一种铅-IgM螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种铅-IgM螯合物及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 血清中IgM是由5个单体通过一个J链和二硫键连接成五聚体，分子量最大，为 970kD，沉降系数为19S，称为巨球蛋白（macroglobulin)。在分子结构上IgM无铰链区，C y 2 可能替代了铰链区的功能。在生物进化过程中IgM是最早出现的免疫球蛋白。在个体发育 过程中，无论是B细胞膜表面Ig(Smlg)，还是合成分泌到血清中的Ig，IgM都是最早出现的 Ig，在胚胎发育晚期的胎儿即有能力产生IgM。在抗原刺激诱导体液免疫应答过程中，一般 IgM也最先产生。IgM占血清总Ig的5%~10%。由于IgM在免疫应答早期产生，并在补体 参与下的溶血作用比IgG强500倍以上，而且活化补体后通过C3b、C4b等片段发挥调理作 用，因此IgM在机体的早期免疫防护中占有重要地位。天然的血型抗体（凝集素）为IgM， 血型不符的输血，易发生严重的溶血反应。IgM不能过胎盘，脐血中如出现针对某种病原微 生物的IgM，表示胚胎期有相应病原微生物如梅毒螺旋体、风疹或巨细胞毒等感染，称为胚 胎感染或垂直感染。正常人血清中也含有产量单体IgM。
[0003] 铅在体内的含量超过一定水平就会对健康引起难以恢复的损害，它可以铅烟，铅 尘和各种氧化物形式被人体经呼吸道和消化道摄入体内，通过与钙离子的竞争作用，氧化 损伤，细胞凋亡等机制，引起以神经、消化、造血系统障碍为主的全身性、渐进性、持久性不 可逆性疾病，而且其危害还可能遗传到下一代。贫血是铅中毒的早期症状之一，铅可抑制血 红素合成过程中许多酶的活性。铅中毒可致血管痉挛、腹绞痛、视网膜小动脉痉挛和高血 压，时常导致细小动脉硬化。铅的肾损害常表现为间质性肾炎或萎缩性肾炎等病变，肾小管 重吸收功能下降是早期的症状。铅接触还可能影响生殖功能，接触铅的女性发生不孕症、流 产及死胎的机率增多，并可通过胎盘转移到胎儿身上。经口铅中毒者肝脏为主要受损器官 之一，可引起肝肿大呈现黄疸，甚至肝硬变或肝坏死，肝损害可能是肝内小动脉痉挛引起 局部缺血所致。铅引起卟啉代谢障碍、抑制含巯基酶，干扰植物神经。
[0004] 研究发现发铅测定误差大，齿铅、骨铅及组织铅取材不易，而尿铅主要反映铅排泄 情况。2006年中国《儿童高铅血症和铅中毒预防指南》规定，儿童血铅水平的筛查可以采用 末梢血或静脉血，但诊断必须采用静脉血。但影响机体免疫球蛋白的蛋白结合铅的含量从 未有过检测。
[0005] 综合以上，关于铅中毒，特别是慢性铅中毒的评价，仅能通过检测血铅含量，间接 反应人体内的循环铅含量，无法进一步评估铅对于机体功能的损伤程度，而随着科学技术 的飞速发展，铅与人体的关系也日益紧密，因而寻找一种可以从机体功能角度评价铅中毒， 特别是慢性铅中毒对于机体的损害程度的评价方式日益重要。
【发明内容】
[0006] 针对铅污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铅-IgM螯合物及其制备方 法，并建立铅-IgM螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测铅-IgM螯合物在评价一个 地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铅-IgM螯合物可以间接反映 这个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映这个地区铅污染程度。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种铅-IgM螯合物，铅离子与 IgM通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
[0008] 本发明还提供一种上述的铅-IgM螯合物的制备方法，包括以下步骤：
[0009] A)铅与IgM的螯合反应：在人源的IgM中加入铅离子进行螯合反应，得到反应溶 液；
[0010] B)纯化铅-IgM螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的 IgM以及多余的铅离子，即得铅-IgM螯合物。
[0011] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
[0012] (1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水，使铅-IgM螯合物 复溶；
[0013] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgM特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0014] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgM与 填料特异性结合；
[0015] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱；
[0016] (5)收集：收集经过步骤（4)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0017] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0018] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铅特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0019] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0020] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱；
[0021] (10)收集：收集经过步骤（9)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0022] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得铅-IgM螯合物。
[0023] 其中，上述铅-IgM螯合物的制备方法，还包括步骤C):对铅-IgM螯合物的鉴定；
[0024] 其中，步骤C)中具体如下：
[0025] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0026] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铅-IgM螯合物，加入稀释缓冲液，并混匀， 然后加样于样品槽中；
[0027] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0028] (4)检测：在胶床上找出含铅的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带复溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或ELISA法检测是否含有铅以及检测铅的含量。
[0029] 本发明还提供一种如上述的铅-IgM螯合物在制备检测人体内铅-IgM螯合物的试 剂或试剂盒中的应用。
[0030] 本发明还提供一种至少包括如上述的铅-IgM螯合物作为对照品的试剂盒。
[0031] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有可捕获IgM的蛋白或捕获金属 铅的物质。
[0032] 本发明还提供一种定量检测铅-IgM螯合物的方法，以已知含量的上述的铅-IgM 螯合物作为对照品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收 光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯铅-IgM螯合物与酶联免疫结 合法、提纯铅-IgM螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯铅-IgM螯合物与电感耦合等离子体 质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
[0033] 实施本发明的铅-IgM螯合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
[0034] 1.本发明首次体外合成铅-IgM螯合物；
[0035] 2.本发明首次提出铅-IgM螯合物可用于制备检测血样中铅-IgM螯合物的试剂或 试剂盒中的应用。
[0036] 3.本发明建立了铅-IgM螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测铅-IgM螯合 物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铅-IgM螯合物 可以间接反映这个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映这个地区铅污染程度。本发明 建立的铅-IgM螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提 尚。
【附图说明】
[0037]图1为本发明所述的铅-IgM螯合物的非变性电泳条带图；
[0038]图2为本发明所述的铅-IgM螯合物的同步辐射X线电泳条带的荧光分析图；
[0039] 其中，图1中，M为Marker，2为铅-IgM螯合物；图2中，横坐标为蛋白条带位置， 纵坐标为该蛋白条带中铅金属能量。
【具体实施方式】
[0040] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0041] 本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可以通过市购方式 获得：
[0042] 提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0043] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种；
[0044] 本发明中的所述能与IgM特异性结合的填料，为表面附有能捕获IgM的蛋白的硅 胶或树脂；
[0045] 本发明中的能捕获IgM的蛋白（抗IgM抗体），包括但不限于兔Anti-人类IgM H&L，其品牌为Abeam、型号为ab8505;
[0046] 本发明中的能与铅特异性结合的填料，为表面附有能捕获铅的物质的硅胶或树 脂；
[0047] 本发明中的能捕获铅的物质，包括但不限于鼠抗Pb mAb，购买自巴傲德生物技术 公司（BioWorld Inc)、货号为 AP7019;
[0048] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0049] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0050] 洗涤液为含有 KH2P04 0? 2mg/ml、Na2HP04 ? 12H20 2. 90mg/ml、NaCl 8. Omg/ml、KC1 0? 2mg/ml、0. 5% Tween-20 的 pH 为 7. 4 的 0? 15M PBS 溶液；
[0051] 封闭液为1% _5 %牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
[0052] 稀释缓冲液为含 1. 5mg/mL Na2C03、2. 93mg/ml NaHC03的 PH 为 9. 6 的 0? 05M 磷酸 盐缓冲液；
[0053] 酶标抗体为HRP酶标抗体；
[0054] 终止液为：将21. 7ml的2M H2S04定容至200ml的ddH 20中；
[0055] 洗脱液为含l_2mg/ml木瓜蛋白酶的PH为8.