专利名称：从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及卵巨球蛋白的提取方法，具体为一种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法。
背景技术：
鸡蛋清来源广泛，价格低廉，干物质中蛋白质含量超过80%，是最理想的蛋白质资源之一。卵巨球蛋白是鸡蛋清中一种具有重要生物活性的蛋白质，其含量仅为蛋清蛋白质的0.5%，因其具有抑制蛋白酶的生物活性，表现出抗炎、促进伤口愈合、抑制败血症等功能活性，在医学等领域应用前景广阔。但是由于卵巨球蛋白在鸡蛋清中含量低，且不恰当的制备方法将使其丧失活性，因此如何纯化获得纯蛋白成为其研究的难题之一。目前，卵巨球蛋白的分离纯化均通过多步层析的方法获得，步骤繁多、耗时漫长，且多种填料的使用大大增加了生产成本。此外，在分离过程中，每一步骤的操作都将不可避免地导致目标蛋白不同程度的损失，由于操作步骤繁多，导致产品得率很低，仅为20%左右。因此，开发出一种操作简单、纯化周期短、得率高的卵巨球蛋白分离纯化方法，将具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述缺陷，提供一种简单、快速和高效的从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法。上述目的是通过以下技术方案实现的:一种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤:( 1)鸡蛋清溶液的制备采用新鲜鸡蛋，将蛋清和蛋黄分开，收集鸡蛋清，边搅拌边向鸡蛋清中缓缓加入0.6 3倍体积的蒸馏水，加入完成后，继续搅拌2 3h，得鸡蛋清溶液；(2)聚乙二醇分离准确称取上述鸡蛋清溶液，按质量加入3 5%的聚乙二醇8000，搅拌2 3h，然后在8000 12000转/分的转速下离心8 15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度达到8 10%，搅拌2 3h，然后在8000 12000转/分的转速下离心8 15min，收集沉淀；(3)沉淀溶解与处理将所得沉淀置于含有0.3 0.5M氯化钠的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的体积是步骤(I)中的鸡蛋清体积的1/8 1/5，搅拌使沉淀溶解，再离心除去少量不溶物，取上清液待下一步纯化；(4)凝胶过滤层析纯化使用S印hacryl S-200HR作为凝胶过滤层析填料，装填后用PBS缓冲液对层析柱进行平衡，将第3步获得的上清液注入到层析柱中，用PBS缓冲液进行洗脱，收集第一个层析峰，即得卵巨球蛋白。优选地，步骤(I)中所述蒸馏水的加入量是鸡蛋清体积的I倍。优选地，步骤(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是鸡蛋清溶液质量的3.2
4.4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度为8.4 9.2%。进一步优选地，步骤(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是鸡蛋清溶液质量的4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度为8.8%。优选地,步骤(4)中的洗脱流速为0.5 0.8mL/min。进一步优选地,步骤(4)中的洗脱流速为0.65 0.75mL/min。本发明的有益效果在于:(I)根据鸡蛋清蛋白质的特点设计卵巨球蛋白的提取方案:首先根据卵黏蛋白溶解度差的特点，采用聚乙二醇沉淀法将其除去，再利用卵巨球蛋白与其它蛋清蛋白质分子量上的巨大差异采用凝胶过滤层析将其纯化。过程中仅使用了一步层析，大大简化了操作，同时也降低了购买层析填料的成本。(2)整个方法过程仅需10 12小时即可完成，与现有方法2 3天的周期相比，大大缩短了时间，提高了效率，降低了人工和时间成本。(3)所得卵巨球蛋白样品纯度达到95.98%，在保持高纯度的同时，回收率也大幅提高，回收率从现有方法的约20%提高至61.4%，充分利用了蛋清蛋白质资源。
图1为卵巨球蛋白分离纯化流程图；图2为凝胶过滤层析图谱；图3为卵巨球蛋白SDS-PAGE电泳图；图4为卵巨球蛋白高相液相色谱图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细地说明。实施例1一种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤:(I)鸡蛋清溶液的制备取当天产出的新鲜鸡蛋，人工打蛋，使用分离器将蛋清和蛋黄分开，收集鸡蛋清，边磁力搅拌边向鸡蛋清中缓缓加入等体积的纯水，加入完成后，继续磁力搅拌3h，得鸡蛋清溶液。(2)聚乙二醇分离准确称取上述鸡蛋清溶液，按质量加入4%的聚乙二醇8000，充分搅拌3h，然后在10000转/分的转速下离心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度达到8.8%，如前再次搅拌、离心，收集沉淀。(3)沉淀溶解与处理将所得沉淀置于含有0.4M氯化钠的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的体积是步骤(I)中的鸡蛋清体积的1/7，搅拌使沉淀溶解，再离心除去少量不溶物，取上清液待进一步纯化。
(4)凝胶过滤层析纯化使用Sephacryl S-200HR作为凝胶过滤层析填料,层析柱(16 X 600mm)装填后使用PBS缓冲液对层析柱进行平衡。取步骤(3)中获得的上清液3mL注入到层析柱中，使用PBS缓冲液以0.65 0.75mL/min的流速进行洗脱，层析图谱如图2所示，收集第一个层析峰，即得卵巨球蛋白。实施例2一种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤:(I)鸡蛋清溶液的制备取新鲜鸡蛋，将蛋清和蛋黄分开，收集鸡蛋清，边搅拌边向鸡蛋清中缓缓加入0.6倍体积的蒸馏水，加入完成后， 继续搅拌2h，得鸡蛋清溶液；(2)聚乙二醇分离称取上述鸡蛋清溶液，按质量加入3%的聚乙二醇8000，搅拌2h，然后在12000转/分的转速下离心8min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度达到8%，搅拌2h，然后在12000转/分的转速下离心8min，收集沉淀；(3)沉淀溶解与处理将所得沉淀置于含有0.3M氯化钠的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的体积是步骤(I)中的鸡蛋清体积的1/8，搅拌使沉淀溶解，再离心除去少量不溶物，取上清液待下一步纯化；(4)凝胶过滤层析纯化使用S印hacryl S-200HR作为凝胶过滤层析填料，装填后用PBS缓冲液对层析柱进行平衡，将步骤(3)中获得的上清液注入到层析柱中，用PBS缓冲液以0.5 0.8mL/min的流速进行洗脱，收集第一个层析峰，即得卵巨球蛋白。实施例3一种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤:( I)鸡蛋清溶液的制备取新鲜鸡蛋，将蛋清和蛋黄分开，收集鸡蛋清，边搅拌边向鸡蛋清中缓缓加入3倍体积的蒸馏水，加入完成后，继续搅拌2h，得鸡蛋清溶液；(2)聚乙二醇分离称取上述鸡蛋清溶液，按质量加入5%的聚乙二醇8000，搅拌2h，然后在8000转/分的转速下离心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度达到10%，搅拌2h，然后在8000转/分的转速下离心15min，收集沉淀；(3)沉淀溶解与处理将所得沉淀置于含有0.5M氯化钠的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的体积是步骤(I)中的鸡蛋清体积的1/5，搅拌使沉淀溶解，再离心除去少量不溶物，取上清液待下一步纯化；(4)凝胶过滤层析纯化使用S印hacryl S-200HR作为凝胶过滤层析填料，装填后用PBS缓冲液对层析柱进行平衡，将步骤(3)中获得的上清液注入到层析柱中，用PBS缓冲液进行洗脱，收集第一个层析峰，即得卵巨球蛋白。
实施例4一种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤:(I)鸡蛋清溶液的制备取新鲜鸡蛋，将蛋清和蛋黄分开，收集鸡蛋清，边搅拌边向鸡蛋清中缓缓加入2倍体积的蒸馏水，加入完成后，继续搅拌2.5h，得鸡蛋清溶液；(2)聚乙二醇分离称取上述鸡蛋清溶液，按质量加入3.2%的聚乙二醇8000，搅拌2.5h，然后在8000转/分的转速下离心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度达到8.4%，搅拌2.5h，然后在12000转/分的转速下离心8min，收集沉淀；(3)沉淀溶解与处理将所得沉淀置于含有0.5M氯化钠的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的体积是步骤(I)中的鸡蛋清体积的1/6，搅拌使沉淀溶解，再离心除去少量不溶物，取上清液待下一步纯化；(4)凝胶过滤层析纯化使用S印hacryl S-200HR作为凝胶过滤层析填料，装填后用PBS缓冲液对层析柱进行平衡，将步骤(3)中获得的上清液注入到层析柱中，用PBS缓冲液进行洗脱，收集第一个层析峰，即得卵巨球蛋白。实施例5—种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤:(I)鸡蛋清溶液的制备取新鲜鸡蛋，将蛋清和蛋黄分开，收集鸡蛋清，边搅拌边向鸡蛋清中缓缓加入I倍体积的蒸馏水，加入完成后，继续搅拌2.5h，得鸡蛋清溶液；(2)聚乙二醇分离称取上述鸡蛋清溶液，按质量加入4.4%的聚乙二醇8000，搅拌2h，然后在12000转/分的转速下离心15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度达到9.2%，搅拌3h，然后在8000转/分的转速下离心8min，收
集沉淀；(3)沉淀溶解与处理将所得沉淀置于含有0.3M氯化钠的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的体积是步骤(I)中的鸡蛋清体积的1/6，搅拌使沉淀溶解，再离心除去少量不溶物，取上清液待下一步纯化；(4)凝胶过滤层析纯化使用S印hacryl S-200HR作为凝胶过滤层析填料，装填后用PBS缓冲液对层析柱进行平衡，将步骤(3)中获得的上清液注入到层析柱中，用PBS缓冲液进行洗脱，收集第一个层析峰，即得卵巨球蛋白。实施例6方法鉴定
( I)聚丙酰胺凝胶电泳鉴定取层析获得的卵巨球蛋白样品溶液80微升，加入20微升的蛋白上样缓冲液(5倍浓度)，混匀后沸水浴加热约5分钟，冷却后取5微升进行常规SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为8%,恒定电压100V。电泳结果如图3所示(泳道I为蛋白质标准分子量标记，2 4为卵巨球蛋白)，样品在凝胶上显示为单一条带，说明其纯度较高，使用软件计算其分子量，约为175kDa，与文献报道一致。(2)纯度测定采用高相液相色谱法测定，使用G2000SWXl分子排阻色谱柱(7.8x300mm)进行分析，液相系统为Waters2695，检测波长为280nm，流动相为磷酸盐缓冲液(0.lmol/L, pH7.0，含0.lmol/L Na2SO4),流速为0.8ml/min。层析图谱如图4所示，由软件对峰面积进行积分，根据峰面积对样品纯度进行定量，计算实施例1 5的纯度分别为96.32%,95.84%,96.01%、96.20%,95.55%，平均为 95.98%。(3)回收率计算根据从鸡蛋清中纯化所得卵巨球蛋白的质量、蛋白含量和纯度，使用以下公式计算所得的各个蛋白质的回收率。
权利要求
1.一种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)鸡蛋清溶液的制备 取新鲜鸡蛋，将蛋清和蛋黄分开，收集鸡蛋清，边搅拌边向鸡蛋清中缓缓加入0.6^3倍体积的蒸馏水，加入完成后，继续搅拌2 3h，得鸡蛋清溶液； (2)聚乙二醇分离 称取上述鸡蛋清溶液，按质量加入:Γ5%的聚乙二醇8000，搅拌2 3h，然后在8000^12000转/分的转速 下离心8 15min，收集上清液，再向上清液中加入聚乙二醇8000，使聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度达到8 10%，搅拌2 3h，然后在8000 12000转/分的转速下离心8 15min，收集沉淀； (3)沉淀溶解与处理 将所得沉淀置于含有0.3^0.5M氯化钠的PBS缓冲液中，PBS缓冲液的体积是步骤(I)中的鸡蛋清体积的1/8 1/5，搅拌使沉淀溶解，再离心除去少量不溶物，取上清液待下一步纯化； (4)凝胶过滤层析纯化 使用Sephacryl S-200 HR作为凝胶过滤层析填料，装填后用PBS缓冲液对层析柱进行平衡，将步骤(3)中获得的上清液注入到层析柱中，用PBS缓冲液进行洗脱，收集第一个层析峰，即得卵巨球蛋白。
2.如权利要求1所述的从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步骤(I)中所述蒸馏水的加入量是鸡蛋清体积的I倍。
3.如权利要求1或2所述的从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步骤(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是鸡蛋清溶液质量的3.2^4.4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度为8.4 9.2%。
4.如权利要求3所述的从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步骤(2)中第一次加入的聚乙二醇8000是鸡蛋清溶液质量的4%，第二次加入的聚乙二醇8000在上清液中的质量浓度为8.8%。
5.如权利要求1所述的从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步骤(4)中的洗脱流速为0.5^0.8mL/min。
6.如权利要求5所述的从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，其特征在于:步骤(4)中的洗脱流速为0.65 0.75mL/min。
全文摘要
本发明公开了一种从鸡蛋清中提取卵巨球蛋白的方法，该方法包括鸡蛋清溶液的制备、聚乙二醇分离、沉淀溶解与处理、凝胶过滤层析纯化四个步骤。本发明解决了卵巨球蛋白分离纯化操作复杂、周期长、得率低等问题，建立了一种简单、快速和高效的卵巨球蛋白提取方法，所得卵巨球蛋白纯度达到95.98%，在保持高纯度的同时，回收率大幅提高，达到61.4%，该方法整个过程仅需10~12小时即可完成，大大简化了操作，降低了成本，提高了效率。
文档编号C07K1/36GK103172724SQ20131007345
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者马美湖, 耿放, 黄茜 申请人:华中农业大学