研究所，货号M030)
[0165] 5)透析袋（截留分子量 14000)(BioshopInc)
[0166] 制备步骤具体为：
[0167] 1)透析袋的处理：将透析袋放入500ml(根据烧杯体积可变换用量）体积的 5mmol/LEDTA+200mmol/LNaHC03溶液中，煮沸 10min;倾弃EDTA/NaHCOjf，用超纯水轻轻 漂洗，再用500ml5mmol/LEDTA煮沸10min;弃掉煮沸液，彻底用超纯水清洗，加入大量的 超纯水浸泡透析袋4°C过夜。使用时，戴上手套，取出透析袋，用大量的超纯水彻底冲洗其内 外表面；
[0168] 2)取 2.OmgITCBE溶于 2mlDMS0 中；
[0169] 3)取4.OmgIgM溶于4. 0ml硼酸盐缓冲溶液中（0? 01MpH9. 0)中；
[0170] 4)缓慢将步骤2制备的液体加入IgM溶液中，边滴加边震荡，于25°C，100r/min的 摇床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未与IgM结合的ITCBE;
[0171] 5)将透析所得的液体用lmol/LHC1调节pH值至7. 0,然后缓慢逐渐滴加80y1 lmmol/L砷离子溶液，边滴加边振荡，以免砷离子使蛋白变性沉淀；
[0172] 6)将加好的溶液在25°C，100r/min的摇床中反应2h，用处理好的透析袋进行透析 24h；
[0173] 7)将透析后的液体于-20°C分装保存。
[0174] B)纯化砷-IgM螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液（即步骤A中 7)的透析后的液体）中未反应的IgM以及多余的砷离子，即得砷-IgM螯合物，具体步骤如 下：
[0175] (1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水，使砷-IgM螯合物 复溶；
[0176](2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgM特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0177] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgM与 填料特异性结合；
[0178] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱；
[0179] (5)收集：收集经过步骤⑷洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0180] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0181] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与砷特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0182] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0183] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱；
[0184] (10)收集：收集经过步骤（9)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0185] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得砷-IgM螯合物；
[0186] C)对砷-IgM螯合物的鉴定，具体步骤如下：
[0187] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶作为介质制备胶床；
[0188] (2)加样：取步骤B)中8yL提取纯化得到的砷-IgM螯合物，加入2yL上样缓冲 液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0189] (3)电泳：连接电泳板，加入电泳缓冲液进行电泳；电泳过程中，电流为22mA恒流， 环境温度为4度；至溴酚蓝移至胶底部时停止电泳；
[0190] (4)检测：在胶床上找出含砷的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带复溶， 然后再采用AAS法检测是否含有砷以及检测砷的含量。
[0191] D)检测结果
[0192] (1)电泳结果：
[0193] 其中，图1为本发明所述的砷-IgG螯合物的非变性电泳条带图。
[0194] (2)同步辐射X荧光分析：
[0195] 蛋白条带内微量元素含量的SRXRF分析在北京正负电子对撞机（BEPC)的4W1〃 同步辐射束线上完成。储存环中电子束流能量为2. 2GeV，束流强度100mA。样品移动台 (TSA200型，北京卓立汉光公司）可在计算机控制的步进马达驱动下沿X、Y二维方向上移 动以改变入射光斑位置，移动步长为〇. 〇〇25_。从样品发射出的X射线由Si(Li)探测器 (PGTInc.LS30143-DS)探测，探头与入射SR线共平面且相互垂直，距样品照射点20mm，信 号用PGT多道分析仪（MCA4000)获取输出。用11. 5keV的单色同步辐射光激发样品，调节 入射光斑（lmmx3mm)位置使之处于条带一端，在300s的测定时间内，光斑一直沿条带均勾 缓慢移动，计数结束时光斑移到该条带另一端。沿电泳方向每1mm取一个谱。采用AXIL 软件处理数据，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它元素峰进行归一处理，以抵 消束流强度变化对信号强弱产生的影响。在相同的条件下以同样的方式测量定量标准干胶 膜的荧光谱。
[0196] 图2为本发明所述的砷-IgM螯合物的同步辐射X线电泳条带的荧光分析图，图中 横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该蛋白条带中砷的能量（含量）值。
[0197] (3)采用石墨炉原子吸收光谱法（AAS)初步测定本实施例得到的砷-IgG螯合物中 的砷含量，其含量为92. 401yg/L。
[0198] 本发明一种宙量检测砷-IgM罄合物的方法的检测条件的确宙：
[0199] 1.补体蛋白最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍数的确定
[0200] 步骤如下：
[0201] (1)将抗IgMAb用稀释缓冲液按照以下质量体积比（稀释度）1:500、1:1000、 1:2000、1:4000进行稀释，加入ELISA板微孔中，将抗IgMAb包被于固相载体上，每个浓度 包被三排，4°C过夜18小时；
[0202] (2)移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，用2%牛血清白蛋白 作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤；
[0203] (3)待检样品用稀释缓冲液按照以下质量体积比（稀释度）1:10、1:20、1:40进行 稀释，加入微孔中，按照上述包被的抗AsAb浓度，同一个浓度的抗AsAb的分别加入不同 稀释度血浆，37°C作用1小时；
[0204] (4)移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入抗AsAb，抗AsAb 用稀释缓冲液按照以下质量体积比（稀释度）1:25000、1:50000、1:100000、1:200000进行 稀释，按照每一个相同抗IgMAb、血清稀释浓度，不同浓度抗AsAb各加2孔，37°C作用1小 时，使抗AsAb与IgM上的砷反应；
[0205] (5)酶标抗体选择最适工作浓度，即2ng/ml，移去抗As抗体，并用洗涤液进行洗 涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释HRP酶标抗体，37°C作用1小时，使HRP酶标抗体 与砷-IgM螯合物反应；
[0206] (6)移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37°C避光作用 30分钟；
[0207] (7)以与加底物液相同的速度和顺序滴加终止液至每一微孔；
[0208] (8)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于在酶标仪上分别读取各孔0D 值。根据各孔0D值数值，选择抗IgMAb、抗As-Ab的最佳工作浓度以及血衆的最佳稀释倍 数。
[0209] 试验中同时以所制对照品作为阳性对照，选择IgM抗体+封闭+As抗+酶标+底 物（即不加检测样本）作为阴性对照1、IgM抗体+封闭+血浆+酶标+底物（即不加As 抗）作为阴性对照2、IgM抗体+封闭+酶标+底物（即不加检测样本和As抗）作为阴性 对照3、IgM抗体+封闭+血浆+As抗+底物（即不加酶标）作为阴性对照4,封闭+血浆 +As抗+酶标+底物（即不加IgM抗体）作为空白对照1，只加底物及PBS作为空白对照2 ; 检测结果见表1-2。
[0210] 表1 :抗IgMAb和As抗体最佳工作浓度以及血浆稀释倍数的确定
[0211]
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[0215] 由表1-2数据显示，我们可以看出当人IgM抗体的稀释度为1:1000、全血稀释度 为1:10、As抗稀释度为1:25000时，0D值最大，虽然0D值小于0. 8,但是其所对应的阴性 对照组0D值全部小于0. 1，并且其所对应的阳性对照组，0D值大于0. 8,所以选此值所对应 的浓度作为最佳工作浓度（即人IgM抗体浓度为1:1000,全血稀释度为1:10, As浓度为 1:25000)〇
[0216] 2. ELISA洗脱液最佳工作浓度及时间确定
[0217] 步骤如下：⑴将人IgM抗体用稀释缓冲液稀释至1000倍（质量体积比），加入 ELISA板微孔中，37°C水浴3小时，储存冰箱；
[0218] (2)移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，用2%牛血清白蛋白 作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤；
[0219] (3)移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的 HRP酶标抗体，37°C作用2小时，使其与人IgM抗体反应；
[0220] (4)准备洗脱液：将木瓜蛋白酶用pH8. 0, 0?lmol/LTris-HCI缓冲液配制成 l-2mg/ml，再加入lmmol/L二硫苏糖醇（DIT)37°C孵育 30min;
[0221] (5)移去酶标抗体，用稀释缓冲液对洗脱液进行稀释，使洗脱液中的木瓜蛋白酶浓 度：酶标抗体浓度比=1:80、1:40、1:20、1:10、1:5,其中，每个浓度作3个复孔，分别放置 于37°C温度下洗脱lh、2h、3h;
[0222] (6)移去洗脱液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37°C避光作用 30分钟；
[0223] (7)以与加底物液相同的速度和顺序滴加终止液至每一微孔；
[0224] (8)取405nm波长，加完终止液后，将ELISA板置于在酶标仪上分别读取每组0D 值，通