兔血中球蛋白的纯化制备方法
【专利摘要】发明公开了一种兔血中球蛋白的纯化制备方法，主要包括如下工艺步骤：(1)兔血前处理；(2)滤出液脱盐；(3)兔血球蛋白的分离；(4)层析；(5)超滤。该方法操作简单，提取的球蛋白纯度高，所得兔血中球蛋白的纯度为98%。
【专利说明】兔血中球蛋白的纯化制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物蛋白【技术领域】，具体涉及兔血中球蛋白的纯化制备方法。
【背景技术】
[0002]兔血含有很高的营养价值，可加工成多种产品，供食用、药用，或作为畜禽的动物性饲料。兔血可提取多种生物药物和生化试剂，如医用血清、血清抗原、凝血酶、亮氨酸、蛋白胨等，兔血医用价值高，但目前兔血提取技术仅限于实验室应用，无法达到纯化提取，且不能产业化提取和生产，对兔血的应用存在一定的局限性。球蛋白可有效提高人或机体的免疫力，具有极高的医学应用价值，现在主要是硫酸铵沉淀法，然后反透析提取，提取率及纯度都不高，本发明应用DEAE柱层析系统，提高了兔血球蛋白提取的纯度与产率。
【发明内容】
[0003]为了克服现有技术存在的技术缺陷，本发明提供一种兔血中球蛋白的纯化制备方法，该方法操作简单，提取的球蛋白纯度高。
[0004]兔血中球蛋白的纯化制备方法，主要包括如下工艺步骤:
(1)兔血前处理
a.将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠(柠檬酸钠)溶液中，并搅匀；
b.连续流离心机离心，离心力约为400g，离心上清为血浆，沉淀物为血球等细胞，收集上清；
c.将收集的上清通过深层滤器，收集滤出液；
(2)滤出液脱盐
采用G25脱盐层析，将20L的滤出液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，当紫外检测器检测到蛋白流出时，切换至收集管路，直至紫外检测器信号值为其峰值的1/10，切换至废液，直至紫外检测器信号为平，重复上样；
(3)兔血球蛋白的分离
a.冷沉淀:将G25脱盐柱的收集液置于4°C的环境中过夜，其会析出大量的沉淀物，该沉淀物即为兔凝血酶原和其他蛋白质的混合物；
b.离心:将冷沉淀的溶液在4°C的条件下，离心约30min，收集上清液；
(4)层析
a.将步骤(3)中收集的上清液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，收集穿透液。
[0005]所述层析柱为450*200，填料为DEAE 6FF，装填高度为15cm，约需要22L填料，Buffer A:15mM HAc-NaAc, pH 为 5.2 ；Buffer B:25mM NaAc，pH 为 4.5。
[0006]b.将a中收集的穿透液用稀NaOH调节pH至7.0，通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，收集二次穿透液。
[0007]所述层析柱为450*200，填料为DEAE 6FF，装填高度为15cm，约需要22L填料，Buffer A:15mM PB, pH 为 7.0 ；Buffer B=Buffer A +500mM NaCl
(5)超滤
将进液口放入兔血球蛋白洗脱液中，待兔血球蛋白洗脱液体积约为之前的1/10时，关闭超滤系统，并尽量将进液管路和回流管路中的兔血球蛋白洗脱液收集。
[0008]将膜包用0.1M NaOH冲洗30min后用水冲洗直至pH约为7，将膜包取出，置于保存液中。
[0009]通过本发明工艺步骤所得兔血中球蛋白的纯度为98%。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例，对本发明进行详细的描述。
[0011]兔血中球蛋白的纯化制备方法，主要包括如下工艺步骤:
(1)兔血前处理
a.将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠(柠檬酸钠)溶液中，并搅匀；
b.连续流离心机离心，离心力约为400g，离心上清为血浆，沉淀物为血球等细胞，收集上清；
c.将收集的上清通过深层滤器，收集滤出液；
(2)滤出液脱盐
采用G25脱盐层析，将20L的滤出液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，当紫外检测器检测到蛋白流出时，切换至收集管路，直至紫外检测器信号值为其峰值的1/10，切换至废液，直至紫外检测器信号为平，重复上样；
(3)兔血球蛋白的分离
a.冷沉淀:将G25脱盐柱的收集液置于4°C的环境中过夜，其会析出大量的沉淀物，该沉淀物即为兔凝血酶原和其他蛋白质的混合物；
b.离心:将冷沉淀的溶液在4°C的条件下，离心约30min，收集上清液；
(4)层析
a.将步骤(3)中收集的上清液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，收集穿透液。
[0012]所述层析柱为450*200，填料为DEAE 6FF，装填高度为15cm，约需要22L填料。Buffer A:15mM HAc-NaAc, pH 为 5.2 ；Buffer B:25mM NaAc，pH 为 4.5。
[0013]b.将a中收集的穿透液用稀NaOH调节pH至7.0，通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，收集二次穿透液。
[0014]所述层析柱为450*200，填料为DEAE 6FF，装填高度为15cm，约需要22L填料。Buffer A:15mM PB, pH 为 7.0 ；Buffer B=Buffer A +500mM NaCl
(5)超滤
将进液口放入兔血球蛋白洗脱液中，待兔血球蛋白洗脱液体积约为之前的1/10时，关闭超滤系统，并尽量将进液管路和回流管路中的兔血球蛋白洗脱液收集。
[0015]将膜包用0.1M NaOH冲洗30min后用水冲洗直至pH约为7，将膜包取出，置于保存液中。
[0016]此外，本发明并不局限于上述实施方式，基于相同手段所达到的技术效果，都属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.兔血中球蛋白的纯化制备方法，其特征在于:主要包括如下工艺步骤: (I)兔血前处理 a.将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠(柠檬酸钠)溶液中，并搅匀； b.连续流离心机离心，离心力约为400g，离心上清为血浆，沉淀物为血球等细胞，收集上清； c.将收集的上清通过深层滤器，收集滤出液； (2)滤出液脱盐 采用G25脱盐层析，将20L的滤出液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，当紫外检测器检测到蛋白流出时，切换至收集管路，直至紫外检测器信号值为其峰值的1/10，切换至废液，直至紫外检测器信号为平，重复上样； (3)兔血球蛋白的分离 a.冷沉淀:将G25脱盐柱的收集液置于4°C的环境中过夜，其会析出大量的沉淀物，该沉淀物即为兔凝血酶原和其他蛋白质的混合物； b.离心:将冷沉淀的溶液在4°C的条件下，离心约30min，收集上清液； (4)层析 a.将步骤(3)中收集的上清液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，收集穿透液； 所述层析柱为450*200，填料为DEAE 6FF，装填高度为15cm，约需要22L填料，BufferA:15mM HAc-NaAc, pH 为 5.2 ；Buffer B:25mM NaAc，pH 为 4.5 ; b.将a中收集的穿透液用稀NaOH调节pH至7.0，通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，收集二次穿透液； 所述层析柱为450*200，填料为DEAE 6FF，装填高度为15cm，约需要22L填料，BufferA:15mM PB, pH 为 7.0 ；Buffer B =Buffer A +500mM NaCl (5)超滤 将进液口放入兔血球蛋白洗脱液中，待兔血球蛋白洗脱液体积约为之前的1/10时，关闭超滤系统，并尽量将进液管路和回流管路中的兔血球蛋白洗脱液收集； 将膜包用0.1M NaOH冲洗30min后用水冲洗直至pH约为7，将膜包取出，置于保存液中。
【文档编号】C07K14/47GK104231065SQ201410454655
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】葛安山, 刘晓明, 荆荣燕 申请人:青岛康大食品有限公司, 青岛中创生物科技有限公司