一种汞-高密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重金属离子的免疫学检测，具体涉及一种汞-高密度脂蛋白螯合物及 其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白质与脂质结合所形成的一种脂质-蛋白质复 合物，按密度分为高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，简称HDL)、中间密度脂 蛋白（intermediatedensitylipoprotein，简称IDL)、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，简称LDL)、极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,简称VLDL)、 乳糜颗粒（chylomicron，CM)。血液中大约百分之三十的胆固醇是通过高密度脂蛋白从组 织细胞中运输到肝脏转化为胆汁酸或通过胆汁排出体外的。高密度脂蛋白由50%的蛋白、 30%的磷脂、25%的胆固醇（其中70%为胆固醇酯）、5%的三酰甘油组成。
[0003] 高密度脂蛋白（简称HDL)是血浆中主要脂蛋白之一，其密度最高，颗粒直径最小， 蛋白和脂质含量大致均等的异质性脂蛋白。由50%的蛋白、30%的磷脂、25%的胆固醇（其 中70%为胆固醇酯）、5%的三酰甘油组成。
[0004] HDL是动脉粥样硬化发生和发展的主要脂类保护因素，其在血清蛋白中有很强的 抑制动脉粥样硬化作用，是冠状动脉疾病的重要保护因子，与冠心病危险程度呈负相关。
[0005] 但是，研究表明高密度脂蛋白胆固醇的数量并不能与心血管疾病的保护程度成正 比，因为其中已经发生结构改变的高密度脂蛋白仍然可以测量到但已经丧失正常功能甚至 会加重动脉粥样硬化的进展。而高密度脂蛋白胆固醇的数量下降则可显著提示动脉粥样硬 化的保护性减弱，因而检测定量血清中HDL对于冠心病具有重要意义，不仅可以用于早期 识别动脉粥样硬化的危险性，而且可以作为脂类调节药物治疗过程的检测以及预后评价的 指标之一。
[0006] 萊（Mercury，Hg)是一种无处不在的重金属，广泛应用于工业、农业、医药业，是 一种非常重要的环境污染物。2011年，美国毒物和疾病登记署（UnitedStatesAgency forToxicSubstancesandDiseaseRegistry，ATSDR)已将其列入物质优先列表内 (SubstancePriorityList)，而世界卫生组织（WorldHealth0rganization，WH0)也早已 将其列为10大最易引起健康问题的化学品之一。
[0007] 汞被认为是对人体及其有害的，会影响人体的多个组织、器官及系统，包括心血管 系统、呼吸系统、神经系统、内分泌系统、消化系统、泌尿系统、免疫系统等，对人体危害极 大。关于汞致机体损伤的机制及其复杂，是很多学者及专家的研究中心。目前普遍研究认 为汞是一个具有其极强的巯基结合能力的金属，因此推测其与多种蛋白质之间关系密切。 众所周知，蛋白质作为身体多种功能的执行者，与机体各组织、器官功能的稳定息息相关， 而汞作为一种金属与机体内的多种蛋白质皆关系密切，相信汞与蛋白质之间的相互关系与 汞致机体损伤息息相关，研究汞与蛋白质的关系将有助于我们了解汞致机体损伤的具体机 制。
[0008] 汞是一种强有力的巯基结合剂，汞也表现出对氨基、磷酰基、羧基及羟基团巨大的 亲和力。因此，汞可以广泛地结合多种蛋白质，并影响他们的功能，抑制他们的活性。随着 对汞毒性研究的深入，人们逐渐认识到汞与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重要的 角色，被认为是了解汞的毒性机理的关键所在，因此，对汞和蛋白质相互作用的研究就显得 愈发重要。而现在关于汞与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与汞之间的 关系还不清楚，因而加强研究对于汞与蛋白质之间的关系至关重要。
【发明内容】
[0009] 针对汞污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种汞-高密度脂蛋白螯合物及 其制备方法，并建立汞-高密度脂蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测汞-高 密度脂蛋白螯合物在评价一个地区汞污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中 汞-高密度脂蛋白螯合物，可以间接反映这个地区人群受汞污染的情况，从而间接反映这 个地区汞污染程度。
[0010] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种汞-高密度脂蛋白螯合 物，该汞-高密度脂蛋白螯合物是汞离子与高密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯 合而成。
[0011] 本发明还提供一种上述的汞-高密度脂蛋白螯合物的制备方法，即体外合成法， 包括以下步骤：
[0012] A)汞-高密度脂蛋白的合成：在提纯源于人体的高密度脂蛋白或按照生物学方法 重组的高密度脂蛋白中加入汞离子进行螯合反应，得到反应溶液；
[0013] B)汞-高密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中 未反应的高密度脂蛋白、特异性抗体和汞离子，即得汞-高密度脂蛋白螯合物。
[0014] 作为优选，所述步骤B)中具体包括以下步骤：
[0015] (1)溶解样品：将上述步骤A)的汞-高密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中，得 汞-高密度脂蛋白螯合物的溶液；
[0016] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与高密 度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0017] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使高密 度脂蛋白与填料特异性结合；
[0018] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. 10m〇l/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0019] (5)收集：收集步骤4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0020] (6)透析：将步骤（5)的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次后，4°C透 析过夜，收集样本；
[0021] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与汞特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0022] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0023] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0024] (10)收集：收集步骤9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0025] (11)透析：将步骤（10)的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次后，4°C 透析过夜，收集样本，即得汞-高密度脂蛋白螯合物。
[0026] 作为优选，上述汞-高密度脂蛋白螯合物的制备方法，还包括以下对汞-高密度脂 蛋白螯合物的鉴定步骤，具体包括以下步骤：
[0027] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0028] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的汞_高密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲 液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0029] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0030] (4)检测：在胶床上找出含汞的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有汞以及检测汞的含量。
[0031] 本发明还提供一种如上述的汞-高密度脂蛋白螯合物在制备检测人体内汞-高密 度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
[0032] 本发明还提供一种至少包括如上述的汞-高密度脂蛋白螯合物作为标准品的试 剂盒。
[0033] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获高密度脂蛋白的蛋白或捕 获金属汞的物质。
[0034] 本发明还提供一种定量检测汞-高密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述 的汞-高密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、 酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯汞-高 密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯汞-高密度脂蛋白螯合物与原子吸收光谱结合 法、提纯汞-高密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原 子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
[0035] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0036] 1.本发明首次合成了汞-高密度脂蛋白螯合物；
[0037] 2.本发明首次提出汞-高密度脂蛋白螯合物可用于制备检测血样中汞-高密度脂 蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用；
[0038] 3.本发明实现了螯合型高密度脂蛋白的特异性识别和定量检测，以便定量检测人 群血清中汞螯合型高密度脂蛋白的含量，以评价一个地区汞污染程度的应用，为工业地区 的汞污染水平提供间接指标。本发明建立的汞-高密度脂蛋白螯合物定量检测方法的准确 度高、重复性好。
【附图说明】
[0039] 图1为本发明所述的汞-高密度脂蛋白螯合物的非变性电泳蛋白条带图；
[0040]图2为本发明所述的汞-高密度脂蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分 析图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0042] 本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤；所用试剂、材 料如未特殊说明，均视为可从市购方式购得：
[0043] 提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0044] 捕获高密度脂蛋白的蛋白为抗高密度脂蛋白抗体，可通过市售获得，如艾博抗 (上海）贸易有限公司出售的"Abeamabl57595"的anti-HDL抗体，以下实施方式中，所述 与高密度脂蛋白特异性结合的物质、抗高密度脂蛋白抗体、抗HDL抗体均为捕获高密度脂 蛋白的蛋白；
[0045] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0046] 稀释缓冲液为pH9. 6的0. 05M碳酸盐缓冲液，配制方法示例：取1. 5g的似20)3和 2. 93g的NaHC03溶解加ddH20 定容至 1000mL;
[0047] 洗涤缓冲液为pH7. 4的0? 15MPBS溶液，配制方法示例：取0? 2g的KH2P04、2. 90g 的Na2HP04 ? 12H20、8. 0g的NaCl、0. 2g的KC1、0. 5mLTween-20,溶解加ddH20 定容至 1000mL;