一种砷-IgM螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种砷-IgM螯合物及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 血清中IgM是由5个单体通过一个J链和二硫键连接成五聚体，分子量最大，为 970kD，沉降系数为19S，称为巨球蛋白（maAsoglobulin)。在分子结构上IgM无铰链区，Cy2 可能替代了铰链区的功能。在生物进化过程中IgM是最早出现的免疫球蛋白。在个体发育 过程中，无论是B细胞膜表面Ig(Smlg)，还是合成分泌到血清中的Ig，IgM都是最早出现的 Ig，在胚胎发育晚期的胎儿即有能力产生IgM。在抗原刺激诱导体液免疫应答过程中，一般 IgM也最先产生。IgM占血清总Ig的5%~10%。由于IgM在免疫应答早期产生，并在补体 参与下的溶血作用比IgG强500倍以上，而且活化补体后通过C3b、C4b等片段发挥调理作 用，因此IgM在机体的早期免疫防护中占有重要地位。天然的血型抗体（凝集素）为IgM， 血型不符的输血，易发生严重的溶血反应。IgM不能过胎盘，脐血中如出现针对某种病原微 生物的IgM，表示胚胎期有相应病原微生物如梅毒螺旋体、风疹或巨细胞毒等感染，称为胚 胎感染或垂直感染。正常人血清中也含有产量单体IgM。
[0003] 砷是常见的环境毒物之一，广泛存在于水、土壤、空气以及食物之中。由于其毒性 以及普遍存在性，美国毒物和疾病登记署（UAsted States Agency for Toxic Substances and Disease Registry，ATSDR)-直将其列为头等有害物质（http ://www. atsdr. cdc. gov/ SPL/index.html)，同时砷也被许多国际组织（包括国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC)以及美国环境保护署（U.S. Environmental Protection Agency，EPA))划定为人类致癌物质之一。砷能对人体产生急性或慢性毒性，急 性砷中毒会导致呕吐、口干、肌肉痉挛、腹痛、手脚刺痛等剧烈症状，而慢性砷中毒对人类健 康的影响也已成为人们关注的一个重大问题。通过饮用水和空气是两种与环境中砷接触最 直接的方式，它会诱发心血管疾病、引起神经功能失调、并导致糖尿病以及肺癌、皮肺癌、膀 胱癌等。而目前流行病学显示，在自然界存在的砷引起的地下饮用水污染，已在中国台湾、 阿根廷、智利、孟加拉国、印度、中国等多个国家和地区造成高剂量的砷暴露，成为环境污染 和危害健康的全球性问题。目前全球已有超过五千万人处于砷暴露和慢性砷中毒的威胁之 中。
[0004] 目前可以运用多种方法检测出血砷含量，包括ELISA、原子吸收光谱（Atomic AbsorptionSpectroscopy，AAS)定量检测法、电感親合等离子体质谱仪（inductively coupledplasmamassspectrometry，ICP-MS)定量检测法等，但仍存在一定缺陷。
[0005] 关于砷中毒，特别是慢性砷中毒的评价，仅能通过检测血砷含量，间接反应人体内 的循环砷含量，无法进一步评估砷对于机体功能的损伤程度，而随着科学技术的飞速发展， 砷与人体的关系也日益紧密，因而寻找一种可以从机体功能角度评价砷中毒，特别是慢性 砷中毒对于机体的损害程度的评价方式日益重要。
【发明内容】
[0006] 针对砷污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种砷-IgM螯合物及其制备方 法，并建立砷-IgM螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测砷-IgM螯合物在评价一个 地区砷污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中砷-IgM螯合物可以间接反映 这个地区人群受砷污染的情况，从而间接反映这个地区砷污染程度。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种砷-IgM螯合物，砷离子与 IgM通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
[0008] 本发明还提供一种上述的砷-IgM螯合物的制备方法，包括以下步骤：
[0009] A)砷与IgM的螯合反应：在人源的IgM中加入砷离子进行螯合反应，得到反应溶 液；
[0010] B)纯化砷-IgM螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的 IgM以及多余的砷离子，即得砷-IgM螯合物。
[0011] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
[0012] (1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水，使砷-IgM螯合物 复溶；
[0013] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgM特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0014] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgM与 填料特异性结合；
[0015] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱；
[0016] (5)收集：收集经过步骤（4)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0017] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0018] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与砷特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0019] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0020] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱；
[0021] (10)收集：收集经过步骤（9)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0022] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得砷-IgM螯合物。
[0023] 其中，上述砷-IgM螯合物的制备方法，还包括步骤C):对砷-IgM螯合物的鉴定；
[0024] 其中，步骤C)中具体如下：
[0025] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0026] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的砷-IgM螯合物，加入稀释缓冲液，并混 匀，然后加样于样品槽中；
[0027] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0028] (4)检测：在胶床上找出含砷的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带复溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或ELISA法检测是否含有砷以及检测砷的含量。
[0029] 本发明还提供一种如上述的砷-IgM螯合物在制备检测人体内砷-IgM螯合物的试 剂或试剂盒中的应用。
[0030] 本发明还提供一种至少包括如上述的砷-IgM螯合物作为对照品的试剂盒。
[0031] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有可捕获IgM的蛋白或捕获砷的 物质。
[0032] 本发明还提供一种定量检测砷-IgM螯合物的方法，以已知含量的上述的砷-IgM 螯合物作为对照品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收 光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯砷-IgM螯合物与酶联免疫结 合法、提纯砷-IgM螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯砷-IgM螯合物与电感耦合等离子体 质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
[0033] 实施本发明的砷-IgM螯合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
[0034] 1.本发明首次体外合成砷-IgM螯合物；
[0035] 2.本发明首次提出砷-IgM螯合物可用于制备检测血样中砷-IgM螯合物的试剂或 试剂盒中的应用。
[0036] 3.本发明建立了砷-IgM螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测砷-IgM螯合 物在评价一个地区砷污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中砷-IgM螯合物 可以间接反映这个地区人群受砷污染的情况，从而间接反映这个地区砷污染程度。本发明 建立的砷-IgM螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提 尚。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明所述的砷-IgM螯合物的非变性电泳条带图；
[0038] 图2为本发明所述的砷-IgM螯合物的同步辐射X线电泳条带的荧光分析图；
[0039] 其中，图1中，M为Marker，2为砷-IgM螯合物；图2中，横坐标为蛋白条带位置， 纵坐标为该蛋白条带中砷能量。
【具体实施方式】
[0040] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0041] 本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可以通过市购方式 获得：
[0042] 提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0043] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种；
[0044] 本发明中的所述能与IgM特异性结合的填料，为表面附有能捕获IgM的蛋白的硅 胶或树脂；
[0045] 本发明中的能捕获IgM的蛋白（抗IgM抗体），包括但不限于兔Anti-人类IgM H&L，其品牌为Abeam、型号为ab8505 ;
[0046] 本发明中的能与砷特异性结合的填料，为表面附有能捕获砷的物质的硅胶或树 脂；
[0047] 本发明中的能捕获砷的物质，包括但不限于鼠抗AsmAb，购买自广州然科公司、货 号为RK15728 ;
[0048] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0049] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0050] 洗涤液为含有KH2P040 . 2mg/ml、Na2HP04 ? 12H20 2. 90mg/ml、NaCl8.Omg/ml、KC1 0? 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的pH为 7. 4 的 0? 15MPBS溶液；
[0051] 封闭液为1% _5 %牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
[0052] 稀释缓冲液为含 1. 5mg/mLNa2