专利名称：肌荚蛋白抗体制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白抗体，尤其是涉及一种股荚蛋白(myopodin)抗体的制备方法。
背景技术：
myopodin是一种细胞核蛋白质，其在细胞核中的分布受分化及胁迫调控。研究表明，myopodin可能参与细胞信号传递。myopodin的核质分布对抑制前列腺癌及膀胱癌的转移有重要意义(Fan Lin，Yan-Ping Yu，Jeff Woods，Myopodin，a Synaptopodin Homologue，IsFrequently Deleted in Invasive Prostate Cancers，American Journal of Pathology，Vol.159，No.5，November 2001)。myopodin在细胞核内的表达分布能提高病人的存活率(MartaSanchez-Carbayo，Karin Schwarz，Tumor suppressor role for myopodin in bladder cancerloss of nuclear expression of myopodin is cell-cycle dependent and predicts clinicaloutcome，Oncogene(2003)22，5298-5305)而myopodin的相应的抗体对研究其性质和在细胞、组织里的分布有重要的作用，可以用来做临床诊断肿瘤的发生与否。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的肌荚蛋白抗体制备方法存在的不足，到目前为止已知的myopodin的抗体是用合成的20个左右氨基酸的多肽(氨基酸序列和myopodin的566-585氨基酸序列相同)做抗原得到的抗体，因而它只能识别myopodin蛋白1-565氨基酸序列和585以后的氨基酸序列，而Myopdin抗体不是唯一的，为此提供一种以在生物体内合成的有生物活性的myopodin的一段蛋白做抗原制备肌荚蛋白抗体的方法。
由于全长的myopodin蛋白很容易降解，即全长的myopodin蛋白不容易得到，因此，本发明克隆了其中的一段蛋白。
本发明的步骤为1)克隆myopodin基因N端1077bp的片断根据myopodin N端的此1077bp个碱基序列，设计一对引物，通过PCR扩增此片断；2)构建重组质粒把通过PCR扩增的目的片断插入到质粒pGEX-4T-2，然后转化到大肠杆菌中，在加入相应抗性的平板上筛选含有重组质粒的单菌落，然后从筛选出的菌体中提取重组质粒；3)在BL21中表达目的蛋白把提取的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，培养转化了重组质粒的BL21到OD值0.6～1.0，加入IPTG至0.2-0.8mM，诱导；4)经Glutathione-Sepharose-4B层析法纯化得到有生物活性的蛋白把诱导后的菌体离心收集后，用PBS重悬，加溶菌酶溶菌，再超声波破碎，然后把破碎后的菌液离心，收集上清，然后把上清于Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，孵育过夜，第二天，离心收集beads，然后用谷胱甘肽洗脱下来目的蛋白；5)用此纯化后的蛋白做抗原去免疫兔子，得到了myopodin的抗体，用不完全福氏佐剂加强，取血，得到相应的抗血清。
在步骤3)中，在BL21中表达目的蛋白。把提取的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，37℃培养转化了重组质粒的BL21到OD值0.6～1.0，加入IPTG至0.2-0.8mM，25～37℃诱导3～5h。
在步骤4)中，把诱导后的菌体离心收集后，用PBS(pH8.0)重悬，加溶菌酶溶菌30～60min，再超声波破碎20～40次，每次6s。然后把破碎后的菌液在4℃下，10000rpm离心10min，收集上清，把上清于Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，4℃下孵育过夜，第二天4℃下，500rpm离心5min收集beads，然后用10mM谷胱甘肽洗脱下来目的蛋白。
在步骤5)中，用此纯化后的蛋白做抗原去免疫兔子，得到myopodin的抗体，每只兔子每次用抗原蛋白400μg左右，间隔1周后用不完全福氏佐剂加强，连续4次，于第4次后1周取血，就得到相应的抗血清。
与已有的技术相比，由于用此方法得到的抗体是用在生物体内自然合成的myopodin蛋白做抗原得到的，myopodin蛋白的结构没有改变，所以得到的myopodin抗体不仅可以免疫有活性的myopodin蛋白而且也可以免疫变性后的myopodin线性蛋白(图1和图2)，而且特异性很强。下面的图1和图2就是用Western blot和免疫荧光反应来鉴定我们的myopodin抗体的不仅可以免疫活性的myopodin蛋白而且还可以免疫变性的myopodin线性蛋白以及此抗体的特异性。
图1为用自制的myopodin的抗体anti-N-myopodin做Western blot，免疫做抗原去免疫兔子的myopodin蛋白片断和细胞中本源表达的myopodin蛋白。在图1中，(A)用得到myopodin抗体的myopodin蛋白片断做抗原；(B)用293T和T24细胞的本源表达的myopodin蛋白做抗原；(C)用C2C12细胞的本源表达的myopodin蛋白做抗原。
图2为在C2C12细胞中，用自制的myopodin的抗体做免疫荧光染色(在未分化的C2C细胞中，myopodin主要在细胞核中，参见Astrid Weins，Karin Schwarz，Christian Faul，Differentiation-and stress-dependent nuclear cytoplasmic redistribution ofmyopodin，a novel actin-bundling protein，The Journal of Cell Biology，2001，393-403)。
图3为用BamHI和EcoRI双酶切重组质粒后凝胶电泳。在图3中，1是marker；2是重组质粒双酶切后的2条特异条带。
图4为诱导后的目的蛋白表达后的电泳图。在图4中，1是marker；2是没有用IPT6诱导的；3是用IPTG诱导后的。
图5为目的蛋白纯化前和纯化后。在图4中，1是marker；2是纯化后；3是纯化前。
具体实施例方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。
1、克隆myopodin N端片断的时候，采用的引物是上游引物AAAAGGATCCTTTAAGAAGCGAGACGTCGG(酶切位点BamHI)下游引物AAAGAATTCACTTTTGTTTGG(酶切位点EcoRI)..用此引物体外扩增出myopodin N端片断(1077bp)。
2、把扩增的myopodin N端片断插入到质粒pGEX-4T-2中，构建重组质粒。图3就是用BamHI和EcoRI双酶切重组质粒，验证了重组质粒的构建的正确。
3、在BL21中表达目的蛋白。把提取的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，37℃培养转化了重组质粒的BL21到OD值0.6，加入IPTG至0.5mM，30℃诱导5h。图4就是诱导后的目的蛋白表达后的电泳图。
4、经Glutathione-Sepharose-4B层析法纯化得到有生物活性的蛋白。把诱导后的菌体离心收集后，用PBS(pH8.0)重悬，加溶菌酶溶菌40min，再超声波破碎20次，每次6s。然后把破碎后的菌液在4℃条件下，10000rpm离心10min，收集上清，然后把上清于Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，4℃条件下孵育过夜，第二天4℃下，500rpm离心5min收集beads，然后用10mM谷胱甘肽洗脱下来目的蛋白。图5就是目的蛋白纯化前和纯化后的情况。
5、用此纯化后的蛋白做抗原去免疫兔子，得到了myopodin的抗体。每只兔子每次用抗原蛋白400μg左右，间隔1周后用不完全福氏佐剂加强。连续4次，于第4次后1周取血，就得到相应的抗血清。
权利要求
1.肌荚蛋白抗体制备方法，其特征在于其步骤为1)克隆myopodin基因N端1077bp的片断根据myopodin N端的此1077bp个碱基序列，设计一对引物，通过PCR扩增此片断；2)构建重组质粒把通过PCR扩增的目的片断插入到质粒pGEX-4T-2，然后转化到大肠杆菌中，在加入相应抗性的平板上筛选含有重组质粒的单菌落，然后从筛选出的菌体中提取重组质粒；3)在BL21中表达目的蛋白把提取的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，培养转化了重组质粒的BL21到OD值0.6～1.0，加入IPTG至0.2-0.8mM，诱导；4)经Glutathione-Sepharose-4B层析法纯化得到有生物活性的蛋白把诱导后的菌体离心收集后，用PBS重悬，加溶菌酶溶菌，再超声波破碎，然后把破碎后的菌液离心，收集上清，然后把上清于Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，孵育过夜，第二天，离心收集beads，然后用谷胱甘肽洗脱下来目的蛋白；5)用此纯化后的蛋白做抗原去免疫兔子，得到了myopodin的抗体，用不完全福氏佐剂加强，取血，得到相应的抗血清。
2.如权利要求1所述的肌荚蛋白抗体制备方法，其特征在于在步骤1)中，设计的一对引物为上游引物AAAAGGATCCTTTAAGAAGCGAGACGTCGG，酶切位点BamHI；下游引物AAAGAATTCACTTTTGTTTGG，酶切位点EcoRI。
3.如权利要求1所述的肌荚蛋白抗体制备方法，其特征在于在步骤3)中，把提取的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，37℃培养转化了重组质粒的BL21到OD值0.6～1.0，加入IPTG至0.2-0.8mM，25～37℃诱导3～5h。
4.如权利要求1所述的肌荚蛋白抗体制备方法，其特征在于在步骤4)中，把诱导后的菌体离心收集后，用PBS重悬，pH8.0，加溶菌酶溶菌30～60min，再超声波破碎20-40次，每次6s。
5.如权利要求1所述的肌荚蛋白抗体制备方法，其特征在于在步骤4)中，把破碎后的菌液在4℃下，10000rpm离心10min，收集上清，把上清于Glutathione-Sepharose-4B的beads混合，4℃下孵育过夜，第二天4℃下，500rpm离心5min收集beads，然后用10mM谷胱甘肽洗脱下来目的蛋白。
6.如权利要求1所述的肌荚蛋白抗体制备方法，其特征在于在步骤5)中，每只兔子每次用抗原蛋白400μg，间隔1周后用不完全福氏佐剂加强，连续4次，于第4次后1周取血，就得到相应的抗血清。
全文摘要
肌荚蛋白抗体制备方法，涉及一种蛋白抗体，尤其是涉及一种股荚蛋白(myopodin)抗体的制备方法。提供一种以在生物体内合成的有生物活性的myopodin的一段蛋白做抗原制备肌荚蛋白抗体的方法。步骤为克隆myopodin基因N端1077bp的片断；把通过PCR扩增的目的片断插入到质粒pGEX－4T－2，然后转化到大肠杆菌中，在加入相应抗性的平板上筛选含有重组质粒的单菌落，提取重组质粒；在BL21中表达目的蛋白；经层析法纯化得到有生物活性的蛋白用纯化后的蛋白做抗原去免疫兔子，得到了myopodin的抗体，用不完全福氏佐剂加强，取血，得到相应的抗血清。
文档编号C07K16/18GK1763098SQ200510119578
公开日2006年4月26日 申请日期2005年11月15日 优先权日2005年11月15日
发明者陶涛, 邱凯, 梁洁, 应喜娟 申请人:厦门大学