专利名称：一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白e2的方法
技术领域：
本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2的方法。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)是经血液传播的急、慢性肝炎的主要致病因子之一，目前全球HCV感染者约有1.7亿，60％以上的HCV感染会发展为慢性感染。HCV慢性感染与肝硬化、肝细胞癌具有高度相关性，并且还与淋巴瘤、冷球蛋白血症等密切相关。虽然目前已经建立了且已商品化的HCV感染诊断方法，但应用最广泛的血清学诊断方法，即酶联免疫吸附试验(ELISA)方法还有一定的漏检率，需要增加一些有诊断意义的病毒抗原。此外，目前还没有研制成功一种疫苗能有效预防HCV感染。
HCV包膜蛋白包括E1和E2两种，其中E2介导HCV与靶细胞的结合，是涉及HCV感染性的最关键蛋白。有报道，在ELISA诊断试剂中加入E2合成肽能提高检测的敏感性，减少漏检，因此，有必要将该蛋白参入目前的基于HCV核心蛋白和非结构蛋白的ELISA检测中。由于E2蛋白在HCV与靶细胞结合中的关键作用，因此，该蛋白可作为HCV疫苗的重要候选抗原。但是，只有哺乳动物细胞表达的具有高度糖基化以及天然空间构型的E2蛋白才具有与靶细胞结合的生物学功能以及天然的抗原性，而E2蛋白属于低表达蛋白，用基因重组的方法获得哺乳动物细胞表达的该蛋白具有相当技术难度。这也是目前在ELISA方法中未引入E2蛋白的主要原因，也是妨碍HCV疫苗研究的重要原因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法。
本发明提供了一种能用哺乳动物细胞高水平分泌表达HCV包膜E2蛋白的技术方法，首先构建了一种新型的哺乳动物细胞表达质粒载体，该质粒载体利用强的真核启动子高水平调控HCV包膜E2基因的表达，而借助于内含子的剪切功能控制筛选用的标记基因(谷氨酰氨合成酶基因，GS)仅低水平表达。将该表达质粒转染哺乳动物细胞，以甲硫酰硫酸胺(MSX)筛选稳定转染的细胞克隆，因MSX为GS的高效抑制剂，故只有染色体中高拷贝整合质粒编码基因的细胞才能存活，而存活的细胞能高水平表达质粒编码的目的基因--HCV包膜E2基因。本发明中用目前最广泛用于哺乳动物细胞基因重组蛋白工程的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为宿主细胞，以该质粒转染CHO-K1细胞，构建成功稳定高水平分泌表达HCV包膜E2蛋白的细胞株，并建立了该细胞株的无血清悬浮培养方法，因培养液中不含有牛血清等蛋白成分，从而能以简单的层析方法从培养液中纯化得到重组HCV包膜E2蛋白。
本发明的具体内容如下1.HCV包膜E2蛋白胞外段基因的扩增根据1b基因型HCV包膜E2蛋白编码基因的核苷酸序列设计、合成引物，以聚合酶链反应(PCR)扩增HCV包膜E2蛋白胞外段基因，插入T克隆载体，对E2胞外段基因进行DNA测序。
2.谷氨酰胺合成酶基因的克隆根据谷氨酰胺合成酶(GS)基因的序列，设计合成引物，以逆转录(RT)PCR从中国仓鼠卵巢细胞(CHO)克隆GS基因，插入T克隆载体，对GS基因进行DNA测序。
3.基于内含子剪切载体的构建将GS基因插入真核表达质粒载体pCI-neo(美国Promega产品)的内含子基因的剪切供体(SD)与剪切受体(SA)位点之间，而将HCV包膜E2蛋白基因置于GS基因内含子之3′端。
4.表达质粒转染CHO细胞用脂质体将质粒转染CHO细胞，检测HCV包膜E2蛋白的表达。
5.稳定表达HCV包膜E2蛋白的CHO细胞株的构建以低浓度的GS抑制剂--甲硫酰硫酸胺(MSX)筛选稳定转染的CHO-K1细胞克隆，再以浓度递增的MSX加压筛选高水平表达HCV包膜E2蛋白的CHO-K1细胞，然后逐渐以无血清培养液替代含小牛血清的培养液，使细胞完全适应于无血清培养生长。
6.重组HCV包膜E2蛋白的抗原性鉴定用单抗和多抗鉴定从细胞培养上清中的HCV包膜E2蛋白的抗原性。
本发明能批量制备具有HCV包膜蛋白天然生物学功能以及抗原性的重组HCV包膜E2蛋白，为HCV感染的血清学检测试剂以及HCV疫苗的开发奠定了基础，并可以为HCV分子病毒学研究提供重要材料。
图1pCIDA-GS-E2-neo质粒的结构图2Western blot分析胞浆内和分泌至培养上清中的E2蛋白(用羊抗E2多抗检测)其中1，2pCIDA-GS-E2-neo转染的CHO-K1细胞裂解液3pCIDA-GS-E2-neo转染的CHO-K1细胞培养上清4pCIDA-GS-neo转染的CHO-K1细胞裂解液图3dot blot培养上清中的E2蛋白(用E2单抗检测)其中1，2pCIDA-GS-neo转染的CHO-K1细胞培养上清3，4pCIDA-GS-E2-neo转染的CHO-K1细胞培养上清图4分泌表达的HCV包膜E2蛋白的SDS-PAGE分析
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例11.HCV包膜E2蛋白胞外段基因的扩增根据1b基因型HCV包膜E2蛋白编码基因的核苷酸序列设计、合成引物，以聚合酶链反应(PCR)扩增HCV包膜E2蛋白胞外段基因。为了使表达产物便于纯化，在E2胞外段基因的3′末端引入了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列。PCR扩增的模板质粒pGEM-HCJ4含有1b型HCV基因全序列，为美国国立卫生研究院Yanagi M博士构建、提供(参见Virology.1998；244(1)161-72)。DNA扩增用试剂为美国Promega产品。
引物序列(下游引物E2R含SalI酶切位点)E2F5′-GAGACCCACACGACGGGGAG-3′E2R5′-GTCGACAACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCTGACCTATCCCTGTCC-3′在0.5毫升离心管建立以下反应体系质粒pGEM-HCJ4 10ng10×Pfu聚合酶反应缓冲液 5μl引物E2F(5mM)2μl引物E2R(5mM)2μldNTP(10mM) 1μlPfu聚合酶(3U/μl) 0.5μl补充双蒸灭菌水至总反应体积50μl，用MJ PTC-100型PCR仪进行热循环反应94℃变性2分钟，94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸1分钟20秒，共进行30个循环，然后72℃延伸5分钟，温度降至4℃结束反应。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收。
2.E2基因与人免疫球蛋白信号肽基因的拼接为了使重组HCV包膜E2蛋白能分泌表达，在该基因的5′末端引入人免疫球蛋白信号肽基因。
合成引物(上游引物ISF含NheI酶切位点)ISF5′-GCTAGCGCCACCATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCC-3′ISR5′-CTCCCCGTCGTGTGGGTCTCGGCGTCGCCGGTGCTGCCGGGCACCCACAGCAGCAGC-3′在0.5毫升离心管建立以下反应体系10×Taqase反应缓冲液5μl引物ISF(5mM)2μl引物ISR(5mM)2μldNTP(10mM) 1μlTaqase聚合酶(5U/μl)0.2μl补充双蒸灭菌水至总反应体积50μl，用MJ PTC-100型PCR仪进行热循环反应94℃变性2分钟，94℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，然后72℃延伸5分钟，温度降至4℃结束反应。
再进行拼接反应在0.5毫升离心管建立以下反应体系E2胞外段基因回收产物2μl人免疫球蛋白信号肽基因反应产物 5μl10×Pfu聚合酶反应缓冲液 5μl引物ISF(5mM)2μl引物E2R(5mM)2μldNTP(10mM) 1μlPfu聚合酶(3U/μl) 0.5μl补充双蒸灭菌水至总反应体积50μl，用MJ PTC-100型PCR仪进行热循环反应94℃变性2分钟，94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸1分钟20秒，共进行30个循环，然后72℃延伸5分钟，温度降至4℃结束反应。然后向反应管中加入Taqase 0.5U，72℃反应20分钟。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收，与T载体pMD18T连接，连接反应体系如下在0.5毫升离心管建立以下反应体系回收的E2融合基因6.5μl5×T4 DNA连接酶缓冲液 2μlT载体pMD18T 0.5μlT4DNA连接酶(2U/μl) 1μl混匀，置于16℃水浴16小时，取5μl转化感受态大肠杆菌DH5α，得到的氨苄青霉素抗性菌落接种于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB培养液，振荡培养过夜，再提取重组质粒进行酶切鉴定，命名为pMD-E2，其中的人免疫球蛋白信号肽与HCV包膜蛋白E2融合基因的序列如SEQID NO1所示。
3.CHO细胞GS基因的克隆用含有5％新生牛血清的DMEM培养液传代培养CHO-K1细胞(购自美国ATCC)，细胞达到80％汇合时，用Trizol Reagent(美国Gibco产品)抽提细胞总RNA，操作参照使用说明进行。得到的细胞总RNA溶解于DEPC处理的灭菌重蒸水。
逆转录反应(RT)逆转录反应试剂为美国Promega产品。
取RNA 2μl(约5μg)，置于一只50μl离心管内，再依次加入以下各组分5×AMV逆转录反应缓冲液 5μldNTP(10mM) 1μloligo(dT)15(5pmol/μl) 1μl于70℃热水浴5分钟，再迅速置于冰水浴，加入以下组分RNA酶抑制剂(30U/μl) 2μlAMV逆转录酶(5U/μl)1μl加DEPC处理的灭菌重蒸水至终体积25μl。
混匀，于42℃水浴40分钟，再95℃5分钟灭活逆转录酶，立即进行PCR扩增GS基因。
根据GS基因的序列设计、合成引物(上下游引物GSF、GSR中分别引入ApaI和SacII酶切位点)GSF5′-GGGCCCATGGCCACCTCAGCAAGTTCC-3′GSR5′-CCGCGGTTAGTTTTTGTATTGGAAGGGCTCGTCGCC-3′以RT产物为模板扩增GS基因，扩增产物插入T载体pMD18T，得到重组质粒命名为pMD-GS，再对GS基因进行DNA测序，操作方法同前。测序所得的GS基因序列与Genbank accession X03495一致。
4.基于内含子筛选标记的表达载体的构建以真核表达载体pCI-neo(美国Promega产品)为基本框架，将GS基因插入内含子基因中，因内含子基因在转录以后从mRNA链上被剪切，其中的编码序列由于在5′端缺少帽状结构和3′端缺少多聚腺苷序列而仅能低水平表达，因此将筛选标记基因插入内含子中能提高筛选得到的细胞克隆的阳性表达率。
根据pCI-neo载体中的CMV巨细胞病毒启动子/增强子以及嵌合内含子的序列合成引物inDF5′-GAGCTCGTTTAGTGAACCG-3′(含Sac I酶切位点)inDR5′-GGGCCCTCTGTCTCGACAAGCCCAG-3′(含ApaI酶切位点)inAF5′-GGGCCCATACCGCGGAAGACTCTTGCGTTTCTG-3′(含ApaI、SacII酶切位点)inAR5′-GTCGACCTATAGTGAGTCGT-3′(含NheI酶切位点)
以质粒pCI-neo为模板，以引物inDF、inDR扩增内含子剪切供体位点片段，以引物inAF、inAR扩增内含子剪切受体位点片段。分别将内含子剪切供体位点片段和受体位点片段插入T载体pMD18T，得到重组质粒命名为pMD-inD、pMD-inA，再进行DNA测序，操作方法同前。
以SacI、ApaI酶切质粒pMD-inA，回收切出的内含子剪切供体位点片段inD；以ApaI、NheI酶切质粒pMD-inA，回收切出的内含子剪切供体位点片段inA。
以SacI、NheI酶切质粒pCI-neo，切除质粒中的内含子基因，回收载体大片段，将载体大片段与inD、inA片段连接，得到的重组质粒命名为pCIDA-neo，该载体的特点在于，内含子中引入了两个酶切位点ApaI和SacII，可以插入筛选标记基因。
将质粒pMD-GS以ApaI和SacII酶切，切出的GS基因插入pCIDA-neo中，得到重组质粒pCIDA-GS-neo。其特点在于GS基因插入在内含子之中。
5.HCV包膜E2基因表达载体的构建质粒pMD-E2以NheI和SalI酶切，回收切出的HCV包膜E2基因，将该基因插入经过NheI和SalI酶切的线性化载体pCIDA-GS-neo，即得到E2表达载体pCIDA-GS-E2-neo，其表达调控结构如图1所示PCMV为巨细胞病毒启动子，introD为内含子供体序列，GS为谷氨酰氨合成酶基因，introA为内含子受体序列，Sig为人免疫球蛋白信号肽，E2为HCV包膜E2基因，polyA为SV40病毒多聚腺苷酸序列。
6.HCV包膜E2蛋白在CHO细胞中的表达用含有5％新生牛血清的DMEM培养液传代培养CHO-K1细胞，细胞80％融合时，以0.25％胰蛋白酶消化细胞，细胞传代接种于35mm细胞培养皿，次日将2μg质粒pCIDA-GS-E2-neo及对照质粒pCIDA-GS-neo分别与10μl脂质体转染试剂Lipofectamine(美国Invitrogen产品)混匀，转染CHO-K1细胞，操作按照使用说明进行。将细胞培养皿置于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中，12小时后加1ml含20％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养48小时。然后冻融裂解细胞，细胞裂解液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，再进行western blot检测，E2抗体为山羊抗HCV包膜E2蛋白多抗(美国Biodesign产品)，酶标抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗山羊IgG(华美生物工程有限公司产品)。同时将培养上清进行浓缩，浓缩液进行western blot检测。操作均参照《分子克隆实验指南第二版》(科学出版社，1995)进行。结果如图2，可见细胞裂解液中存在各种不同分子量形式的E2蛋白，最高分子量的蛋白为完全糖基化E2，而其余为部分糖基化E2，其中分泌至培养上清中的主要为完全糖基化的E2。细胞培养上清用抗E2单克隆抗体(美国Biodesign产品)进行dot blot检测，如图3所示，也能检测到分泌至培养上清中E2蛋白。
7.稳定表达HCV包膜E2蛋白的CHO-K1细胞株的构建将质粒pCIDA-GS-E2-neo转染于接种24孔板中的CHO-K1细胞，48小时后，将细胞以0.25％胰蛋白酶消化，接种于5个100mm细胞培养皿，用含有10％透析的胎牛血清的GMEM-S培养液(JRH产品)培养，加甲硫酰硫酸胺(MSX)(Sigma产品)至终浓度25μmol/L，3-4天后细胞开始死亡，两周后培养皿形成由单个细胞增殖而形成的集落(克隆)，挑选单个克隆，接种于24孔板，继续用25μmol/L MSX的GMEM-S培养液培养，一周后培养上清用dot blot法检测E2蛋白的表达，对表达水平最高的克隆以胰蛋白酶消化，以105个细胞/孔接种96孔板，用浓度递增的MSX(100-1000μmol/L)加压培养，2周后，对生长良好的细胞检测其培养上清中E2的表达。表达量最高者再进行有限稀释，接种于96孔板，对单个细胞克隆进行表达水平分析，得到的最高表达克隆作为待用的细胞株，命名为CR9。
8.无血清培养用无血清培养基(JRH产品)逐渐替代GMEM-S培养基，使CR9细胞逐渐适应完全无血清培养基而从贴壁转为悬浮生长。将悬浮细胞改用摇瓶培养，培养体积150毫升。由于无血清培养液中除了细胞分泌表达E2外，其他蛋白含量(来源于少数死亡的细胞)极低，因而极大方便了蛋白纯化，培养上清离心、超滤以后，用镍离子金属鳌合层析的方法进行初步纯化(试剂采用Qiagen产品)，每一百毫升培养液中可得到E2蛋白25毫克。图4为不同批次纯化蛋白的SDS-PAGE分析。
SEQUENCE LISTING<110>中国人民解放军第二军医大学<120>一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法<130>说明书，权利要求书<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>921<212>DNA<213>人工序列<400>1atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg cagcaccggc60gacgccgaga cccacacgac ggggagggtg gccggccaca ccacctccgg gttcacgtcc120cttttctcat ctggggcgtc tcagaaaatc cagcttgtga ataccaacgg cagctggcac180atcaacagga ctgccctaaa ttgcaatgac tccctccaaa ctgggttctt tgccgcgctg240ttttacgcac acaagttcaa ctcgtccggg tgcccggagc gcatggccag ctgccgcccc300attgactggt tcgcccaggg gtggggcccc atcacctata ctaagcctaa cagctcggat360cagaggcctt attgctggca ttacgcgcct cgaccgtgtg gtgtcgtacc cgcgtcgcag420
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1.一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，其特征在于该方法构建了一种新型的哺乳动物细胞表达质粒，该表达质粒高水平表达作为目标基因的丙型肝炎病毒包膜蛋白E2，而低水平表达作为筛选标记的谷氨酰氨合成酶。
2.根据权利要求1所述的一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，其特征在于其中的表达质粒是将谷氨酰氨合成酶基因插入真核表达质粒载体pCI-neo的内含子基因的剪切供体与剪切受体位点之间，将丙型肝炎病毒包膜蛋白E2基因置于谷氨酰氨合成酶基因内含子之3′端。
3.根据权利要求2所述的一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，其特征在于表达质粒中的丙型肝炎病毒包膜蛋白E2与人免疫球蛋白信号肽的融合基因的序列如SEQ ID NO1所示。
4.根据权利要求1或2所述的一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，其特征在于将其中的表达质粒转染哺乳动物细胞后，以甲硫酰硫酸胺筛选稳定转染的细胞克隆。
5.根据权利要求4所述的一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，其特征在于将其中的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
6.权利要求1或2所述的一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法在构建稳定的高水平分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的工程细胞株中的应用。
7.权利要求1或2所述的一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法在诊断丙型肝炎病毒感染疾病中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法在用酶联免疫吸附试验诊断丙型肝炎病毒感染疾病中的应用。
9.权利要求1或2所述的一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法在治疗丙型肝炎病毒感染疾病中的应用。
10.权利要求1所述的一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法在丙型肝炎病毒疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医药工程技术领域，全球HCV感染者约有1.7亿，70％以上的HCV感染会发展为慢性感染，HCV包膜蛋白E2介导HCV与靶细胞的结合，是涉及HCV感染性的最关键蛋白，而E2蛋白属于低表达蛋白，用基因重组方法获得哺乳动物细胞表达的该蛋白相当困难。本发明的目的在于提供一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，该方法构建了一种新型的哺乳动物细胞表达质粒，该表达质粒高水平表达目标基因E2蛋白，而低水平表达筛选标记谷氨酰氨合成酶。本发明能批量制备具有HCV包膜蛋白天然生物学功能以及抗原性的重组HCV包膜E2蛋白，为HCV感染的血清学检测试剂以及HCV疫苗的开发奠定了基础，并可以为HCV分子病毒学研究提供重要材料。
文档编号A61K38/16GK1821411SQ20061002420
公开日2006年8月23日 申请日期2006年2月28日 优先权日2006年2月28日
发明者赵平, 廖小玲, 曹洁, 戚中田 申请人:中国人民解放军第二军医大学