专利名称：一种栉孔扇贝α2巨球蛋白基因及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种栉孔扇贝的α2巨球蛋白基因及其制备方法。
背景技术：
α2巨球蛋白(α2-macroglobulin，缩写为α2M)是动物血浆中的一种大分子糖蛋白，它的功能主要表现为清除组织中内源或外源性的蛋白酶，并通过调节内源或外源性蛋白酶的活性广泛地参与多种生理功能。出现炎症时，机体能诱导合成出丰富的α2巨球蛋白，它进入组织，与组织释放的过量的蛋白酶结合，并将后者清除，能防止组织被进一步破坏。α2M还可以通过抑制侵入机体的寄生虫和病原体释放的多种蛋白酶与毒素，减少其对宿主的破坏，增强宿主的抗病力，是一种重要的非特异免疫因子。栉孔扇贝(Chlamys farreri)属于软体动物门，瓣鳃纲，珍珠贝目，扇贝科，主要分布于亚洲的中国、朝鲜、韩国和日本沿海，是我国北方海水养殖区最重要的养殖贝类。但随着近年来养殖病害的不断加剧，养成期栉孔扇贝大规模死亡现象频繁发生，造成了巨大的经济损失，严重威胁了这一产业的持续发展。因此，围绕栉孔扇贝大规模死亡问题的探讨已引起养殖界各方的高度关注。利用传统育种和分子生物学手段培育抗逆优良品种是当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供一种栉孔扇贝α2巨球蛋白基因及其制备方法，它能满足现有技术的上述需求。
一种栉孔扇贝α2巨球蛋白基因，其特征在于它编码具有SEQ IDNo.2序列的栉孔扇贝α2巨球蛋白多肽。
一种栉孔扇贝α2巨球蛋白基因的制备方法，其特征在于先分别以猜测体引物进行和简并引物反转录聚合酶链式反应，再进行3’末端快速克隆和5’末端快速克隆。
本发明的栉孔扇贝α2巨球蛋白基因能用于栉孔扇贝的抗逆优良品种的培育和开发。
附图1为栉孔扇贝α2巨球蛋白基因的核苷酸序列SEQ ID No.1。
附图2为根据栉孔扇贝α2巨球蛋白基因的核苷酸序列推导出的栉孔扇贝α2巨球蛋白氨基酸序列SEQ ID No.2。
具体实施例方式
根据节肢动物马蹄蟹(Limulus polyphemus)α2M基因序列在α2M受体结合区选择猜测体引物α2MUP(5’-GGT TGT GGT GAA CAA AACATG G-3’)和α2MDN(5’-GTA TCC ATC CAG AAA CCA TCT T-3’)。制备栉孔扇贝血细胞总RNA，反转录为cDNA。取2μL上述cDNA作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)，条件为94℃，2min，1循环；94℃ 30sec，57.5℃ 30sec，72℃ 1min，30循环；72℃ 10min，1循环。得到相应受体区片段1172bp。在α2M诱饵区设计简并引物BAIT(5’-AAG CCC GTTGTA GAA/G ATI A/C G-3’)与受体结合区的巢式引物OUTR(5’-TTC TGTCTC AAT CTT GCT GG-3’)和INR(5’-TGT TGG TGA GAT ACT GAAGG-3’)组合进行巢式反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，条件为94℃1.5min，1循环；94℃ 30sec，50℃ 45sec，72℃ 1min，35循环；72℃10min，1循环。得到相应诱饵区片段，长度1218碱基对(base pairs，简写为bp)。
3’末端快速克隆(3’RACE)法克隆α2M基因3’末端用反转录引物(5’-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC CTT TTT TTT TTT TTT-3’)进行反转录。利用3’末端锚定引物(5’-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-3’)与受体结合区巢式引物3OUT(5′-AGG GAG ATG GGA AAT GAC TG-3′)和3IN(5’-CAT CTG TGC ATC ATT TAC TGG-3’)组合进行巢式RT-PCR，外侧引物扩增条件为94℃，1min，1循环；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30循环；72℃ 10min，1循环。内侧引物扩增条件为94℃，1min，1循环；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，30循环；72℃ 10min，1循环。得到相应3’末端片段1914bp。
5’末端快速克隆(5’RACE)法克隆α2M基因5’末端利用血细胞总RNA制备双链cDNA。利用DNA连接酶在双链cDNA 5’末端加接头(5’-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAG CGT GGT CGC GGC CGAGGT-3’，3’-G CCG GCT CCA-5’)。利用接头内的巢式引物(OUTA5’-CTAATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3’；INA5’-AG CGT GGT CGC GGCCGA GGT-3’)和诱饵区巢式引物(OUTB5’-GAA TTC TTC TTC TAC GATGAC AAG GTC-3’INB5’-GTA TAG CAT CCA CGG TGT TGG TGTC-3’)组合进行RT-PCR，外侧引物条件为94℃ 1.5min，1循环；94℃ 30sec，59℃ 35sec，72℃ 3min，30循环；72℃ 5min，1循环。内侧引物为94℃ 1min，1循环；94℃ 30sec，62℃ 35sec，72℃ 3min，30循环；72℃ 5min，1循环。得到相应5’末端片段2239bp。将上述序列进行拼接，获得该基因及5’末端和3’末端非翻译区，全长6394bp，示于附图1。其中开放读码框从第3位核苷酸到第5159位核苷酸共5157bp，编码1719氨基酸，示于附图2。
权利要求
1.一种栉孔扇贝α2巨球蛋白基因，其特征在于它编码具有SEQ IDNo.2序列的栉孔扇贝α2巨球蛋白多肽。
2.一种栉孔扇贝α2巨球蛋白基因的制备方法，其特征在于先以猜测体引物和简并引物进行反转录聚合酶链式反应，再进行3’末端快速克隆和5’末端快速克隆。
全文摘要
一种栉孔扇贝α2巨球蛋白基因，其特征在于它编码具有SEQ IDNo.2序列的栉孔扇贝α2巨球蛋白多肽。于先以猜测体引物和简并引物进行反转录聚合酶链式反应，再进行3’末端快速克隆和5’末端快速克隆。本发明的栉孔扇贝α2巨球蛋白基因能用于栉孔扇贝的抗逆优良品种的培育和开发。
文档编号C12P19/34GK1542134SQ20031010548
公开日2004年11月3日 申请日期2003年11月4日 优先权日2003年11月4日
发明者马洪明, 麦康森, 徐玮, 刘付志国, 张文兵, 谭北平, 国 申请人:中国海洋大学