纯化小模块免疫药物蛋白的方法

专利名称：：纯化小模块免疫药物蛋白的方法纯化小模块免疫药物蛋白的方法相关申请参考本申请要求2009年3月11日提交的美国临时专利申请第61/159，347号的权益，其内容整体援引并入本文。
背景技术：
：通常，当生产药用蛋白时，在其可以用于诊断应用、治疗应用、应用细胞生物学和功能研究之前，必须从蛋白制备物去除污染物。例如，从培养细胞收获的蛋白制备物常含有不需要的组分，如细胞产生的蛋白的高分子量(HMW)团聚体。在给药时高分子量团聚体可以通过引起补体激活或过敏反应而不利地影响产品安全性。此外，团聚体可以通过引起产物产量减少、峰加宽和活性丢失来阻碍制造过程。与抗体和其他治疗性蛋白相比，小模块免疫药物(SMIP)蛋白属于相对较新种类的药物蛋白。因此，由于对这类型蛋白缺乏认识，SMIP蛋白的纯化特别具有挑战性。此外，SMIP蛋白具有高聚集倾向。例如，细胞培养物中HMW团聚体的百分率可以高达50-60%。发明概述本发明提供了纯化含有HMW团聚体的蛋白的有效方法。本发明涵盖了以下发现，利用不超过3个层析步骤可以从含有高百分率HMW团聚体(例如，超过50-60%)的蛋白制备物纯化小模块免疫药物蛋白。因此，根据本发明的创造性的方法减少了柱步骤的数量，导致加工时间显著减少并且产物产量显著提高。本发明特别有益于纯化小模块免疫药物蛋白。本发明的方法还可以用于纯化其他蛋白，特别是那些具有聚集倾向的蛋白。在一方面，本发明提供了从含有高分子量团聚体的蛋白制备物纯化小模块免疫药物蛋白的方法，其包括在操作条件下使所述蛋白制备物进行羟基磷灰石层析的步骤，使得所述纯化的小模块免疫药物蛋白含有少于4%的团聚体(例如，少于3.5%,3%,2.5%,2%、1.5%、1%、0.8%、0.6%、0.5%、0.4%、0.2%或0.1%)。在一些实施方案中，根据本发明的方法包含不超过3个层析步骤。在一些实施方案中，所述操作条件包括在磷酸盐缓冲液中从羟基磷灰石层析柱洗脱所述小模块免疫药物蛋白。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液是无内毒素的。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液是无热原的。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液包含磷酸钠、磷酸钾和/或磷酸锂。在一些实施方案中，合适的磷酸盐缓冲液含有在lmM-50mM浓度范围的磷酸钠。在一些实施方案中，合适的磷酸盐缓冲液还含有在100mM-2.5M浓度范围的氯化钠。在一些实施方案中，合适的磷酸盐缓冲液含有在2mM-32mM浓度范围的磷酸钠和在IOOmM-L6M浓度范围的氯化钠。在一些实施方案中，合适的磷酸盐缓冲液具有6.5-8.5范围的PH。在一些实施方案中，所述操作条件包括通过NaCl梯度从羟基磷灰石层析柱洗脱小模块免疫药物蛋白。在一些实施方案中，所述操作条件包括通过NaCl分步洗脱方法从羟基磷灰石层析柱洗脱小模块免疫药物蛋白。在一些实施方案中，所述操作条件包括通过磷酸盐梯度(例如，线性磷酸盐梯度)从羟基磷灰石层析柱洗脱小模块免疫药物蛋白。在一些实施方案中，所述羟基磷灰石层析使用含有I型或II型陶瓷羟基磷灰石树脂的柱。在一些实施方案中，所述柱含有I型陶瓷羟基磷灰石树脂。在一些实施方案中，适合羟基磷灰石层析的树脂直径为ιμrn-l,000μm。在一些实施方案中，适合羟基磷灰石层析的树脂直径为10μm-100μm。在一些实施方案中，所述方法还包括在羟基磷灰石层析步骤之前通过亲和层析纯化蛋白制备物的步骤。在一些实施方案中，所述亲和层析步骤使用结合至免疫球蛋白恒定结构域的蛋白吸收剂。在一些实施方案中，所述亲和层析使用结合至免疫球蛋白可变结构域的蛋白吸收剂。在一些实施方案中，适合本发明的蛋白吸收剂结合至VH3结构域或与VH3同源的结构域(例如，来自VH3家族的结构域)。在一些实施方案中，适合本发明的蛋白吸收剂包含A蛋白。在一些实施方案中，所述亲和层析使用MabklectTMrfr0teinA树脂柱。在一些实施方案中，根据本发明的方法还包括加入添加剂(例如，PEG和/或其他非离子型有机聚合物)以促进结合至蛋白吸着剂的步骤。在一些实施方案中，所述亲和层析步骤包含利用洗涤缓冲液洗涤亲和层析柱，所述洗涤缓冲液包含Hepes、氯化钠、氯化钙、精氨酸、Tris、氯化镁、组氨酸、尿素、咪唑、一种或多种有机溶剂(例如，乙醇、甲醇、丙二醇、乙二醇、丙醇、异丙醇和丁醇)和/或去污剂(例如，离子型或非离子型)。在一些实施方案中，所述亲和层析步骤包含利用洗脱缓冲液从亲和层析柱洗脱小模块免疫药物蛋白，所述洗脱缓冲液包含Hepes、磷酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、氯化镁、尿素、丙二醇、乙二醇、一种或多种有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、丙二酸、苯二甲酸和水杨酸)和/或精氨酸。在一些实施方案中，所述洗脱缓冲液还包含选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁及其组合的盐。在一些实施方案中，所述盐浓度范围为ImM-lM。在某些实施方案中，所述盐浓度范围为lmM-500mM。在某些实施方案中，所述盐浓度范围为ImM-IOOmM在一些实施方案中，根据本发明的方法还包含利用阴离子交换层析树脂通过阴离子交换层析纯化蛋白制备物的步骤。在某些实施方案中，根据本发明的方法还包含在亲和层析之后但是在羟基磷灰石层析步骤之前通过阴离子交换层析纯化蛋白制备物的步骤。在一些实施方案中，根据本发明的方法还包含加入添加剂以增强小模块免疫药物蛋白和/或杂质结合至阴离子交换层析树脂的步骤。在一些实施方案中，加入的添加剂诱导一种或多种污染物或杂质从蛋白制备物沉淀。在一些实施方案中，通过过滤从蛋白制备物去除沉淀的污染物。在一些实施方案中，合适的添加剂为或含有非离子型有机聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、纤维素、葡聚糖、淀粉和/或聚乙烯吡咯烷酮)。在一些实施方案中，所述方法还包含在亲和或阴离子交换层析之前将蛋白制备物应用于深层滤器(cbpthfilter)的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包含一个或多个过滤步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个过滤步骤包含病毒保留过滤步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个过滤步骤包含超滤和/或渗滤步骤。在一些实施方案中，所述蛋白制备物是从培养的细菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、无细胞培养基、转基因动物或植物制备的。在一些实施方案中，所述蛋白制备物为细胞培养基制备物。在一些实施方案中，所述培养基制备物含有从培养细胞分泌的小模块免疫药物蛋白。在某些实施方案中，所述培养细胞为CHO细胞。在某些实施方案中，所述培养基制备物是从大型生物反应器制备的。在一些实施方案中，待纯化的蛋白制备物含有细胞提取物。在一些实施方案中，待纯化的蛋白制备物是从包涵体制备的。在另一方面，本发明提供了从含有高分子量团聚体的蛋白制备物纯化小模块免疫药物蛋白的方法，所述方法通过使所述蛋白制备物在操作条件下进行(a)亲和层析和/或离子交换层析(例如，一个或两个离子交换层析步骤)，和(b)羟基磷灰石层析，使得纯化的小模块免疫药物蛋白含有少于4%(例如，少于3.5%,3%,2.5%,2%U.5%U%>0.8%,0.6%,0.5%,0.4%,0.2%,0.1%)的团聚体。在一些实施方案中，使所述蛋白制备物进行(al)亲和层析、(^)离子交换层析和(b)羟基磷灰石层析。在一些实施方案中，使所述蛋白制备物进行(al)阳离子交换层析、(^)阴离子交换层析和(b)羟基磷灰石层析。在一些实施方案中，所述亲和层析为A蛋白层析。在一些实施方案中，所述离子交换层析为阴离子或阳离子交换层析。在一些实施方案中，所述离子交换层析树脂选自QSepharoseFF、QS印haroseXL,DEAES印haroseFF,POROSHQ50,ToyopearlιDEAEJoyopearlGigaCapQ-650M,ToyopearlDEAE-650M,CaptoQ、CaptoDEAE和触角型阴离子交换层析(tentacleanionexchangechromatography)(例如，FractogelTMAEHiCap(M)>FractogelTMAE(TM或Fractopr印TMAETM)。在一些实施方案中，所述阴离子交换层析树脂为带电膜吸收体(例如，MustangQ、MustangE、&irtobind和/或Chromasorb)。在一些实施方案中，所述离子交换层析树脂为带电单片支持体(例如，CIM-DISK)。在特别的实施方案中，所述亲和层析为MabklectrProteinA亲和层析，所述离子交换层析为触角型阴离子交换层析，并且所述羟基磷灰石层析为I型陶瓷羟基磷灰石层析。在一些实施方案中，根据本发明的方法包含不超过3个层析步骤。在一些实施方案中，根据本发明的方法还包括剥除(strip)和/或再生一个或多个层析柱用于重新使用的步骤。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化含有超过5%(例如，超过lO^JO^i、30%、40(%、50(%、60(%、70(%或更多)的高分子量团聚体的蛋白制备物。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化含有少于70%(例如，少于60%、50%、40%、30%、20%、15%、10%或5%)的高分子量团聚体的蛋白制备物。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化含有4-70%(例如，4-60%、4-50%、4-40%、4-30%、4-20%、4-15%、4-10%)的高分子量团聚体的蛋白制备物。在一些实施方案中，本发明用于纯化特异性结合至CD20的小模块免疫药物蛋白。在一些实施方案中，本发明用于纯化包含与SEQIDNO:1-59和67-76中任一个具有至少80%相同性的氨基酸序列的小模块免疫药物蛋白。在另一方面，本发明用于从含有超过20%(例如，超过25%、30%、35%、40%、45^^50^^55%,60^^70%或更多)的高分子量团聚体的蛋白制备物纯化蛋白，其包括使蛋白制备物在操作条件下进行羟基磷灰石层析的步骤，使得纯化的蛋白含有少于4%(例如，少于3.5%,3%,2.5%,2%U.5%U%>0.8%,0.6%,0.5%,0.4%,0.2%或0.)的团聚体。在某些实施方案中，所述蛋白制备物含有超过60%的高分子量团聚体。在某些实施方案中，所述操作条件包含在磷酸盐缓冲液中从羟基磷灰石层析柱洗脱蛋白。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液是无内毒素的。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液是无热原的。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液包含磷酸钠、磷酸钾和/或磷酸锂。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液包含在lmM-50mM浓度范围的磷酸钠。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液还包含在100mM-2.5M浓度范围的氯化钠。在特别的实施方案中，所述磷酸盐缓冲液包含在2mM-32mM浓度范围的磷酸钠和在IOOmM-L6M浓度范围的氯化钠。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液具有6.5-8.5范围的pH。在一些实施方案中，待纯化的蛋白含有小模块免疫药物多肽。本发明还提供了利用本文所述方法纯化的小模块免疫药物蛋白。此外，本发明提供了包含小模块免疫药物蛋白和药学可接受媒介物的药物组合物，其中所述小模块免疫药物蛋白包含少于4%(例如，少于3.5%,3%,2.5%,2%U.5%U%>0.8%,0.6%,0.5%,0.4%、0.2%或0·1%)的团聚体。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用表示“和/或”。如本申请所用，术语“包含(comprise)，，和该术语的变体，例如“包含(comprising)，，和“包含(comprises)，，并不排除其他添加剂、组分、整体或步骤。如本申请所用，术语“约”和“大约”等义使用。本申请所用的任何数字，有或没有约/大约，意味着覆盖相关领域普通技术人员所理解的任何正常波动。本发明的其他特点、目的和优点在下文的详细描述、附图和权利要求中是显而易见的。然而，应该理解详细描述、图片和权利要求在说明本发明的实施方案时，仅以说明的方式给出，而不是限制。在本发明范围之内的各种变化和修饰对本领域技术人员将显而易见。附图仅用于说明目的，而不是为了限制。图1示出了抗CD20小模块免疫药物蛋白的示例性结构。图2说明了溶液中可能的SMIP分子的示例性构型。图3A-3C说明各种结构域-交换机理可以导致形成SMIP分子的高分子量团聚体，如三聚体、四聚体或多聚体。图4示出了说明示例性细胞培养和收获过程的示意图。图5示出了在12-14天培养期期间2个不同CHO细胞克隆所产生的TRU-015的生产生物反应器的示例性每天滴度测量(μg/mL)。在生产生物反应器生长的第12天和第14天之间获得了滴度峰值。滴度峰值范围为1500-3000μg/mL。图6示出了利用批量结合机理的高通量筛选的示例性设计。图7示出了A蛋白柱操作和高通量筛选模型的示例性设计。图8示出了示例性A蛋白高通量筛选结果。图9.(A)在陶瓷羟基磷灰石层析的高通量筛选中测试的示例性变量的总结。(B)示例性等高线图显示在cHA纯化期间当使用不同浓度磷酸盐和NaCl时的百分比HMW化合物。(C)示例性HMWvs.LogKp图证实在约10的Kp(或logKp为1)下，大部分HMW化合物已从样品去除。图10示出了为了cHA层析步骤的发展的利用cHA柱和NaCl梯度洗脱的示例性可选蹄选。图11示出了示例性典型cHA层析谱。图12示出了示例性TRU-015纯化过程。图13示出了通过MabklectProteinA亲和层析与通过CEX的HMW团聚体减少量的示例性比较。图14示出了显示CEX树脂的蛋白产物结合容量的示例性结果。图15示出了显示利用25vs.75mg/mLr装载挑战(loadingchallenge)的CEX峰的示例性结果。图16示出了证明利用AEX柱有效去除HMW的示例性结果。收集池为88%纯，具有>95%产率的“单体”SMIP蛋白。发明详述本发明提供了基于羟基磷灰石层析的从含有HMW团聚体和其他杂质的蛋白制备物纯化或回收蛋白，特别是小模块免疫药物蛋白的方法。在一些实施方案中，所述羟基磷灰石层析与亲和层析和/或离子交换层析组合使用。在一些实施方案中，本发明的创造性的方法还包括一个或多个过滤步骤以进一步去除病毒污染物、浓缩蛋白和/或缓冲液交换。在一些实施方案中，本发明的方法具有不超过3个层析步骤(例如，2个层析步骤或3个层析步骤)。在一些实施方案中，本发明的方法具有不超过3个过滤步骤(例如，2个过滤步骤、3个过滤步骤)。如实施例部分所述，本发明人已发现了合适的羟基磷灰石层析、亲和层析和/或离子交换层析操作条件，其允许从蛋白制备物有效去除HMW团聚体和其他杂质(例如，DNA、宿主细胞蛋白、病毒和其他污染物)。在一些实施方案中，HMW团聚体的百分率可以从起始制备物中超过20%(例如，25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%或更多)减少至纯化的蛋白产物中少于4%(例如，少于3.5%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.8%,0.6%,0.4%,0.2%,0.1%)0在一些实施方案中，起始制备物中的HMW团聚体可以减少至少约5倍，或至少约10倍，或至少约20倍，或至少约30倍，或至少约40倍，或至少约50倍，或至少约60倍，或至少约70倍，或至少约80倍，或至少约90倍，或至少约100倍。此外或可选地，纯化的蛋白中其他污染(例如，HCP)的百分率不超过约10，000ppm，或不超过约5000ppm，或不超过约2500ppm，或不超过约400ppm，或不超过约360ppm，或不超过约320ppm,或不超过约^Oppm，或不超过约MOppm，或不超过约200ppm，或不超过约160ppm，或不超过约140ppm，或不超过约120ppm，或不超过约lOOppm，或不超过约80ppm，或不超过约60ppm，或不超过约40ppm，或不超过约30ppm，或不超过约20ppm，或不超过约lOppm。在一些实施方案中，根据本发明的创造性的方法提供了所关注蛋白的至少50%的回收率(例如，至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%)。在一些实施方案中，本发明的方法提供了至少20%的产物产率(例如，至少22%、24%、沈％、观％、30%、32%、34%、36%、38%、40%、42%、44%、46%、48%或50%)。在以下部分中详细描述了本发明的各方面。部分的用途不是为了限制本发明。每个部分可以应用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用表示“和/或”。定义为了使本发明更容易理解，首先定义某些术语。以下术语和其他术语的额外的定义在整个说明书中指出。吸收剂吸收剂是附着至固相支持体的至少一种分子，或者本身是固体的至少一种分子，其用于进行层析。11亲和层析亲和层析是利用生物分子之间特异性、可逆的相互作用，例如，A蛋白结合至IgG抗体的Fc部分的能力，而不是诸如等电点、疏水性或大小的分子一般特性来实现层析分离的层析。在实践中，亲和层析包含利用诸如附着至固相支持体的A蛋白的吸收剂来层析分离或多或少紧密结合至吸收剂的分子。参见Ostrove(1990)GuidetoProteinPurification,MethodsinEnzymology182:357-379,^^{φ^Λ^ο大约如本文所用，当应用于一个或多个所关注的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，除非从上下文另有说明或显而易见，术语“大约”或“约，，指落在所述参考值的任一方向(大于或小于)25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%之内的值的范围(除了这样的数会超过可能值的100%的地方)。结合-洗脱模式术语“结合-洗脱模式”(也被称为“结合模式”)指产物制备物分离技术，其中制备物中含有的至少一种产物结合至层析树脂或介质。在这种模式中的结合产物在洗脱阶段期间被洗脱。层析层析是通过混合物通过吸收剂的渗滤来互相分离混合物中化学性质不同的分子，所述吸收剂或多或少强烈吸附或保留不同分子。在更强烈吸附或保留的分子不被释放的条件下，被吸收剂最少强度吸附或保留的分子从吸收剂释放。免疫球蛋白恒定结构域抗体免疫球蛋白恒定结构域是与人或动物来源的Q、CH1、Ch2Xh3或Ch4结构域相同或基本上相似的免疫球蛋白结构域。参见例如CharlesAHasemannandJ.DonaldCapra,ImmunoglobulinsStructureandFunction,inWilliamE.Paul,ed.,FundamentalImmunology,SecondEdition,209，210-218(1989)，其整体援引并入本文。CH2或Ch3结构域，或者与Ch2或Ch3结构域基本上相似的免疫球蛋白结构域也被称为抗体的F。部分。污染物或杂质污染物或杂质指任何外源或不期望的分子，包括也存在于被纯化的所关注蛋白的样品中的生物大分子，如DNA、RNA或除被纯化的所关注蛋白之外的蛋白。杂质包括，例如，蛋白变体，如聚集的蛋白、高分子量种类、低分子量种类和片段以及脱酰胺种类；来自分泌被纯化的蛋白的宿主细胞的其他蛋白(宿主细胞蛋白)；可能在之前的纯化步骤期间渗入样品的用于亲和层析的吸收剂的部分蛋白，如A蛋白；内毒素；和病毒。流穿模式术语“流穿模式”一般指产物制备物分离技术，其中制备物中含有的至少一种产物将流穿层析树脂或介质，而至少一种潜在的污染物或杂质结合至层析树脂或介质。在一些实施方案中，流穿模式为弱分配层析(WPC)，其中产物可以弱结合至树脂，而至少一种潜在的污染物或杂质更优先地结合至层析树脂或介质。通常，WPC在比传统流穿模式更高的分配系数下，但是在比结合-和-洗脱模式更低的分配系数下操作。在弱分配中，可以用装载阶段之后实施的较大装载挑战和短洗涤来实现高回收率。宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白是编码待纯化蛋白的DNA被引入的宿主细胞天然存在的基因组所编码的蛋白。宿主细胞蛋白可以是待纯化蛋白的污染物，其水平可以通过纯化来降低。宿主细胞蛋白可以通过任何适当的方法来测定，包括凝胶电泳和染色和/或ELISA测定等。羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析是用陶瓷羟基磷灰石作为吸收剂的层析。参见例如MarinaJ.Gorbunoff(1990),ProteinChromatographyonHydroxyapatiteColumns,GuidetoProteinPurification,MurrayP.Deutscher,ed.,MethodsinEnzymology182:329-339,其整体并入本文。装载术语“装载”指含有来源于澄清的细胞培养物或发酵条件培养基的产物，或者来源于层析步骤的部分纯化的中间物的任何装载物质。术语“装载流体”指含有装载物质的液体，用于在本发明的操作条件下通过介质。装载挑战(LC)术语“装载挑战”指在层析步骤的装载循环中装上柱或在批量结合中应用于树脂的产物的总质量，测量单位为产物质量每单位体积树脂。A蛋白A蛋白是最初在葡萄球菌(Mapphylococcus)的细胞壁中发现的蛋白，其结合至抗体的F。部分或可变结构域。在一些实施方案中，A蛋白结合至来自VH3家族的结构域(例如，IgG抗体的VH3结构域)。为了本发明的目的，“A蛋白”为任何与葡萄球菌(MapphylococcaDA蛋白相同或基本上相似的蛋白，包括商购和/或重组形式的A蛋白。为了本发明的目的，为了确定基本相似性的目的的A蛋白生物活性为结合至IgG抗体的Fc部分或可变结构域(例如，VH3)的能力。G蛋白G蛋白是最初在链球菌(Sti^pt0c0ccus)的细胞壁中发现的蛋白，其结合至抗体(例如，IgG)的F。部分或可变结构域。在一些实施方案中，G蛋白结合至来自乂氏家族的结构域(例如IgG抗体的VH3结构域)。为了本发明的目的，“G蛋白”为任何与链球菌(Str印tococcal)G蛋白相同或基本上相似的蛋白，包括商购和/或重组形式的G蛋白。为了本发明的目的，为了确定基本相似性的目的的G蛋白生物活性为结合至IgG抗体的F。部分或可变结构域(例如，VH3)的能力。LG蛋白LG蛋白是结合至IgG抗体的重组融合蛋白，其包含G蛋白(参见上文的定义)和L蛋白部分。L蛋白最初是从消化链球菌(P^tosti^ptococcus)的细胞壁分离的。LG蛋白包含来自L蛋白和G蛋白的IgG结合结构域。Volaetal.(1994)Cell.Biophys.24-2527-36，其整体并入本文。为了本文的目的，“LG蛋白”为任何与LG蛋白相同或基本上相似的蛋白，包括商购和/或重组形式的LG蛋白。为了本文的目的，为了确定基本相似性的目的的LG蛋白生物活性为结合至IgG抗体的能力。纯化纯化蛋白表示减少外源或不期望的元素的量，特别是可能存在于蛋白样品中的生物大分子，如蛋白或DNA。外源蛋白的存在可以通过任何适当的方法测定，包括凝胶电泳和染色和/或ELISA测定。DNA的存在可以通过任何适当的方法测定，包括凝胶电泳和染色和/或利用聚合酶链反应的测定。抗体免疫球蛋白可变结构域抗体免疫球蛋白可变结构域是与人或动物来源的\或Vh结构域相同或基本上相似的免疫球蛋白结构域。为了本发明的目的，为了确定基本相似性的目的的抗体免疫球蛋白可变结构域生物活性为抗原结合。在一些实施方案中，抗体免疫球蛋白可变结构域为VH3结构域。如本文所用的VH3结构域指VH3本身或任何与VH3结构域具有同源性的结构域。小模块免疫药物蛋白如本文所用，小模块免疫药物(SMIP)蛋白指含有一个或多个以下融合结构域的蛋白结合结构域；免疫球蛋白铰链区或由其衍生的结构域；和效应结构域，其可以为免疫球蛋白重链Ch2恒定区或由其衍生的结构域；和免疫球蛋白重链Ch3恒定区或由其衍生的结构域。SMIP蛋白治疗剂优选为单特异性的(即其识别并附着至单个抗原靶标以启动生物页活性)。本发明还涉及多特异性和/或多价分子，如SCORPION治疗剂，其并入了SMIP蛋白并且还具有额外的结合结构域，所述结合结构域位于该分子的SMIP蛋白部分的C端。优选地，SCORPION治疗剂的结合结构域每个结合至不同靶标。适合本发明的小模块免疫药物的结构域为或来源于人基因序列产物的多肽，任何其他天然或人工来源，包括基因工程和/或突变的多肽。小模块免疫药物也被称为结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白。在一些实施方案中，适合小模块免疫药物的铰链区来源于免疫球蛋白，如IgGl、IgA、IgE等。例如，铰链区可以为具有零个、一个或两个半胱氨酸残基的突变IgGl铰链区多肽。适合小模块免疫药物蛋白的结合结构域可以为任何具有特异性识别并结合至同源(cognate)生物分子的能力的蛋白，所述同源生物分子如抗原、受体(例如，CD20)或者超过一个分子或组件或团聚体的复合体。结合结构域可以包括至少一个免疫球蛋白可变区多肽，如重链或轻链V-区的全部或部分或片段，只要其能够特异性结合抗原或其他所关注的期望靶结构。在其他实施方案中，结合结构域可以包括单链免疫球蛋白来源的Fv产物，其可以包括至少一个免疫球蛋白轻链V-区的全部或部分和至少一个免疫球蛋白重链V-区的全部或部分，并且其还包含融合至V-区的接头。本发明可以应用于各种小模块免疫药物。示例性小模块免疫药物可以靶向受体或其他蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；HER受体家族成员，如EGF受体，HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，如LFA-1，Mol，pl50、95，VLA-4，ICAM-1，VCAM；生长因子，如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；C蛋白；EGFR、RAGE、P40、DkkUNOTCHUIL-13、IL-21、IL-4和IL-22等。在一些实施方案中，利用本发明纯化特异性识别CD20的小模块免疫药物。特异性结合⑶20的示例性小模块免疫药物蛋白如图1所示。如图1所示，抗⑶20SMIP蛋白通常为重组同型二聚体融合蛋白，由3个不同的结构域组成(1)嵌合(鼠/人)CD20结合结构域，包括通过氨基酸接头(例如，15-氨基酸接头)连接的可变重链(VH)和轻链(VL)片段；(2)修饰的人免疫球蛋白(例如，IgGl)铰链结构域和，(3)IgG效应结构域，如人IgGl的CH2和CH3结构域。通常，SMIP蛋白可以两种明显相关的同型二聚体形式存在，预测的链间二硫键连接的共价同型二聚体(CD)的主要形式，和不具有链间二硫键的同型二聚体形式(可分离的二聚体，DD)。可分离的二聚体一般是完全活性的。通常，二聚体具有约106，000道尔顿的理论分子量。SMIP蛋白还可以形成多价复合体。通常，SMIP蛋白作为糖蛋白存在。例如，如图1所示，可以用寡糖在每个蛋白链的CH2结构域中的N联糖基化共有序列(例如，327NST)处修饰抗CD20SMIP蛋白(参见图1)。SMIP蛋白还可以含有核心-岩藻糖基化脱唾液酸-去半乳糖-二分支的N联寡糖(GOF)；在每条链上的C00H-末端Gly476和NH2-末端焦谷氨酸盐(G0F/G0F)。两种较少的糖形GlF/GOF和G1F/G1F以及其他预期的痕量级N联糖形也可以存在。此外，在SMIP蛋白的铰链区中还观察到低水平的核心10-聚糖修饰。在一些实施方案中，SMIP蛋白的等电点(pi或IEP)范围为约7.0-9.0(例如，7.2、7·4、7·6、7·8、8·0、8·2、8·4、8·6、8·8)。如本文所讨论的，本发明可以用于纯化各种形式的SMIP蛋白(例如，单体多肽、同型二聚体、可分离的二聚体或多价复合体)。本发明可以用于纯化各种修饰的SMIP蛋白，如人源化SMIP或嵌合SMIP蛋白。如本文所用，术语“人源化SMIP蛋白，，指包括至少一个人源化免疫球蛋白区(例如，人源化免疫球蛋白可变区或恒定区)的SMIP蛋白。在一些实施方案中，人源化SMIP蛋白包含人源化可变区，其包括基本上来源于人免疫球蛋白的可变框架区(例如，全人FR1、FR2、FR3和/或FR4)，同时保持了一个或多个靶特异性互补决定区(⑶R)(例如，至少一个⑶R、两个⑶R或三个⑶R)。在一些实施方案中，人源化SMIP蛋白包含一个或多个人或人源化恒定区(例如，人免疫球蛋白Ch2和/或Ch3结构域)。术语“基本上来自人免疫球蛋白或抗体”或“基本上人”表示，当为了比较目的与人免疫球蛋白或抗体氨基序列比对时，该区域与人框架或恒定区序列享有至少80-90%，优选90-95%,更优选95-99%的相同性(即局部序列相同性)，其允许例如，保守置换、共有序列置换、种系置换、回复突变等。如本文所用，术语“嵌合SMIP蛋白”指可变区来源于第一物种并且恒定区来源于第二物种的SMIP蛋白。例如，嵌合SMIP蛋白可以通过基因工程从属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建。人源化和嵌合SMIP蛋白在国际申请公开WO2008/156713中进一步描述，其援引并入本文。本发明还可以用于纯化具有改变效应器功能的修饰的糖基化模式和/或铰链、Ch2和/或Ch3结构域突变的SMIP蛋白。在一些实施方案中，SMIP蛋白可以在铰链连接区中相邻或接近的位点上含有影响受体结合亲和力的突变。此外，本发明可以用于纯化包括小模块免疫药物多肽或其部分的融合蛋白。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化包括SEQIDNO:1-76(参见示例性SMIP序列部分)中任一个的氨基酸序列或其变体的SMIP蛋白。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化含有可变结构域的SMIP蛋白，所述可变结构域具有SEQIDNO:1-59中任一个的氨基酸序列或其变体。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化SMIP蛋白，其含有具有SEQIDNO:1-59中任一个的氨基酸序列或其变体的可变结构域，具有SEQIDNO:60-64中任一个的氨基酸序列或其变体的铰链区，和/或具有SEQIDNO:65或66的氨基酸序列或其变体的免疫球蛋白恒定区。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化具有SEQIDNO67-76中任一个的氨基酸序列或其变体的SMIP蛋白。如本文所用，亲本序列的变体包括但不限于与亲本序列至少70^^75^^80%,85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同的氨基酸序列。两个氨基酸序列的相同性百分比可以通过目视检查和数学计算来确定，或者更优选地，通过利用计算机程序比较序列信息来进行比较，如GeneticsComputerGroup(GCG；Madison,Wis.)Wisconsinpackageversion10.Oprogram,"GAP"(Devereuxetal.,1984,Nucl.AcidsRes.12:387)^!比较的计算机程序。“GAP”程序的优选缺省参数包括(I)Gribskov和Burgess的加权氨基酸比较矩阵((1986)，Nucl.AcidsRes.14:6745)，如SchwartzandDayhoff，eds.，AtlasofPolypeptideSequenceandStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,pp.353-358(1979)所述，或其它可比较的比较矩阵；(对于氨基酸序列，每个缺口30的罚分并且每个缺口中每个符号1的额外罚分；C3)末端缺口不罚分；和(4)长缺口无最大罚分。可以使用本领域技术人员所用的其他序列比较程序。额外的小模块免疫药物在以下专利中进一步描述，例如美国专利公开20030133939、20030118592、20040058445、20050136049、20050175614、20050180970、20050186216,20050202012,20050202023,20050202028,20050202534,20050238646和20080213273；国际专利公开WO02/056910,WO2005/037989和WO2005/017148，全部援引并入本文。蛋白聚集不希望受任何理论束缚，应该考虑结构域交换可以为蛋白聚集机理。当蛋白的明显结构分段(结构域)与另一个单体的明显结构分段物理上交换以产生二聚体或更高的寡聚体时，发生结构域交换。在结构域交换的蛋白中，每个结构域保持了与其在未交换的单体中的结构可比的天然样整体结构。当含有多个结构域的折叠蛋白被低PH、高温或剪切力胁迫时，可以诱导部分折叠或“打开”的构象(通过分离但折叠的结构域来表征)。一些“打开”的分子通过简单的折叠结构域的重新联合来重折叠为其天然结构。在某些情况下(通常被较高蛋白浓度所偏好)，结构域重新联合发生在两个邻近的分子之间，导致结构域交换的二聚体。这样的分子间交换可以传播，导致更大的团聚体。通常，结构域交换的蛋白为非共价(但是稳定)关联的分子，具有天然样结构域折叠和结构域间接触。在这样的情况下，通过通常分子内存在的非常相同的结构域-结构域界面将多聚体蛋白保持在一起。在纯化过程之前，SMIP蛋白含有大量(例如，20-60%)HMW蛋白(团聚体)。过量的HMW含量可能是由于SMIP的分子结构。如图1所示，典型的SMIP二聚体分子含有2个相同的单链Fv区，包括通过柔性接头(例如，GGGSGGGGSGGS(SEQIDNO:77))连接的Vh和\结构域，其与人IgGlFc结构域融合(图1)。不希望受任何理论束缚，因为每个亚基中的柔性接头，SMIP分子可能更易于解折叠(打开Fv构象)然后结构域交换，导致蛋白聚集。根据利用冷冻电子显微镜的研究，SMIP分子在溶液中可以例如紧凑、混合、拉伸或双抗体样构型存在(图幻。不希望受任何理论束缚，应该考虑一些具有拉伸或打开的链的SMIP分子可以尝试通过简单的折叠结构域的重新联合来重折叠为其天然结构。如图3A所示，结构域重新联合可以发生在两个邻近的SMIP分子之间，导致结构域交换的二聚体。这样的分子间交换可以传播，导致更大的团聚体，如三聚体、四聚体或多聚体(参见，图3B和图3C)。蛋白制备物与本文所述方法使用的蛋白制备物可以从任何体内或体外蛋白表达系统获得。适合本发明的蛋白制备物的示例性来源包括但不限于，来源于培养表达所关注蛋白的重组细胞系的条件培养基，或者来自例如产生产物的细胞、细菌、真菌细胞、昆虫细胞、转基因植物或植物细胞、转基因动物或动物细胞的细胞提取物，或者动物血清、腹水、杂交瘤或骨髓瘤上清液。合适的细菌细胞包括但不限于大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。合适的大肠杆菌(E.coli)菌株的实例包括HB101、DH5a、GiC9^、JM109、KW251、NM538、NM539和任何不能切割外源DNA的大肠杆菌菌株。可以使用的合适的真菌宿主细胞包括但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)禾口曲霉属(Aspergillus)细胞。合适的昆虫细胞包括但不限于S2Schneider细胞、D.Mel-2细胞、SF9、SF21、High-5、Mimic-SF9、MGl和KCl细胞。合适的示例性重组细胞系包括但不限于BALB/c小鼠骨髓瘤系、人成视网膜细胞(PER.C6)、猴肾细胞、人胚肾系093)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠支持细胞、非洲绿猴肾细胞(VER0-76)、人宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞、布法罗大鼠肝细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺肿瘤细胞、TRI细胞、MRC5细胞、FS4细胞和人肝癌系OfepG2)。可以利用本领域已知的各种载体(例如，病毒载体)表达所关注的蛋白，并且可以在本领域已知的各种条件下培养细胞(例如，补料分批)。基因改造细胞以产生蛋白的各种方法为本领域众所周知。参见例如Ausabeletal.，eds.(1990)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(Wiley,NewYork)。可以在本领域已知的各种细胞培养基中培养表达SMIP蛋白的细胞。示例性细胞培养基可以基于DMEM、DMEM/F12、Ham’sF-10、Ham’sF-12、F-12K、培养基199、MEM、RPMI1640、Ames，、BGJb,Click，s、CMRL-1066,Fischers、GMEM、IMDM、L-15、McCoy，s5AModified、NCTC、Swik，sS_77、Waymouth、William，s培养基E。合适的细胞培养基可以是无血清的。在一些实施方案中，合适的细胞培养基可以包括血清/培养基添加剂，其包括但不限于胎牛血清、新生牛血清、小牛血清和成牛血清，鸡、山羊、马、猪、兔、绵羊、人血清，血清替代品或牛胚胎液。合适的细胞培养基还可以包括补充物和/或抗生素，其包括但不限于L-谷氨酰胺溶液、L-Albany-L-谷氨酰胺溶液、非必需氨基酸溶液、青霉素、链霉素。可以利用本发明纯化粗蛋白制备物。例如，本发明可以用于直接从含有分泌自培养细胞的蛋白的条件培养基纯化蛋白。条件培养基可以从小规模培养物(例如，摇床、波浪袋(wavebag))，或者从种子生物反应器或生产生物反应器(例如，250L、600L、2500L或6000L生物反应器)获得。在一些实施方案中，可以利用本发明从制备自含有蛋白的细胞的粗细胞裂解物纯化细胞内表达的蛋白。在一些实施方案中，本发明可以用于从含有所关注蛋白的血清、乳或其它流体纯化蛋白。在一些实施方案中，本发明可以用于从部分纯化的制备物纯化蛋白，如来自层析柱的洗脱液或流穿液，或者来自储存或配制过程的中间蛋白制备物。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化在包涵体(例如，细菌、病毒、植物细胞或任何其它类型的包涵体)中表达的蛋白。在包涵体中表达的蛋白通常形成团聚体，其对纯化构成挑战。因此本发明可以特别有利于纯化在包涵体中表达的蛋白。从包涵体纯化蛋白通常需要首先从细菌或其它类型的细胞提取包涵体，然后溶解纯化的包涵体。包涵体提取和溶解的各种方法为本领域众所周知并且可以在本发明中使用。例如，强变性剂(例如，尿素和盐酸胍)、改变的PH和/或温度、物理破坏(例如，超声处理等)等可以用于提取和/或溶解包涵体。包涵体提取和/或溶解过程可以导致错误折叠的蛋白。在一些实施方案中，根据本发明包涵体提取物可以直接装至层析柱。在一些实施方案中，在本文所述的层析步骤之前首先使提取自包涵体的蛋白经过重折叠过程。在一些实施方案中，重折叠过程可以包括将蛋白透析或稀释入折叠缓冲液。各种折叠缓冲液为本领域众所周知并且可以在本发明中使用。在一些实施方案中，本发明可以用于从含有各种杂质的制备物纯化蛋白，所述杂质包括但不限于，不期望的蛋白变体，如聚集的蛋白，例如高分子量种类、低分子量种类和片段以及脱酰胺种类；来自分泌被纯化的蛋白的宿主细胞的其他蛋白；宿主细胞DNA;来自细胞培养基的组分，在之前的纯化步骤期间渗入样品的用于亲和层析的吸收剂的部分分子，例如，A蛋白和G蛋白；内毒素；核酸；病毒，或任何上述物质的片段。本发明特别有利于去除HMW团聚体。在一些实施方案中，起始蛋白制备物可以含有至少4%,5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%、75%、80%、85%、90%、95%的HMW团聚体。在一些实施方案中，起始蛋白制备物可以含有少于95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%的HMW团聚体。在一些实施方案中，起始制备物可以含有以上百分率组合范围(例如，约4-95%、5-70%、10-60%、4-30%、4-25%、4-20%、4-15%、4-10%和以上确定的百分率的任何组合)之内的HMW团聚体。如本文所用，术语“高分子量(HMW)团聚体”指至少两个蛋白单体的联合。为了本发明的目的，单体指所关注蛋白的任何生物活性形式的单个单元。例如，小模块免疫药物蛋白的单体可以为单体多肽，或同型二聚体，或可分离的二聚体，或SMIP蛋白多价复合体的单元。所述联合可以是共价、非共价、二硫键、非还原交联的，或通过其他机理。在一些实施方案中，合适的蛋白制备物可以通过收获处理获得。如实施例中所讨论的，可以通过离心从生产生物反应器收获条件培养基(例如，通过碟式沉积离心(discstackcentrifugation)(DSC))0离心步骤可以从含有分泌蛋白(例如，SMIPs)的条件培养基分离细胞和细胞碎片。在一些实施方案中，在DSC之后，可以将内容物应用于垫式过滤装置(padfiltrationapparatus)，然后过滤入滤液容器或袋。在一些实施方案中，在DSC和亲和层析步骤之间的过程中保存期间，可以将H印es/EDTA缓冲溶液加入过滤浓缩池以减少酸性种类的产生。此外，可以加入诸如EDTA或咪唑的蛋白酶抑制剂以抑制金属蛋白酶活性、某些丝氨酸蛋白酶或其他蛋白酶活性。在一些实施方案中，可以按照约0.001μM至约IOOmM的量将合适的蛋白酶抑制剂加入蛋白制备物。可以在A蛋白亲和层析之前和/或期间将蛋白酶抑制剂加入蛋白制备物。加入蛋白酶抑制剂(例如，EDTA)还可以减少A蛋白浸出。还可以调整诸如温度和PH的其他条件以减少A蛋白浸出。用于减少A蛋白浸出的方法和条件在美国公开第20050038231号中详细描述，其援引并入本文。纯化方法根据本发明的纯化过程包含一个或多个层析步骤(例如，亲和层析、羟基磷灰石层析或离子交换层析)。在一些实施方案中，本发明的纯化方法包含羟基磷灰石层析步骤。在一些实施方案中，本发明的纯化方法包含与亲和层析和/或离子交换层析组合的羟基磷灰石层析步骤。在一些实施方案中，本发明的方法还包括膜过滤步骤(例如，超滤、渗滤和/或最终过滤)。示例性纯化过程在实施例部分中详细描述。亲和层析亲和层析步骤的主要目标包括从起始制备物(例如，无细胞条件培养基、细胞裂解物、包涵体提取物等)捕获产物，以及从过程来源的杂质(例如，宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白、培养基组分和不定物质)分离所关注的蛋白。因此，适合本发明的亲和层析涉及利用可以结合至SMIP蛋白的吸收剂。例如，合适的吸收剂可以为结合至抗体免疫球蛋白恒定结构域的蛋白。合适的吸收剂可以为G蛋白、LG蛋白或A蛋白。在一些实施方案中，合适的吸收剂为结合至抗体免疫球蛋白可变结构域(例如，VH3结构域或与VH3结构域同源的结构域)的蛋白。吸收剂可以附着至任何合适的固相支持体，包括琼脂糖(agarose)、琼脂糖(s印harose)、二氧化硅、火棉胶活性炭、沙和任何其他合适的材料。这样的材料为本领域众所周知。任何合适的方法均可以用于将吸18收剂附着至固相支持体。用于将蛋白附着至合适的固相支持体的方法为本领域众所周知。参见例如Ostrove(1990),inGuidetoProteinPurification,MethodsinEnzymology,182:357-371。在一些实施方案中，合适的亲和层析步骤可以使用A蛋白层析柱或G蛋白层析柱。A蛋白层析柱可以为，例如PROSEP-A(Millipore,U.K.)、A蛋白琼脂糖FASTFLOW(GEHealthcare,Piscataway,N.J.)>T0Y0PEARL650MA胃白(TosoHassCo.，Philadelphia,Pa.)或MabSelectA蛋白柱(GEHealthcare,Piscataway,N.J.)。在将蛋白制备物应用于亲和层析柱之前，可以期望调整诸如pH、离子强度和温度的参数，并且在有些情况下加入不同种类的物质。因此，通过用为蛋白产物的结合和纯化带来合适特征的溶液(例如，用于调整PH、离子强度等或用于引入去污剂的缓冲液)洗涤来进行亲和层析柱的平衡是任选步骤。在一些实施方案中，可以利用含有盐的溶液平衡A蛋白柱，例如，约IOOmM至约150mM磷酸钠、约IOOmM至约150mM乙酸钠和约IOOmM至约150mMNaCl。平衡缓冲液的pH范围可以从约6.O至约8.O。在一实施方案中，平衡缓冲液的pH为约7.5。平衡缓冲液还可以含有约IOmM至约50mMTris0在另一实施方案中，所述缓冲液可以含有约20mMTris0在装载蛋白制备物之后，可以利用洗涤溶液来洗涤结合柱。合适的洗涤溶液可以含有盐(例如，H印es、氯化钠、氯化钙、氯化镁)、精氨酸、组氨酸、Tris和/或其他组分。在一些实施方案中，适合本发明的洗涤溶液可以含有精氨酸或精氨酸衍生物。合适的精氨酸衍生物可以为但不限于乙酰精氨酸、胍基丁胺、arginicacid、N-α-丁酰-L-精氨酸或Ν-α-新戊酰精氨酸。洗涤溶液中精氨酸或精氨酸衍生物的合适浓度在约0.IM和约2.OM之间(例如，0.1Μ、0·4Μ、0·5皿、1.011、1.511或2.010，或者约0.5Μ和约1.0Μ之间(例如，0.5Μ、0.6Μ、0.7Μ、0.8Μ、0.9Μ或1.0Μ)。精氨酸或精氨酸衍生物在亲和层析中的用途在美国申请公开第2008/0064860号中详细描述，其公开内容援引并入本文。在一些实施方案中，适合本发明的洗涤溶液可以含有咪唑或咪唑衍生物。在一些实施方案中，合适的洗涤溶液可以含有离液剂(例如，尿素、硫氰酸钠和/或盐酸胍)。在一些实施方案中，合适的洗涤溶液可以含有疏水改性剂(例如，有机溶剂，包括乙醇、甲醇、丙二醇、乙二醇、六甘醇、丙醇、丁醇和异丙醇)。在一些实施方案中，适合本发明的洗涤溶液可以含有去污剂(例如，非离子型去污剂和/或离子型去污剂)。洗涤溶液的pH—般在约4.5和约8.0之间，例如，4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5和8.0。在相同情况下，洗涤溶液的pH大于5.0和小于约8.0，例如，5.5,6.0,6.5,7.0,7.5和8.0。洗涤溶液可以含有20mM-50mMTris(例如20mM、30mM、40mM或50mM)。可以通过洗脱缓冲液从已洗涤的诸如A蛋白柱的柱洗脱产物。通常，合适的洗脱缓冲液可以含有H印es、磷酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、一种或多种有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、丙二酸、苯二甲酸、水杨酸)和/或精氨酸。合适的洗脱缓冲液还可以含有盐(例如，氯化钠、氯化钾、氯化铵、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、钙盐、和/或镁盐)。合适的盐浓度范围可以为OmM-IM(例如，0mM-500mM、0mM-100mM、0mM-50mM)。在一些实施方案中，合适的洗脱缓冲液含有约15mM至约IOOmMNaCl。在一些实施方案中，洗脱缓冲液中的NaCl浓度可以在4个水平(例如，0mM、15mM、30mM和50mM)。在其他实施方案中，洗脱缓冲液可以含有约20mM至约200mM精氨酸或精氨酸衍生物。在其他实施方案中，洗脱缓冲液可以含有20mM-200mM甘氨酸。洗脱缓冲液还可以含有约20mM至约IOOmMHEPES。洗脱缓冲液还可以含有约25mM至约IOOmM乙酸。在一些实施方案中，洗脱缓冲液可以含有柠檬酸(例如，约IOmM至约500mM柠檬酸)。在一些实施方案中，洗脱缓冲液可以含有甘氨酰甘氨酸(例如约10-50mM、约50-100mM或约100_200mM)。在一些实施方案中，合适的洗脱缓冲液可以含有离液剂(例如，尿素、硫氰酸钠和/或盐酸胍)。在一些实施方案中，合适的洗脱缓冲液可以含有烷基二醇(例如，乙二醇、丙二醇、六甘醇)。洗脱缓冲液的PH范围可以从约2.5至约4.0。在一实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约3.0。可以通过中和缓冲液中和来自亲和层析柱的洗脱液。合适的中和缓冲液可以含有Tris,Hepes和/或咪唑。洗脱之后，可以任选地清洗亲和层析柱，即在蛋白洗脱之后剥除和/或再生亲和层析柱。通常定期进行这个步骤以使杂质在固相表面上的积累最小化和/或消毒基质以避免微生物污染产物。剥除和/或再生的柱可以重复使用。可以根据本领域普通技术人员的知识调整缓冲液组分。下文的实施例中提供了样品缓冲液的组成范围。不是所有缓冲液或步骤都是必需的，但是仅为了说明而提供。如实施例所述，高通量筛选可以用于高效优化A蛋白柱层析的缓冲条件。离子交换层析离子交换层析步骤的主要目标包括去除过程来源的杂质(例如，浸出的A蛋白、宿主细胞DNA和/或蛋白、不定物质)以及产物相关的杂质，如HMW团聚体。在一些实施方案中，根据本发明离子交换层析与亲和层析组合使用。在一些实施方案中，可以用离子交换层析(例如，阳离子交换和/或阴离子交换层析)代替亲和层析。可以使各种阴离子或阳离子取代基附着至基质以形成层析的阴离子或阳离子支持体。阴离子交换取代基包括二乙氨乙基(DEAE)、三甲基氨乙基丙烯酰胺(TMAE)、四级氨乙基(QAE)和季铵类(Q)基团。阳离子交换取代基包括羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸盐(P)和磺酸盐(S)。具有聚乙烯亚胺功能基团的离子交换树脂，如P0R0SHQ50可从AppliedBiosystems,FosterCity,CA获得。具有固定化重组A蛋白功能基团的交换树脂，如P0R0SA50可从AppliedBiosystems,FosterCity，CA获得。诸如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52的纤维素离子交换树脂可从WhatmanLtd.Maidstone,Kent,U.K.获得。基于葡聚糖凝胶和交联的离子交换剂也是已知的。例如，CAPTOQ、DEAE_、QAE-、CM-和SP-葡聚糖凝胶，以及DEAE-、Q-、CM-和S-琼脂糖(例如，DEAE琼脂糖FF、Q琼脂糖FF和Q琼脂糖XL)，以及琼脂糖全部可从GEHealthcare,Piscataway,N.J.获得。此外，DEAE和CM衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物，如T0Y0PEARLDEAE-650S或M，T0Y0PEARLCM-650S或M，T0Y0PEARLGIGACAPQ-650，以及T0Y0PEARLGIGACAPCM-650可从TosoHaasCo.，Philadelphia,Pa获得。根据本发明还可以使用诸如CIM_DISK的离子交换整体层析支持体，并且可从BiaS印arations，Austria获得。根据本发明还可以使用离子交换膜吸附器，如MustangQ和MustangE(PallCorporation,NewYork)、SartobindQ(SartoriusStedimBiotechS.A.,France)以及Chromasorb(Millipore,Massachusetts)。在一些实施方案中，使用阴离子交换柱。在与蛋白接触之前，可以首先用高盐缓冲液然后低盐缓冲液平衡阴离子交换柱。通常，SMIPs仅弱结合至柱，这允许大部分产物流穿，而具有负电荷的杂质，如宿主细胞DNA和HCP强结合并被保留。然后可以用平衡缓冲液洗涤柱以收集弱结合至树脂的额外的产物。一旦产物已从柱移除，可以利用高盐缓冲液剥除杂质。树脂可以再生、卫生处理，然后储存在乙醇溶液中。在一些实施方案中，在离子交换层析之前期望使用吸附性深层滤器以增加离子交换层析中所用的树脂的杂质容量和寿命。例如，FractogelEMDTMAEHi-Cap(M)树脂是具有合成甲基丙烯酸酯聚合物基质(polymericbase)的强阴离子交换剂。由缠结的聚合物团块形成的孔具有约800埃的大小。由于聚合物中的醚键，表面是强亲水的。长、线性聚合物链携带功能配体。这些聚合物链被称为触角。所有触角共价连接至甲基丙烯酸酯骨架的羟基。根据本发明还可以使用额外的触角树脂，如FractogelEMDTMAE(M)、FractogelEMDTMAE(S)和Fractopi^pTMAE。在蛋白装载(例如，ProA峰池)中使用吸附性深层预滤器可以保护TMAE柱以防杂质。可能这些杂质可以耗尽或封闭TMAE柱的结合位点，减少树脂对杂质的容量。例如，通过吸附深层滤器的预过滤或蛋白沉淀可以减少这些杂质。洗脱之后，可以任选地清洗离子交换层析柱，即在蛋白洗脱之后，剥除和/或再生离子交换层析柱。通常定期进行这个步骤以使杂质在固相表面上的积累最小化和/或减少微生物污染产物的可能性。在一些实施方案中，通过用浓度范围为10mM-2MNaOH的NaOH溶液处理来再生离子交换柱。剥除和/或再生的柱可以重复使用。如上文所述，在一些实施方案中，深层过滤可以用于减少蛋白制备物中的杂质。在一些实施方案中，深层过滤介质是由纤维素纤维、硅藻土和阳离子树脂粘合剂组成的高度多孔滤器。通过纤维素纤维筛分、疏水吸附至硅藻土和离子吸附至阳离子粘合剂，深层滤器可以去除杂质。深层滤器可以为，例如0.5cm、lcm、1.5cm、2.Ocm厚。在一些实施方案中，可以将一种或多种添加剂加入蛋白制备物以诱导沉淀和/或增强蛋白吸附至离子交换柱。在一些实施方案中，可以通过添加剂诱导蛋白沉淀以减少杂质的量。各种蛋白沉淀方法是本领域已知的，并且可以在本发明中使用。例如，可以通过盐析沉淀蛋白(例如，利用中性盐)。在一些实施方案中，可以通过加入有机溶剂(例如，甲醇、乙醇)沉淀蛋白。在一些实施方案中，非离子型有机聚合物可以用于促进蛋白结合至表面和/或沉淀。各种非离子型有机聚合物可商购并且可以在本发明中使用。实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、纤维素、葡聚糖、淀粉和聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方案中，PEG用作添加剂。在本发明中可以使用具有各种分子量的PEG。合适的PEG可以具有范围从例如约100至约20，000道尔顿的平均聚合物分子量。在一些实施方案中，合适的PEG可以具有200-12，000、400-20，000、400-1000、200-1000、400-2000、1000-5000、800-8，000、1000-10，000,2,000-12，000道尔顿之间的平均分子量。在一些实施方案中，示例性PEG包括具有例如200、400、800、1000、2，000、4，000、6，000、8000、10，000、12，000,14,000,16，000、18，000、20，000道尔顿等的平均分子量的PEG。可以加入各种浓度的PEG。较低分子量PEG—般会需要较高浓度以达到与较高分子量PEG相似的效果。示例性合适的PEG浓度范围为0-25%(例如，0-6%、0-9%、0-12%、0-15%、0-18%、0-20%、3-9%、3-15%、6-12^^6-20%或6-25%)。PEG或其他有机聚合物可以为线性或支化聚合物。应该考虑到PEG的结合或沉淀效果一般取决于蛋白的分子量。通常，对于较大的蛋白，PEG效果更大。例如，与导致相同量的增强的单体蛋白或LMW杂质结合所需的PEG浓度相比，较低浓度的给定分子量的PEG—般用于增强较大蛋白(例如，HMW团聚体)以及病毒的结合。因此，团聚体、复合体和其他大分子污染物的保留一般会被增强至比其来源的蛋白的非聚集形式更大的程度。因此，PEG或其他非离子型聚合物修饰特别有利于通过弱分配层析增强去除杂质，特别是那些弱结合的HMW团聚体。在一些实施方案中，可以在阴离子交换层析之前但是在亲和层析步骤之后加入PEG。在一些实施方案中，为了蛋白沉淀使用非离子型有机聚合物可以帮助减少或消除蛋白变性以及去除去污剂和其他杂质。在一些实施方案中，添加剂(例如，聚乙二醇)可以用于浓缩产物。在一些实施方案中，可以通过离心、过滤或其他本领域已知的分离方法分离沉淀物。在一些实施方案中，沉淀物含有污染物，如HMW团聚体。在一些实施方案中，期望去除含有污染物的沉淀物(例如，通过过滤)。在一些实施方案中，SMIPs存在于沉淀物中。在一些实施方案中，期望将含有SMIPs的沉淀物溶解在重悬缓冲液中。在一些实施方案中，重悬缓冲液具有适合直接装上离子交换柱的PH和/或电导率。如实施例所述，高通量筛选可以用于高效优化离子交换层析的缓冲条件。羟基磷灰石层析陶瓷羟基磷灰石(cHA)步骤的主要目标是去除高分子量(HMW)团聚体、渗出的A蛋白、用于促进沉淀或结合至吸收剂的添加剂(例如，聚乙二醇)和宿主细胞来源的杂质，如DNA和HCP。用中性pH左右和低离子强度的磷酸盐充电的cHA树脂可以用于结合单体蛋白产物(例如，SMIP)和HMW团聚体。因为HMW团聚体比单体更紧密地结合至cHA树脂，可以利用弱酸性至弱碱性PH的具有合适离子强度的洗脱缓冲液选择性洗脱单体。随后可以任选地利用在中性PH下的甚至更高离子强度和更高磷酸盐浓度的缓冲液从树脂洗掉HMW团聚体。如实施例所述，本发明已开发了可以从蛋白制备物高效去除丽团聚体的cHA操作条件。在一些实施方案中，HMW团聚体的百分率可以从在装载物质中超过5%(例如，5%、10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%)减少至在纯化的蛋白产物中少于4%(例如，少于3.5%,3.0%,2.5%,2.0%U.5%U.0%,0.8%,0.6%,0.4%,0.2%,0.1%)0在一些实施方案中，在cHA层析之后HMW团聚体可以减少至少约2倍，至少约5倍，至少约10倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约60倍，至少约70倍，至少约80倍，至少约90倍或至少约100倍。1.羟基磷灰石树脂各种羟基磷灰石层析树脂可商购并且可以用于本发明。例如，羟基磷灰石可以为结晶形式。在一些实施方案中，适合本发明的羟基磷灰石可以是团聚以形成颗粒并且在高温下烧结为稳定的多孔陶瓷块(mass)的羟基磷灰石。羟基磷灰石的颗粒大小可以广泛变化，但是典型的颗粒大小范围为直径1μm-1,000μm,并且可以为10μm-100ym(例如，20μm、40μm、60μm80μm)。许多层析树脂可以用于cHA柱的制备，最广泛使用的是I型和II型羟基磷灰石。I型具有高蛋白结合能力和对酸性蛋白更好的能力。I型特别适合小模块免疫药物蛋白的纯化。然而，II型具有较低的蛋白结合能力，但是对核酸和某些蛋白具有较好的分辨率。II型材料还具有非常低的白蛋白亲和力，并且特别适合于许多物种和种类免疫球蛋白的纯化。具体的羟基磷灰石类型的选择可以由熟练的技术人员确定。22本发明可以使用松散、填充在柱中或连续环形层析中的羟基磷灰石树脂。在本发明的一实施方案中，陶瓷羟基磷灰石树脂填充在柱中。柱尺寸的选择可以由熟练的技术人员确定。在一些实施方案中，至少0.5cm的柱直径与约20cm的床高度可以用于小规模纯化。在一些实施方案中，可以使用从约35cm至约60cm的柱直径。在一些实施方案中，可以使用60cm-85cm的柱直径。在一些实施方案中，在pH9.0的200mMNa2HPO4溶液中的陶瓷羟基磷灰石树脂浆可以用于以约4cm/min的恒定流速或用重力填充柱。在一些实施方案中，在蛋白洗脱之后，可以任选地清洗，即剥除和/或再生羟基磷灰石树脂。剥除和/或再生的柱可以重复使用。2.操作缓冲液和条件在用装载物质接触羟基磷灰石树脂之前，重要的是调整诸如pH、离子强度和温度的参数，以及在某些情况下加入不同种类的物质。因此，通过用为所关注蛋白(例如，SMIPs蛋白)的纯化带来必需特征的溶液(例如，用于调整pH、离子强度等或用于引入去污剂的缓冲液)洗涤来进行羟基磷灰石基质的平衡是任选步骤。在一些实施方案中，可以利用弱酸性至弱碱性pH的含有0.01-2.OMNaCl的溶液平衡羟基磷灰石基质。在一些实施方案中，平衡缓冲液可以含有磷酸钠、磷酸钾和/或磷酸锂。例如，平衡缓冲液可以含有l_20mM磷酸钠(例如，I-IOmM磷酸钠、2-5mM磷酸钠、2mM磷酸钠或5mM磷酸钠)。平衡缓冲液可以含有0.01-0.2MNaCl(例如，0.025-0.IMNaCl,0.05-0.2MNaCl、0.05-0.IMNaCl,0.05MNaCl或0.IMNaCl)。装载缓冲液的pH范围可以为6.2-8.0(例如，6.6-7.7,6.5-7.5,6.8,7.0,7.1,7.2或7.3)。平衡缓冲液还可以含有0-200mM精氨酸(例如，50mM、100mM、120mM精氨酸，140mM、160或180mM精氨酸)。平衡缓冲液还可以含有0-200mMHEPES(例如，20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、120mM、140mM、160mM、180mMHEPEQ。可以进行超过一个平衡步骤。各种蛋白制备物可以用作装载物质(例如，来自亲和层析的峰池、来自离子交换层析的流穿液或原始制备物)。在一些实施方案中，装载可以缓冲液交换入适当的装载缓冲液。例如，蛋白制备物可以缓冲液交换入弱酸性至弱碱性PH的含有0.2-2.5MNaCl的装载缓冲液。例如，装载缓冲液可以含有l_20mM磷酸钠(例如，2-8mM磷酸钠、3-7mM磷酸钠或5mM磷酸钠)。装载缓冲液可以含有0.01-0.2MNaCl(例如，0.025-0.IMNaCl、0.05-0.2MNaCl.O.05-0.IMNaCl.O.05MNaCl或0.IMNaCl)。装载缓冲液的pH范围可以为6.4-7.6(例如，6.5-7.0或6.6-7.2)。可以通过将蛋白制备物应用于含有固相介质的填充床柱、流化/扩增床柱来进行装载，和/或通过简单批量操作将蛋白制备物与羟基磷灰石树脂混合，其中固相介质与溶液混合一定时间。装载之后，可以任选地利用洗涤缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)洗涤羟基磷灰石树脂以去除松散结合的杂质。可以使用的洗涤缓冲液将取决于羟基磷灰石树脂的性质，并且可以由本领域普通技术人员确定。在任选的洗涤步骤之后，可以从柱洗脱结合产物。为了从柱高效洗脱SMIP蛋白单体，本发明使用了弱酸性至弱碱性pH的高离子强度磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，洗脱缓冲液可以含有磷酸钠、磷酸钾和/或磷酸锂。例如，合适的洗脱缓冲液可以含有1-IOOmM磷酸钠(例如，2-50mM、2_40mM、2_35mM、2_32mM、2-30mM,4-35mM,4-20mM,10_40mM、10-35mM、4-10mM或2-6mM磷酸钠)。在一些实施方案中，合适的洗脱缓冲液可以含有2mM、3mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM或60mM磷酸钠。合适的洗脱缓冲液还可以含有0.01-2.5MNaCl(例如，0.1-2.5Μ、0·1-2.OM、0.1-1.6Μ、0·1-1.2Μ、0·1-1.0Μ,0.1-0.8Μ、0·1-0.5ΜΜ、0·2-1.5Μ、0·2-1.2ΜNaCU0.2-1.0Μ、0.2-0.8Μ、0.3-1.IM或0.2-0.5ΜNaCl)。在一些实施方案中，合适的洗脱缓冲液含有10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、375mM、400mM、425mM、450mM、500mM、l.0M、1.5M、2.OM或2.5MNaCl)。合适的洗脱缓冲液的pH范围为6.4-8.5(例如，6.4-8.0,6.4-7.8、6.5-7.7或6.5-7.3)。在一些实施方案中，合适的洗脱缓冲液的pH可以为6.4,65,6.6,6.8,7.0,7.2、7.4,7.6,7.8,8.0,8.2,8.4或8.5)。在一些实施方案中，含有不同盐浓度的洗脱缓冲液可以用于连续或分步梯度地从柱洗脱结合产物。示例性缓冲液和操作条件如实施例部分所述。如实施例所述，高通量筛选或可选筛选(例如，梯度洗脱筛选)可以用于高效优化羟基磷灰石层析的缓冲液和操作条件。通常，结合模式cHA层析用于本发明。可选地或额外地，可以使用流穿模式。在流穿模式中，如本文所述，通常将蛋白制备物缓冲液交换入合适的装载缓冲液。然后允许蛋白制备物流穿羟基磷灰石柱，而诸如HMW团聚体的杂质结合至柱。随后任选地洗涤柱以允许额外纯化的蛋白流穿柱。在组合结合/流穿模式中，允许蛋白制备物流穿羟基磷灰石柱，最初蛋白单体和HMW团聚体均结合。然而，随着装载继续，进入的HMW团聚体能够比蛋白单体更紧密地结合，并且因此置换结合的单体。因此，置换的单体流穿柱。随后任选地洗涤柱以允许额外置换的单体流穿柱。除了上文特别讨论的盐和缓冲液，层析和装载可以在各种缓冲液和/或盐中进行，包括钠、钾、铵、镁、钙、氯化物、氟化物、乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和/或Tris缓冲液。这样的缓冲液和盐的具体实例为Tris、磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵、氯化钠、氯化钾、氯化铵、氯化镁、氯化钙、氟化钠、氟化钾、氟化铵、氟化钙、氟化镁、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、乙酸镁、乙酸钙、乙酸钠、乙酸钾或乙酸铵。如实施例所述，高通量筛选可以用于高效优化cHA层析的缓冲条件。此外，可以处理本文所述的各种缓冲液和溶液以确保无内毒素和/或外毒素。特别地，如果纯化的蛋白制备物是为了用于制药和/或临床用途，可以期望使用无内毒素和/或外毒素的缓冲液。从缓冲液或溶液去除内毒素和/或外毒素的各种方法是本领域已知的，并且可以在本发明中使用。例如，缓冲液和溶液可以是无热原的。可以通过例如酸水解、氧化、加热、氢氧化钠等完成去热原。额外的过滤步骤额外的膜过滤步骤可以用于减少不定病毒和其他污染物，浓缩和/或缓冲液交换。在本发明中可以使用各种病毒保留滤器，包括但不限于PlanOVa20N病毒保留过滤(VRF)和Plan0va35N病毒保留过滤(VRF)等。各种超滤和/或渗滤装置(skid)(例如，分子量截留IOkDa)可以用于在制剂缓冲液中浓缩和/或缓冲液交换过程流(processstream)。可以使最终的药物通过例如一次性使用0.2pm滤器以去除任何潜在的不定微生物污染物和颗粒物质。含有纯化的SMIP蛋白的药物组合物本文所述的纯化的蛋白制备物可以为药用配制。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物可以含有纯化的SMIP蛋白，其具有少于4%(例如，少于3.5%、3.0%、2.5%,2.0%U.5%U.0%,0.8%,0.6%,0.4%,0.2,0.1%)的HMW团聚体。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物可以含有纯化的SMIP蛋白，其具有超过70%(例如，超过75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%)的以生物活性单体形式存在的蛋白。根据本发明的药物组合物可以含有一种或多种药学可接受的媒介物。这样的药学可接受的媒介物将包括与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。用于药物活性物质的这样的介质和物质的用途是本领域已知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或物质，其在组合物中的使用是预期的。还可以通过药剂学/微生物学领域众所周知的任何方法将辅助活性化合物(根据本发明鉴定和/或本领域已知)并入组合物。本发明的药物组合物配制为与其预期的给药途径相容。用于给药的溶液或悬浮液可以包括本领域众所周知的组分，如无菌稀释剂，如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于涨度调整的物质，如氯化钠或葡萄糖，和/或酸或碱，如盐酸或氢氧化钠等。适合给药的本发明的剂型可以为本领域已知的任何形式。例如，用于口服的合适的剂型可以为胶囊剂、明胶胶囊剂、小药囊剂、片剂(tablet)、片剂(troche)、锭剂、粉剂、颗粒剂、在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液、或者水包油乳剂或油包水乳剂。还可以大丸剂、干药糖剂(electuary)或糊剂的形式给予治疗剂。如另一实例，可注射使用的合适的剂型包括无菌水性溶液(可溶于水)或分散剂(dispersion)，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。为了静脉内给药，合适的媒介物包括生理盐水、抑菌水、乳浮ELTM(BASF，Parsippany,N.J.)或磷酸缓冲盐水(PBS)。适合关节内给药的剂型可以为无菌水性制剂形式的治疗剂，所述治疗剂可以为微晶形式，例如，水性微晶悬浮液形式。为了关节内和眼部给药，脂质体剂型或可生物降解的聚合物系统也可以用于呈现治疗剂。用于包括眼部治疗在内的体表给药的剂型包括液体或半液体制剂，如搽剂、洗剂、凝胶剂、applicants，水包油或油包水乳剂，如霜剂、软膏剂或糊剂；或者溶液或悬浮液，如滴剂。为了吸入治疗，如为了哮喘，可以使用由喷雾器、雾化吸入器或雾化器分配的吸入粉末(自动推进或喷雾剂型)。为了从粉末吸入装置或自动推进粉末制剂肺部给药，这样的剂型可以是精细粉碎的粉末。W109]还可以通过透粘膜或透皮方式全身给药。根据本发明，可以通过任何途径向哺乳动物宿主给予包含纯化的制备物的药物组合物。因此，在适当情况下，可以口服或胃肠道外给药，例如，静脉内、皮内、吸入、透皮(体表)、透粘膜和直肠给药。因此，通过参照以下实例，一般描述的本发明会更容易理解，以下实例以说明方式提供而不是为了限制本发明。实施例实施例1.细胞培养和收获利用在悬浮培养中生长的重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系产生抗⑶20SMIP蛋白TRU-015。产生TRU-015的示例性细胞培养和收获过程如图4所示。对于本文所述的所有细胞培养步骤，加入所述步骤的液体在添加之前通过0.2μm滤器过滤至少一次。不能通过这样的滤器的消泡剂悬浮液在添加之前高压灭菌。含有细胞的培养液在步骤之间不过滤。将含有表达TRU-015的CHO细胞系的小瓶细胞解冻并转移至培养瓶，所述培养瓶含有预热的、具有用于选择压力的0.45μM氨甲喋呤的摇瓶培养基。瓶和波浪袋中细胞培养物的扩大和维持最初利用分批-重补料过程将细胞培养物扩大至一次性摇瓶(最大工作体积1L)。在分批-重补料循环中，始终将每个摇瓶在控制的温度和(X)2空气下振荡培养。在循环结束时，将所有或部分培养物转移至一个或多个其他摇瓶(或者，如果有足够数量的细胞，转移至波浪袋-参见下文)，并且用摇瓶培养基稀释至预定义的目标起始细胞密度。重补料之后，将每个稀释的培养物放回培养箱，在另一个分批-重补料循环中始终振荡。直到最终的补料分批培养步骤，所用的所有细胞培养基任选含有氨甲喋呤以保持选择压力。一旦通过在摇瓶中生长获得了足够数量的细胞，在波浪袋中继续扩大培养。生长循环和培养箱条件与瓶相同，除了摆动波浪袋代替摇动。波浪袋培养基与摇瓶培养基相同。只要需要，以这种方式继续摇瓶和波浪袋培养，直到从解冻开始规定的最大代数。典型地，一旦波浪袋中可获得足够数量的细胞就接种种子培养生物反应器，并且保留至少一个波浪袋作为种子培养生物反应器的后备。种子培养生物反应器中细胞培养物的扩大和维持在种子培养生物反应器中继续扩大接种物。将种子生物反应器培养基加入生物反应器，并且补充高压灭菌的在盐水中的消泡剂悬浮液。加入来自波浪袋的接种培养物至预定义的目标细胞密度以开始每个分批-重补料传代。在传代中始终在控制的条件下搅拌维持培养物，之后取回部分并用于接种下一个生物反应器，或者如果需要丢弃部分。将温度控制在或接近37°C，利用喷射的0.2μπι过滤的空气、氧或两种气体的混合物来控制溶解氧(DO2)，利用碳酸盐溶液(碱滴定剂)控制ρΗ。每个后续种子培养生物反应器分批-重补料传代从保留来自前一循环的部分培养物、用种子生物反应器培养基稀释和加入消泡剂悬浮液开始。将种子培养生物反应器和波浪袋维持在分批-重补料操作中，根据需要互相作为后备，并且为多个生产生物反应器批次提供接种物。一旦可获得足够数量的细胞，接种生产生物反应器。生产生物反应器利用持续10-15天的最终补料分批过程在生产生物反应器中产生含有TRU-015的条件培养基。将来自种子培养生物反应器的接种培养物加入生产生物反应器中的起始生产培养基。加入消泡剂悬浮液。在批中始终在控制的条件下搅拌维持所得培养物。在接种后约4天时，将温度调定点从37°C转换至31°C。在生产细胞培养过程中始终利用喷射的0.2μm过滤的空气、氧或混合物来控制DO2,并且利用碳酸盐溶液(碱滴定剂)控制ρΗ。在补料分批期间还加入浓缩的补料培养基溶液。接种之后10天和15天之间，收获整个体积的生产生物反应器培养物。基于进度考虑和/或培养物存活力考虑选择收获日期。26图5示出了在14天培养期期间2个不同CHO细胞克隆所产生的TRU-015的生产生物反应器的示例性每天滴度测量(μg/mL)。在生产生物反应器生长的第12天和第14天之间获得了滴度峰值。滴度峰值范围为1500-3000μg/mL。通过碟式沉积离心(DSC)收获通过碟式沉积离心收获来自生产生物反应器的条件培养基以获得澄清的条件培养基(CCM)。DSC步骤的一个目标是从含有SMIP蛋白的条件培养基分离CHO细胞和细胞碎片。通过压力使生物反应器容器的内容通过DSC，然后垫式过滤装置，然后0.2μm滤器进入滤液容器或袋。当收获处理完成时，将HEPES/EDTA缓冲溶液加入过滤的离心分离池(centratepool)。该添加的一个目的是减少在DSC和后续步骤之间的过程中保存期间酸性种类的产生。EDTA还可以抑制蛋白酶活性和减少A蛋白渗出。DSC步骤在室温下操作。实施例2.层析条件的高通量筛选用高通量筛选开发优化的纯化过程条件。潜力层析选项的早期高通量筛选允许操作窗口的快速鉴定。高通量筛选结果与数据库的比较进一步缩小了操作条件。高通量筛选使运行的柱数量和所需的过程中物质最小化，并且使得能够平行发展努力。A蛋白层析A蛋白层析步骤的主要目标包括从无细胞的澄清条件培养基捕获产物，并且从过程来源的杂质(例如，宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白[HCP]、培养基组分和不定物质)分离TRU-O15。进行高通量筛选以优化A蛋白柱条件以增加产物捕获、杂质的去除并且最小化洗脱液沉淀。利用批量结合机理的高通量筛选的示例性设计如图6所示，并且A蛋白柱操作和高通量筛选模型的实例如图7所示。如图所示，筛选了赋形剂洗涤、洗脱和中和条件的不同组合。特别地，所述筛选至少变化了作为洗涤赋形剂的氯化钠、氯化钙、精氨酸和Tris的水平；作为洗脱缓冲液的HEPES、乙酸和甘氨酸；作为中和缓冲液的Tris、HEPES和咪唑；和洗脱中的氯化钠浓度水平(例如，0mM、15mM、30mM和50mM)。所述筛选使用含有96孔的滤板，每个孔具有不同条件。每个孔含有约50μ1树脂禾口300μ1液体。禾Ij用TecanRobot(TecanUS,Inc.4022StirrupCreekDriveSuite310Durham,NC27703,USA)将树脂和液体混合约20分钟，并且将板离心以收集上清液。分析来自每个孔的上清液以确定产物的回收率、单体和团聚体的量以及宿主细胞蛋白的存在。例如，用在A280处的UV吸光度确定总蛋白浓度。通过在A320处的吸光度测量浊度。通过大小排阻HPLC测量单体和团聚体的量。通过ELISA表征宿主细胞蛋白。示例性A蛋白高通量筛选结果如图8所示。在这个实验中鉴定的一示例性有利条件包括钙洗涤、具有氯化钠的乙酸洗脱和HEPES中和(参见图8)。离子交换层析离子交换层析的主要目标包括去除过程来源的杂质(例如，渗出的A蛋白、宿主细胞DNA和蛋白以及不定物质)以及产物相关的杂质，如高分子量(HMW)种类。相似地，用高通量筛选鉴定阴离子交换层析(AEX)条件和阳离子交换层析(CEX)的潜力操作条件以去除杂质。测试的示例性变量如表1所示。表1.AEX和CEX的高通量筛选方法权利要求1.一种从含有高分子量团聚体的蛋白制备物纯化小模块免疫药物蛋白的方法，其包含使所述蛋白制备物在操作条件下进行羟基磷灰石层析的步骤，使得所述纯化的小模块免疫药物蛋白含有少于4%的团聚体。2.权利要求1的方法，其中所述方法包含不超过3个层析步骤。3.权利要求1或2的方法，其中所述操作条件包含在磷酸盐缓冲液中从羟基磷灰石层析柱洗脱所述小模块免疫药物蛋白。4.权利要求3的方法，其中所述磷酸盐缓冲液是无内毒素的。5.权利要求3或4的方法，其中所述磷酸盐缓冲液是无热原的。6.权利要求3的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包含磷酸钠、磷酸钾和/或磷酸锂。7.权利要求3的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包含在lmM-50mM浓度范围的磷酸钠。8.权利要求3的方法，其中所述磷酸盐缓冲液还包含在100mM-2.5M浓度范围的氯化钠。9.权利要求3的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包含在2mM-32mM浓度范围的磷酸钠和在IOOmM-L6M浓度范围的氯化钠。10.权利要求3-9中任一项的方法，其中所述磷酸盐缓冲液具有6.5-8.5范围的pH。11.权利要求1的方法，其中所述操作条件包含通过NaCl梯度从羟基磷灰石层析柱洗脱所述小模块免疫药物蛋白。12.权利要求1的方法，其中所述操作条件包含通过NaCl分步洗脱方法从羟基磷灰石层析柱洗脱所述小模块免疫药物蛋白。13.权利要求1的方法，其中所述操作条件包含通过磷酸盐梯度从羟基磷灰石层析柱洗脱所述小模块免疫药物蛋白。14.权利要求13的方法，其中所述磷酸盐梯度为线性梯度。15.权利要求13的方法，其中所述磷酸盐梯度为分步梯度。16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述羟基磷灰石层析使用含有I型或II型陶瓷羟基磷灰石树脂的柱。17.权利要求16的方法，其中所述柱含有I型陶瓷羟基磷灰石树脂。18.权利要求16或17的方法，其中所述树脂直径为1μm-1,000μm。19.权利要求16或17的方法，其中所述树脂直径为10μm-100μm20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法还包含在羟基磷灰石层析之前通过亲和层析纯化所述蛋白制备物的步骤。21.权利要求20的方法，其中所述亲和层析使用结合至免疫球蛋白恒定结构域的蛋白吸收剂。22.权利要求20的方法，其中所述亲和层析使用结合至免疫球蛋白可变结构域的蛋白吸收剂。23.权利要求22的方法，其中所述蛋白吸收剂结合至VH3结构域。24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述蛋白吸收剂包含A蛋白。25.权利要求M的方法，其中所述亲和层析使用MabklectrProteinA树脂柱。26.权利要求20的方法，其中所述亲和层析步骤包含利用洗涤缓冲液洗涤亲和层析柱，所述洗涤缓冲液包含Hepes、氯化钠、氯化钙、精氨酸、Tris、氯化镁、组氨酸、尿素、咪唑、一种或多种有机溶剂、离子型和/或非离子型去污剂。27.权利要求沈的方法，其中所述一种或多种有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙二醇、乙二醇、丙醇、异丙醇、丁醇及其组合。28.权利要求20的方法，其中所述亲和层析步骤包含利用洗脱缓冲液从亲和层析柱洗脱小模块免疫药物蛋白，所述洗脱缓冲液包含Hepes、磷酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、氯化镁、尿素、丙二醇、乙二醇、一种或多种有机酸和/或精氨酸。29.权利要求观的方法，其中所述一种或多种有机酸选自乙酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、丙二酸、苯二甲酸和水杨酸。30.权利要求观的方法，其中所述洗脱缓冲液还包含选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁及其组合的盐。31.权利要求30的方法，其中所述盐浓度范围为ImM-lM。32.权利要求30的方法，其中所述盐浓度范围为lmM-500mM。33.权利要求30的方法，其中所述盐浓度范围为ImM-lOOmM。34.权利要求20-33的方法，其中所述方法还包含加入添加剂以促进结合至吸着剂。35.权利要求1的方法，其中所述方法还包含使用阴离子交换层析树脂通过阴离子交换层析纯化所述蛋白制备物的步骤。36.权利要求20-35中任一项的方法，其中所述方法还包含在所述亲和层析之后但是在所述羟基磷灰石层析之前通过阴离子交换层析纯化所述蛋白制备物的步骤。37.权利要求35或36的方法，其中所述方法还包含加入添加剂以增强所述小模块免疫药物蛋白和/或杂质结合至所述阴离子交换层析树脂的步骤。38.权利要求37的方法，其中所述添加剂包含非离子型有机聚合物。39.权利要求38的方法，其中所述非离子型有机聚合物为聚乙二醇(PEG)。40.权利要求35-39中任一项的方法，其中所述方法还包括在所述阴离子交换层析之前的深层过滤步骤。41.前述权利要求中任一项的方法，所述方法还包含一个或多个过滤步骤。42.权利要求41的方法，其中所述一个或多个过滤步骤包含病毒保留过滤步骤。43.权利要求41的方法，其中所述一个或多个过滤步骤包含超滤和/或渗滤步骤。44.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法还包含加入添加剂的步骤以诱导来自所述蛋白制备物的一种或多种污染物蛋白沉淀，使得可以从污染物进一步分离所述小模块免疫药物蛋白。45.权利要求44的方法，其中所述添加剂包含非离子型有机聚合物。46.权利要求45的方法，其中所述非离子型有机聚合物为聚乙二醇(PEG)。47.权利要求44-46中任一项的方法，其中所述沉淀在阴离子交换层析之前诱导，并且其中所述方法还包含通过过滤从所述蛋白制备物去除沉淀的污染物的步骤。48.前述权利要求中任一项的方法，其中所述纯化的小模块免疫药物蛋白含有少于2%的团聚体。49.前述权利要求中任一项的方法，其中所述纯化的小模块免疫药物蛋白含有少于的团聚体。50.前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白制备物含有超过10%的高分子量团聚体。51.前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白制备物含有超过20%的高分子量团聚体。52.前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白制备物含有超过30%的高分子量团聚体。53.权利要求1-47中任一项的方法，其中所述蛋白制备物含有超过60%的高分子量团聚体。54.权利要求1-47中任一项的方法，其中所述蛋白制备物含有少于30%的高分子量团聚体。55.权利要求1-47中任一项的方法，其中所述蛋白制备物含有少于20%的高分子量团聚体。56.权利要求1-47中任一项的方法，其中所述蛋白制备物含有少于15%的高分子量团聚体。57.权利要求1-47中任一项的方法，其中所述蛋白制备物含有少于10%的高分子量团聚体。58.权利要求1-47中任一项的方法，其中所述蛋白制备物含有少于5%的高分子量团聚体。59.前述权利要求中任一项的方法，其中所述小模块免疫药物蛋白特异性结合至CD20。60.权利要求59的方法，其中所述小模块免疫药物蛋白包含与SEQIDN0:l_59和67-76中任一个具有至少80%相同性的氨基酸序列。61.前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白制备物是从培养的细菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞、无细胞培养基、转基因动物或植物制备的。62.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述蛋白制备物为细胞培养基制备物。63.权利要求62的方法，其中所述培养基制备物包含从培养细胞分泌的所述小模块免疫药物蛋白。64.权利要求63的方法，其中所述培养细胞为CHO细胞。65.权利要求62的方法，其中所述培养基制备物是从大型生物反应器制备的。66.权利要求1-61中任一项的方法，其中所述蛋白制备物包含细胞提取物。67.权利要求1-61中任一项的方法，其中所述蛋白制备物是从包涵体制备的。68.一种从含有高分子量团聚体的蛋白制备物纯化小模块免疫药物蛋白的方法，所述方法包含使所述蛋白制备物在操作条件下进行(a)亲和层析和/或离子交换层析，和(b)羟基磷灰石层析，使得所述纯化的小模块免疫药物蛋白含有少于4%的团聚体。69.权利要求68的方法，其中使所述蛋白制备物进行(al)亲和层析、(^)离子交换层析和(b)羟基磷灰石层析。70.权利要求68的方法，其中使所述蛋白制备物进行(al)阳离子交换层析、(a2)阴离子交换层析和(b)羟基磷灰石层析。71.权利要求68-70中任一项的方法，其中所述方法包含不超过3个层析步骤。72.权利要求68或69的方法，其中所述亲和层析为A蛋白层析。73.权利要求68或69的方法，其中所述离子交换层析为使用阴离子交换层析树脂的阴离子交换层析。74.权利要求73的方法，其中所述阴离子交换层析树脂选自QSepharoseFF、QSepharoseXL、DEAESepharoseFF、POROSHQ50、POROSA50、ToyopearlDEAE>iToyopearlGigaCapQ-650M,ToyopearlDEAE-650M,CaptoQ.CaptoDEAE和触角型阴离子交换层析。75.权利要求73的方法，其中所述阴离子交换层析树脂为带电膜吸收体。76.权利要求75的方法，其中所述阴离子交换层析选自MuStangQ、MuStang_E、SartobindQ和Chromasorb。77.权利要求73的方法，其中所述阴离子交换层析树脂为带电单片支持体。78.权利要求77的方法，其中所述阴离子交换层析为CIM-DISK。79.权利要求69的方法，其中所述亲和层析为MabklectTMrfr0teinA亲和层析，所述离子交换层析为触角型阴离子交换层析，并且所述羟基磷灰石层析为I型陶瓷羟基磷灰石层析。80.权利要求79的方法，其中所述触角型阴离子交换层析选自Fract0gelTMAEHiCap(M)、FractogelTMAE(S)和Fractopi^pTMAE。81.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法还包含剥除和/或再生一个或多个层析柱用于重新使用。82.权利要求68-81中任一项的方法，其中所述纯化的小模块免疫药物蛋白含有少于2%的团聚体。83.权利要求68-81中任一项的方法，其中所述纯化的小模块免疫药物蛋白含有少于的团聚体。84.权利要求68-81中任一项的方法，其中所述蛋白制备物含有超过20%的高分子量团聚体。85.权利要求84的方法，其中所述蛋白制备物含有超过60%的高分子量团聚体。86.权利要求68-81中任一项的方法，其中所述蛋白制备物含有少于30%的高分子量团聚体。87.权利要求68-86中任一项的方法，其中所述小模块免疫药物蛋白特异性结合至CD20。88.权利要求87的方法，其中所述小模块免疫药物蛋白包含与SEQIDN0:l_59和67-76具有至少80%相同性的氨基酸序列。89.使用权利要求1-88中任一项的方法纯化的小模块免疫药物蛋白。90.一种从含有超过20%的高分子量团聚体的蛋白制备物纯化蛋白的方法，所述方法包含使所述蛋白制备物在操作条件下进行羟基磷灰石层析的步骤，使得所述纯化的蛋白含有少于4%的团聚体。91.权利要求90的方法，其中所述蛋白制备物含有超过60%的高分子量团聚体。92.权利要求90的方法，其中所述操作条件包含在磷酸盐缓冲液中从羟基磷灰石层析柱洗脱所述蛋白。93.权利要求92的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包含磷酸钠、磷酸钾和/或磷酸锂。94.权利要求92的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包含在lmM-50mM浓度范围的磷酸钠。95.权利要求92的方法，其中所述磷酸盐缓冲液还包含在100mM-2.5M浓度范围的氯化钠。96.权利要求92的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包含在2mM-32mM浓度范围的磷酸钠和在IOOmM-L6M浓度范围的氯化钠。97.权利要求92-96中任一项的方法，其中所述磷酸盐缓冲液具有6.5-8.5范围的pH。98.权利要求90的方法，其中所述蛋白包含小模块免疫药物多肽。99.一种包含小模块免疫药物蛋白和药学可接受的媒介物的药物组合物，其中所述小模块免疫药物蛋白包含少于4%的高分子量团聚体。100.权利要求99的药物组合物，其中所述小模块免疫药物蛋白包含少于3%的高分子量团聚体。101.权利要求99的药物组合物，其中所述小模块免疫药物蛋白包含少于2%的高分子量团聚体。102.权利要求99的药物组合物，其中所述小模块免疫药物蛋白包含少于的高分子量团聚体。全文摘要本发明提供了基于羟基磷灰石层析的从含有高分子量(HMW)团聚体和其他杂质的蛋白制备物纯化或回收蛋白，特别是小模块免疫药物(SMIPsTM)蛋白的方法。在一些实施方案中，所述羟基磷灰石层析与亲和层析和/或离子交换层析组合使用。在一些实施方案中，根据本发明的创造性的方法包含不超过3个层析步骤。本发明还提供了根据本发明纯化的诸如SMIPsTM的蛋白和含有相同蛋白的药物组合物。文档编号C07K16/46GK102395597SQ201080011523公开日2012年3月28日申请日期2010年3月11日优先权日2009年3月11日发明者A·诺伊斯,C·加洛,D·拉卡斯,J·E·布思,J·科米尔,S·孙申请人:惠氏有限责任公司