述靶蛋白质的位点。术语“核酸适配子”包含具有5-120个核苷酸长度的单链核酸，且其特异性结合凝固蛋白。措辞“包含核酸适配子的化合物”也包含下述化合物，其在结构中包含上面定义的所述核酸。因此，包含特异性结合人或哺乳动物凝固蛋白的脱氧核糖核酸的化合物包含下述化合物，其中所述核酸被包含在含有生物素分子的结构中。根据本发明已显示如上定义的亲和基质能够有效固定目的凝固蛋白，其在本说明书中也可被称为“靶蛋白质”。如上定义的亲和基质具有吸附靶蛋白质的高容量，因为使固体基质接触包含待纯化的凝固蛋白的液体溶液使固体基质携带的靶位点饱和至少50%成为可能。根据本发明也已显示，与核酸适配子分子特异性结合的凝固蛋白可随后以至少 75%的良好产量从亲和基质上被洗脱。此外，已显示本发明的亲和基质对目的凝固蛋白具有高特异性，因为发现所述凝固蛋白可具有相对洗脱液中包含的蛋白质总重量高达以重量计99. 95%的范围的纯度。如在实施例中所说明的，使用包含高纯度的靶凝固蛋白(例如相对所述初始产物中包含的蛋白质总重量以重量计超过98% )的组合物作为初始产物，使用根据本发明的亲和基质，目的凝固蛋白的纯度可进一步得到2个数量级的提高。值得一提的是包括当在初始产物中存在的杂质具有与希望纯化的靶凝固蛋白非常接近的结构或物理化学特性时，在纯度中也能得到这样的提高。也已显示本发明的亲和基质使纯化基本序列截然不同的凝固蛋白，例如人因子VII和人因子IX成为可能。也已显示本发明的亲和基质使从复杂组合物的初始介质(例如富含人因子IX的血浆组合物和来自人因子IX转基因动物的奶)中纯化凝固蛋白成为可能，且所述亲和基质具有与所述目的凝固蛋白结合的高特异性。也已显示本发明的亲和基质使从也包含非人直向同源蛋白质的初始介质中选择性纯化人凝固蛋白成为可能，例如从人因子IX转基因动物的奶中，所述奶也包含由所述转基因动物天然产生的因子IX，由所述转基因动物天然产生的所述因子IX(或内源FIX)可为例如猪FIX。也已显示本发明的亲和基质使从也包含非人直向同源蛋白质的初始介质中选择性纯化人凝固蛋白成为可能，例如从人因子VII转基因动物的奶中，所述奶也包含由所述转基因动物天然产生的因子VII，由所述转基因动物天然产生的所述因子FVII (或内源 FVII)可为例如兔FVII。重要地，已显示特别是对于从复杂组合物(例如血浆或所述目的凝固蛋白的转基因哺乳动物的体液)中纯化目的凝固蛋白，得到本发明的亲和基质的上述高吸附能力、良好产量和高特异性的特征。也已显示核酸适配子在固体基质上的固定是不可逆的和长效的，因为在洗脱液溶液中未检测到从基质上脱离的核酸适配子的存在。特别地，已显示本发明的亲和基质可通过在洗脱后去除保持与基质结合的蛋白质被“再生”非常多次而没有显著的下述损伤(i)其对靶凝固蛋白的吸附能力，(ii)其针对所述靶蛋白质的特异性，或(iii)对固定在固体基质材料上的核酸适配子的不进行释放。 此外，可根据已知技术和使用已知再生试剂，例如尿素实施本发明的亲和基质的再生。核酸用作目的凝固蛋白的配体具有许多优势。由于其寡核苷酸的性质，适配子具有弱免疫原性和对严格物理化学条件(尿素、DMS0、极酸或极碱的pH的存在，使用有机溶剂或高温)的高抗性，在用作亲和配体的情况下，这允许多种用于控制健康安全，特别是有关病毒或非常规病原体的安全的策略。此外，它们具有高度的选择性。最后，如已经提及的， 适配子的生产涉及相对有限的成本。因此，本发明的亲和基质的上述特征的组合使所述亲和基质能够被用作纯化凝固蛋白的手段，因为-所述亲和基质使实施纯化具有非常高纯度的凝固蛋白的方法成为可能。-所述亲和基质未被检测到释放不理想的物质，特别是未检测到核酸适配子分子释放至包含纯化的凝固蛋白的洗脱液的溶液中。-核酸适配子分子的可能脱离不导致有关人健康的缺点，-当凝固蛋白具有酶活性时，目的凝固蛋白在亲和基质上的结合和然后洗脱不导致所述凝固蛋白以可检测得到的量的形成激活形式，-生产所述亲和基质相对便宜，这特别归功于核酸适配子生产的低成本，和-所述亲和基质用于纯化凝固蛋白的使用自身相对便宜，这归功于所述基质的长寿命，特别因为其再生多次的可能性，和持续长时间。此外，如已经提及的，在从构成复杂的介质中，特别是从工业规模上常规使用的介质，例如人血浆或培养基或包含所述目的蛋白质的生物液中纯化的方法中，本发明的亲和基质能够以可逆的方式选择性结合靶凝固蛋白并具有良好的产量和良好的特异性。此外，如在本说明书中稍后将详细说明的，本发明的亲和基质适于处理大体积的包含目的凝固蛋白的溶液。本发明的亲和基质因此构成纯化凝固蛋白的工具，其极佳地适于在工业规模上使用。根据本发明的亲和基质的其他优势将稍后在本说明书中详细说明，或者涉及亲和基质自身的描述，或者涉及纯化凝固蛋白的方法，其中使用所述亲和基质。就申请者所知，本发明首次描述了包含固定化核酸适配子的亲和基质，用于在工业规模上使用的条件下纯化凝固蛋白。此外，特异性针对凝血酶、针对因子VII和针对因子 IX的多种核酸适配子是现有技术中已知的(见PCT申请号WO 02/26932)。为了本发明的目的，术语“选择性结合”旨在指通过使亲和基质接触合适组成的溶液(其也可被称为洗脱溶液)，使目的凝固蛋白与亲和基质的固定化核酸成分的特异性非共价结合，所述结合是可逆的，在所述亲和基质上所述核酸和所述目的蛋白质之间形成非共价复合物。根据本发明，术语“凝固蛋白”旨在指在导致血凝块形成的级联反应链中涉及的任意蛋白质。凝固蛋白包含因子I (纤维蛋白原)、因子II (凝血酶原)、因子V(前加速素)、 因子VII (前转变素)、因子VIII (抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或PTA)、因子XII (Hageman因子)、因子XIII (纤维蛋白稳定因子或FSF)、PK (前激肽释放酶)、HMWK (高分子量激肽原)、组织促凝血酶原激酶、肝素辅因子II (HCII)、蛋白质C(PC)、凝血调节蛋白(TM)、蛋白质S(PS)、血管性血友病因子 (vffF)和组织因子途径抑制剂(TFPI)，或其他组织因子。在一些实施方案中，凝固蛋白由具有酶活性的凝固蛋白组成。具有酶活性的凝固蛋白包括因子II (凝血酶原)、因子VII (前转变素)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或PTA)、因子 XII (Hageman因子)、因子XIII (纤维蛋白稳定因子或FSF)、PK (前激肽释放酶)。在一些优选的实施方案中，凝固蛋白由天然或重组人凝固蛋白组成。在优选的实施方案中，凝固蛋白是天然或重组人因子VII。通常，在其上可固定本发明的适配子的固体基质包括具有通常在过滤基质、膜等中可见的结构和组成的任意类型的基质。固体基质特别包括树脂、亲和层析柱树脂、聚合物珠、磁珠、顺磁性珠、过滤膜的基质材料，等等。固体基质也特别包括基于玻璃或金属的材料，例如钢、金、银、铝、铜、硅、玻璃或陶瓷。固体基质也特别包括聚合物材料，例如聚乙烯、 聚丙烯、聚酰胺、聚偏乙烯及其组合。在一些实施方案中，固体基质上可包被便于和适配子、或和包含所述适配子的化合物连接、结合、形成复合体、固定或相互作用的材料。在一些实施方案中，固体基质是玻璃载片，其表面覆盖金层，已经过羧甲基化处理的层，葡聚糖层，胶原层，抗生物素蛋白层，链霉抗生物素层，等等。这样，根据本发明的适配子，或根据本发明的包含所述适配子的化合物可通过例如上述附着涂料的方式，被固定在固体基质上，或者通过生成共价键的化学反应，或者通过经非共价键的连接，例如氢键、静电力、范德华力，等等。实施例描述了根据本发明的亲和基质的实施方案，其中核酸适配子通过包含结构中其的化合物经非共价键固定在固体基质材料上。在实施例中，特别描述了包含在其表面嫁接链霉抗生物素分子的固体基质材料的亲和基质，在包含适配子的化合物结构中包含的核酸适配子在其一端与生物素分子偶联， 并且所述适配子通过基质材料的链霉抗生物素分子和包含所述核酸适配子的化合物的生物素分子之间的非共价固定化固定在所述固体基质材料上。在实施例中，描述了包含在其上嫁接链霉抗生物素分子的基质材料的亲和基质的一个实施方案。这些固体基质材料是容易商业获得的。措辞“特异性结合凝固蛋白的核酸”或“适配子”或“核酸适配子”旨在指具有结合给定目的凝固蛋白的能力的DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)分子，所述能力比结合任意其他蛋白质的能力更强。在一些实施方案中，根据本发明的亲和基质的成分核酸适配子具有结合给定人凝固蛋白的能力，所述能力比结合任意其他的人蛋白质的能力更强。在一些实施方案中，根据本发明的核酸适配子特别具有结合给定人凝固蛋白的能力，所述能力比结合任意其他由非人哺乳动物基因组编码的同源蛋白质的能力更强。例如， 特异性针对人因子VII的核酸适配子具有结合人因子VII的能力，所述能力比结合来源于非人哺乳动物的因子VII，包括兔因子VII的能力更强。用于本说明书的目的，当通过使用上述结合检测技术中的任一种和在相同检测条件下，用第一种核酸得到的结合信号值相比用第二种核酸得到的在统计上显著更高时，第一种核酸具有比等效质量的第二种核酸更强的结合人因子Vll/VIIa的能力。例如，当使用的结合检测技术是Biaeore 技术时，当第一种核酸的共振信号值比测量的第二种核酸的共振信号值在统计上显著更高时(与表示的共振测量单位无关)，第一种核酸具有比等效质量的第二种核酸更强的结合人因子Vll/VIIa的能力。2个“在统计上”有差异的测量值包括彼此具有大于使用的结合检测技术的测量误差的差异的2个值。优选地，本发明的亲和基质的核酸适配子对靶凝固蛋白具有强亲和力。优选地，所述核酸适配子对所述靶凝固蛋白具有小于500nM的Kd值。Kd值可根据Biaeore 技术测量。例如，已显示包含SEQ ID No 86序列的核酸适配子具有结合人因子Vll/VIIa的能力，所述能力比其结合任意来源于非人哺乳动物的因子Vll/VIIa的能力显著更强。特别地，尽管SEQ ID No 86序列的核酸具有结合任意类型的人因子Vll/VIIa，包括天然因子 Vll/VIIa或重组因子Vll/VIIa的强能力，其结合由非人哺乳动物基因组编码的因子VII/ Vila，包括兔因子Vll/VIIa的能力弱或无能力。更具体地，对包含SEQ id No 86序列的适配子，根据Biacore 技术已测定出结合人因子Vll/VIIa的能力的值为约100nM(以解离常数Kd表示)。此外，所述核酸适配子对人血浆因子Vll/VIIa和对重组人因子Vll/VIIa(例如在转基因兔中产生的)二者具有相同的结合能力。已显示SEQ ID No 86序列的核酸和人因子Vll/VIIa之间形成的复合物是化学计量的，即形成复合物的SEQ ID No 86序列的核酸的分子数与人因子Vll/VIIa的分子数的比例为约1 1，且可特别地为1 1。如已经在上面提到的，本发明的亲和基质可在纯化由非人转基因哺乳动物产生的重组人凝固蛋白的方法的步骤中使用。在纯化凝固蛋白的方法的这些实施方案中，复杂的初始介质包括与大量蛋白质混合的重组人蛋白质，所述大量蛋白质由所述转基因哺乳动物天然产生，其中视情况而定包括与重组人蛋白质同源的凝固蛋白。可以理解，在这些实施方案中，本发明的亲和基质的成分核酸适配子选择性结合目的人蛋白质、而在相同操作条件下不结合由非人哺乳动物天然产生的同源蛋白质是有利的。在本发明的亲和基质的成分核酸适配子的这些特定实施方案中，所述适配子“特异性”结合目的人凝固蛋白的能力也可被表示为分别针对人蛋白质和针对非人哺乳动物同源蛋白质的解离常数Kd的比例。根据本发明的亲和基质的成分核酸适配子的另一个特征，所述核酸适配子特异性结合人凝固蛋白的能力也可被表示为以下条件(A)人Kd/非人 Kd < 0.01(A)，其中-“人Kd”是核酸适配子针对所述人蛋白质的解离常数，以摩尔单位表示，和-“非人Kd”是所述核酸适配子针对所述非人同源蛋白质的解离常数，以相同的摩尔单位表示。优选地，为了在纯化重组人凝固蛋白的方法中最佳使用本发明的亲和基质，也可通过人Kd/非人Kd的比例小于0. 005定义特异性结合所述重组人蛋白质的核酸适配子。本发明的亲和基质的成分核酸适配子可根据名为SELEX的技术制备。使用的术语“适配子”包括能够特异性结合蛋白质的单链核酸，DNA或RNA分子。适配子通常包括 5-120个之间的核苷酸并可根据名为SELEX(通过指数富集的配体的系统进化)的方法在体外选择，其最初在PCT申请号WO 1991/019813中详细描述。选择适配子的SELEX方法由下述步骤组成使蛋白质与核酸、DNA或RNA的组合文库(一般为1015个分子)接触；去除不结合靶的核酸，分离和扩增结合靶的核酸。重复此方法直到溶液中富集了足够的对目的蛋白质具有良好亲和力的核酸(Tuerk和Gold，“Systematic evolution of ligands by exponential enrichment :RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase" (1990) Science,249 (4968) :505-10 禾口 Ellington 禾口 Szostak，“Invitro selection of RNA molecules that bind specific ligands”，(1990)Nature Aug 30 ；346 (6287) :818-22)。 其他 SELEX 方法的实例在文件 EP 0 786 469, EP 668 931, EP 1 695 978 和 EP 1 493 825 中给出，其中的教导可重现以实施选择根据本发明使用的核酸适配子的方法。为了在纯化人因子Vll/VIIa的手段中使用，特异性结合目的凝固蛋白的核酸优选地被包含在化学结构(在本说明书中又称“化合物”)中，其也包含间隔手段，且在适当时包含在固体基质上固定的手段。在一些实施方案中，核酸适配子被包含在以下通式(I)的化合物的结构中[FIX]x-[SPACJy-[APT] (I)，其中:-[FIX]表示用于固定在基质上的化合物，-[SPAC]表示间隔链，-[APT]表示特异性结合凝固蛋白的核酸，又称核酸适配子，-χ是等于0或1的整数，和_y是等于0或1的整数。
在通式(I)的化合物的一些实施方案中，[APT]由SEQ ID No 86序列的脱氧核糖核酸组成。在通式(I)的化合物中以[SPAC]表示的“间隔链”可为任意已知类型。所述间隔链具有以下功能，即物理性间隔核酸和在其上固定所述化合物的固体基质表面，及赋予核酸相对可固定于其上的固体基质的表面的相对移动性。间隔链限制或阻止由于固体基质和核酸彼此距离过近造成的立体障碍，距离过近阻碍所述核酸和可能与所述核酸分子接触的凝固蛋白分子之间的结合事件。在通式(I)的化合物中间隔链优选地结合在适配子核酸的5’端或3’端。有利地，间隔链同时结合适配子的一端和固体基质。具有间隔链的此构造具有不直接在固体基质上固定适配子的优势。优选地，间隔链是非特异性寡核苷酸或聚乙二醇 (PEG)。当间隔链由非特异性寡核苷酸组成时，所述寡核苷酸有利地包含至少5个核苷酸的长度，优选5-15个核苷酸之间的长度。在间隔链由聚乙二醇组成的通式(I)的化合物的实施方案中，所述间隔链包含 PEG(C18)类型的聚乙二醇，例如由Sigma Aldrich公司出售的PEG(C18)。为了在间隔链上固定适配子，可使用多种化学基团化学修饰核酸，例如能共价固定所述核酸的基团，例如硫醇、胺或能够与固体基质上存在的化学基团反应的任意其他基团。在通式(I)的化合物中，化合物[FIX]由选自下述的化合物组成(i)能够与固体基质材料形成一个或多个共价键的化合物和(ii)能够通过弱非共价键，包括氢键、静电力或范德华力特异性结合固体基质的化合物。化合物[FIX]的第一种类型包含双功能偶联剂，例如戊二醛，SIAB或SMCC。SIAB,由Hermanson G. T. (1996,Bioconjugate techniques,San Diego :Academic Press, pp 239-242)描述，是下面通式(I)的化合物
权利要求
1.选择性结合凝固蛋白的亲和基质，其包含在其上固定了特异性结合所述凝固蛋白的核酸适配子的固体基质材料。
2.根据权利要求1的亲和基质，其特征在于所述核酸适配子由脱氧核糖核酸适配子组成。
3.根据权利要求1或2的亲和基质，其特征在于所述核酸适配子被包括在以下通式 (I)的化合物的结构中[FIX]x-[SPACJy-[APT] (I)，其中:-[FIX]表示用于固定在基质上的化合物，-[SPAC]表示间隔链，-[APT]表示特异性结合凝固蛋白的核酸，-χ是等于0或1的整数，和-y是等于0或1的整数。
4.根据权利要求3的亲和基质，其特征在于，在通式⑴的化合物中，[APT]由SEQID No. 1序列的脱氧核糖核酸组成。
5.根据权利要求1至4中任一项的亲和基质，其特征在于所述凝固蛋白选自因子I(纤维蛋白原)、因子II (凝血酶原)、因子V(前加速素)、因子VII (前转变素)、因子VIII (抗血友病因子A)、因子IX (抗血友病因子B)、因子X (司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或 PTA)、因子XII (Hageman因子)、因子XIII (纤维蛋白稳定因子或FSF) ,PK(前激肽释放酶)、 HMWK(高分子量激肽原)、组织促凝血酶原激酶、肝素辅因子II (HCII)、蛋白质C(PC)、凝血调节蛋白(TM)、蛋白质S(PS)、血管性血友病因子(vWF)和组织因子途径抑制剂(TFPI)，或其他组织因子。
6.根据权利要求1至5中任一项的亲和基质，其特征在于所述固体基质材料选自树脂、 聚合物珠、磁珠、顺磁性珠、过滤膜的基质材料和聚合物材料。
7.在基质上固定凝固蛋白的方法，其包括以下步骤，其中使包含所述凝固蛋白的样品接触根据权利要求1至6中任一项的亲和基质。
8.纯化凝固蛋白的方法，其包括以下步骤a)使包含凝固蛋白的样品与根据权利要求1至6中任一项的亲和基质接触，以在(i) 在所述亲和基质上固定的核酸适配子和(ii)所述凝固蛋白之间形成复合物，和b)从在步骤a)中形成的复合物中释放蛋白质，和c)回收纯化形式的所述凝固蛋白。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述样品选自人血浆、或人血浆部分、或所述凝固蛋白的转基因哺乳动物的奶、或所述奶的部分。
10.根据权利要求8或9的方法，其特征在于所述血浆蛋白质是人的。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于所述样品包含至少一种非人血浆蛋白质。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于所述人血浆蛋白质与所述非人血浆蛋白质是同源的。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于所述人血浆蛋白质是所述非人血浆蛋白质的同系物。
14.根据权利要求8至13任一项的方法，其特征在于通过使所述亲和基质接触含有二价离子螯合剂、优选EDTA的洗脱缓冲液进行步骤b)。
15.重组人凝固蛋白的纯化组合物，其包含以重量计至少99.9%的所述重组人蛋白质，且其基本上不含非人蛋白质。
16.包含根据权利要求15的重组人凝固蛋白的纯化组合物的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及选择性结合凝固蛋白的亲和基质，其包含在其上固定了特异性结合所述凝固蛋白的核酸适配子的固体基质。
文档编号C07K1/22GK102405288SQ201080017046
公开日2012年4月4日 申请日期2010年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者G·佩雷, M·诺格雷 申请人:Lfb生物技术公司