专利名称：抗人酸性成纤维细胞生长因子的单链抗体基因的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体说涉及抗人酸性成纤维细胞生长因子的单链抗体基因、及其重组载体和表达产物。
背景技术：
酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor，aFGF)是成纤维细胞生长因子家族成员之一，能影响多种细胞如间充质细胞、内分泌细胞、神经细胞的生长、分化及功能，在正常生理和病理过程中参与生长发育和组织损伤修复过程。
最近研究表明aFGF基因mRNA在膀胱移行细胞癌、卵巢癌及卵巢交界性肿瘤组织中均呈过度表达，与正常卵巢、卵巢瘤样病变及卵巢良性肿瘤相比，有显著差异。当发生癌变时，由于致癌因素的作用，使卵巢癌组织细胞中aFGF基因活性增强，导致合成过量的aFGF，而aFGF又进一步引起卵巢癌组织内血管内皮细胞及毛细血管的形成，从而加速了瘤细胞随血液的转移。
近年来关于aFGF表达的生物学意义已引起学者们关注，人们期望利用aFGF的拮抗剂抑制aFGF与其受体的结合作为抑制肿瘤细胞增殖的手段，针对aFGF的单克隆抗体能有效抑制肿瘤细胞的增殖。以单克隆抗体为载体的肿瘤导向治疗的研究已有20年的历史，目前采用的多是鼠源性抗体，当应用于体内治疗时可引起人抗鼠抗体(HAMA)，其干扰了抗体制剂在体内的合理分布及效果。其次，由于抗体为大分子，肿瘤的间质内压又高于正常组织，致使抗体或是偶合物在肿瘤靶部位的摄取过低。
基因工程抗体是运用重组DNA技术，对抗体基因进行加工改造及重新装配，经适当受体细胞所表达的抗体分子。本发明提供的是有实际价值的单链抗体(single-chain Fv，ScFv)。ScFv是由一条连接肽将轻链(VL)和重链(VH)连在一起所形成的两个可变区首尾相接的单一肽链，通过正确折叠，两个可变区由非共价键形成具有抗原结合功能的片段，ScFv分子量小仅为完整IgG的1/6，，易穿入固体组织及肿瘤内部，具有亲本抗体结合抗原的特性和功能，因此，ScFv是具有潜在应用价值的免疫治疗制剂。
目前市场上的治疗用单克隆抗体药物(也叫“生物导弹”)多是鼠源性，当用于人体可引起人抗鼠抗体(HAMA)，其干扰了抗体制剂在体内的合理分布及效果。其次，由于抗体为大分子，肿瘤的间质内压又高于正常组织，致使抗体或是偶合物在肿瘤靶部位的摄取过低。另外，特殊的细胞培养的方法使得单克隆抗体难以大规模生产，与相同规模的化学药厂或微生物合成药厂相比，单克隆抗体药物在建厂和生产过程中消耗的资金很大。同时，单克隆抗体在高温和强酸强碱的条件下会分解，必须在绝对零度下保存，否则就会在数周内完全失去活性；抗体能被消化系统很快降解，从而阻止了其进入大脑或一些肿瘤的外围。许多疾病无法用单克隆抗体药物治疗，在很大程度上制约了单克隆抗体的临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供编码抗人aFGF-ScFv基因和由此推断的氨基酸序列；提供含有所述的抗人aFGF-ScFv基因的表达载体和利用该载体转化的工程菌；同时提供从所述工程菌制备重组抗人aFGF-ScFv的过程。
本发明的重组抗人aFGF-ScFv基因，是由连接肽连接抗体的VL和基因VH，建立一个抗人aFGF-ScFv基因，该基因由714个碱基组成。
这种人aFGF-ScFv基因的核苷酸序列为atg acc cag tct cca gca atc ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc 48aca atg act tgc agg gcc agc tca agt gta agt tac atg cac tgg tac 96cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc 144aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg 192acc tct tac tct ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc 240act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac cca ccc acg ttc ggt gct 288ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt 336ggc tct ggc gga ggt ggc tct cag gtg aag ctg cag cag tca ggg gga 384ggc tta gtg aag cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct 432gga ttc gct ttc agt agc tat gac atg tct tgg gtt cgc cag act ccg 480gag aag agg ctg gag tgg gtc gca acc att agt agt ggt ggt agt tac 528acc tac tat cca gac agt gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac 576aat gcc agg aac acc ctg tac ctg caa atg agc agt ctg agg tct gag 624gac acg gcc ttg tat tac tgt gca aga cga ggt ggt aac tac gcc tgg 672ttt gct tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 714
上述抗人aFGF-ScFv的氨基酸序列为Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys ValThr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp TyrGln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr SerAsn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala AlaThr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly AlaGly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly GlyGly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala SerGly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr ProGlu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser TyrThr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg AspAsn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser GluAsp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Asn Tyr Ala TrpPhe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser *(*终止密码子)抗人aFGF-ScFv基因的制备包括以下步骤第一步制备抗人aFGF的单克隆抗体。
用人aFGF免疫8周龄的Balb/c小鼠，经脾细胞和骨髓瘤细胞融合获得稳定分泌抗人aFGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
第二步克隆抗体可变区基因。
从杂交瘤细胞株中提取mRNA，用Promage公司抗体通用引物试剂盒提供的引物，通过RT-PCR法克隆出该单克隆抗体轻、重链可变区基因。
第三步将获得的基因片段分别克隆到商业化的T载体，进行序列分析，经同源对比分析，证实该基因片段为抗体可变区基因。
第四步连接抗体轻链、重链基因，以15个氨基酸的柔性连接子，连接抗体轻、重链可变区基因构建ScFv基因第五步将ScFv基因克隆到商业化的pET28a载体上，在BL21宿主大肠杆菌中。获得的转化菌株为工程菌株BL21-ScFv。
第六步制备重组抗体。培养工程菌株，经IPTG诱导表达4小时，表达效率达33％。经过离心、沉淀等步骤可获得该发明的分子量为3.0KD的重组单链抗体。附图见附页。
单链抗体具有两个抗原结合臂，可以同时和T细胞及靶细胞结合，并激活细胞毒性T细胞杀伤病变细胞。单链抗体分子量只相当于完整抗体的1/6，在临床应用上比完整抗体优越免疫原性弱，对实体瘤渗透能力强，可以用基因工程手段发酵生产。与传统的单克隆抗体药物相比，其可以进行大规模细菌发酵生产，且价格低廉，易于普及应用，是一种极具应用潜力的抗体形式。
附图为抗人aFGF-ScFv基因工程菌表达分析图。
其中1，低分子量标准；2，3，未诱导大肠杆菌总蛋白；4，IPTG诱导1小时表达蛋白；5，IPTG诱导2小时表达蛋白；6，IPTG诱导3小时表达蛋白；7，IPTG诱导4小时表达蛋白。经蛋白扫描分析，IPTG诱导1-4小时scFv的表达量分别占菌体总蛋白的25％，29％，30％和32％，完全满足工程菌表达蛋白的要求。
具体实施例方式
本发明的实施例包括以下内容1.抗人aFGF杂交瘤细胞株的制备重组人aFGF蛋白30ug免疫8周龄雌性Balb/c小鼠，分别于第14天，35天以等量抗原免疫，第45天用间接ELISA法检测鼠尾血，对免疫反应好的鼠在第56天进行加强免疫，3天后取其脾细胞进行融合首次免疫使用弗氏完全佐剂，其余使用不完全佐剂。
将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1以5∶1混合，1500rpm离心5min，弃上清，置37℃水浴中。将1ml预热的PEG缓慢加入，边加边轻摇，随后用50ml预热RPMI1640不完全培养基稀释。800rpm离心5min，弃上清，加入足量的HAT培养基重新悬浮，分种于已制备饲养细胞的的96孔培养板，100ul/孔。随后置入37℃，5％CO2培养箱中培养。融合后第7天，，第10天以新鲜的HAT培养基半量换液一次，，第12天改用HT培养基，第15天后改用完全培养基。待细胞长至孔底约1/3时，用间接ELISA法对培养上清液进行检测筛选。对阳性孔细胞进行有限稀释克隆，直至所有克隆孔上清液中抗体阳性铝为100％时，即可进行扩大培养，保存。
2.抗体可变区基因VL和VH的克隆从液氮罐中取出冻存的1C9杂交瘤细胞株，复苏后用含20％胎牛血清的RPMI1640培养至对数生长期，1000rpm，离心5min收集5×106个细胞，然后按照Amersham Biosciences公司产品RNA分离和纯化试剂盒提取杂交瘤细胞的总RNA并分离纯化mRNA。使用同一公司逆转录试剂盒合成cDNA。
扩增抗体可变区基因所用的引物来源于Amersham Biosciences公司的ScFv噬菌体抗体试剂盒。在两个PCR小管中分别取上述合成的cDNA 33ul，在第一个管中加入VL引物混合物2ul，ddH2O 64ul。在第二个管中加入VH引物1，VH引物2各2ul，ddH2O 62ul，95℃预变性5min后，加入1ul Taq DNA聚合酶(3u/ul)。PCR反应条件是94℃1min，55℃2min，72℃2min，共30个循环，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析后回收目的片段，该目的片段与商业化的T载体连接进行序列测定。
3.抗体基因VL、VH的连接肽和ScFv基因构建根据序列测定获得的氨基端和羧基端的VL和VH基因序列进一步设计构建连接肽和ScFv引物VL正义链引物为5’CCGGAA TTCGAC ATC CAG ATG ACC CAG(GAA TTC为EcoRI酶切位点)。
VL反义链引物为5’-AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC CCG TTT GAT TTC CAG CTTGGTVH正义链引物为5’-GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGA GGT GGC TCT CAG GTGAAG CTG CAG CVH反义链引物为5’-CCCAAG CTTCTA TGA GGA GAC GGT GAC(AAG CTT为HindIII酶切位点)。
其中VL反义链引物和VH正义链引物中斜体部分为连接肽，经PCR反应扩增，斜体黑体部分为互补区域，为构建ScFv而设计。
PCR反应条件为94℃5min，然后94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃5min。将延伸后的PCR产物电泳回收后，overlap PCR进一步构建ScFv基因。在PCR管中加入上述PCR产物、Taq酶和缓冲液，在不加入引物的情况下进行7个循环94℃70s，55℃1min，72℃1min。在此过程中由于VL反义链引物和VH正义链引物的中的互补区域，VL和VH就可以相互配对，并且延伸，从而形成完整的VL-连接肽-VH。最后加入引物VL正义链引物和VH反义链引物进行以下反应94℃5min，94℃70s，60℃1min，72℃1min，然后72℃2min，25个循环，最终获得ScFv基因。
4.构建ScFv基因的重组表达载体
EcoRI和HindIII限制性内切酶处理商业化的pET28a(+)表达载体，按摩尔浓度1∶3比例混合载体DNA和ScFv基因，T4DNA连接酶连接载体和ScFv基因，获得重组表达载体pET28a-抗FGF-ScFv。
5.表达ScFv重组蛋白将重组表达载体pET28a-抗FGF-ScFv转化DH5感受态大肠杆菌，氨苄青霉素抗性培养基筛选，双酶切鉴定并进行序列分析。同时将重组表达载体转化BL21感受态大肠杆菌，37℃培养，OD600大约0.5，加入IPTG使其终浓度0.8mM诱导4小时，6000rpm 4℃离心10分钟，15％SDS-PAGE分析重组抗体。
SEQUENCE LISTING<110>东北师范大学<120>抗人酸性成纤维细胞生长因子的单链抗体基因<130>none<140>none<141>2005-11-07<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>714<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<221>misc_recomb<222>(358)..(714)<223>抗人酸性成纤维细胞生长因子抗体的重链基因
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100 105 110ggc tct ggc gga ggt ggc tct cag gtg aag ctg cag cag tca ggg gga 384Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly115 120 125ggc tta gtg aag cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct 432Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser130 135 140gga ttc gct ttc agt agc tat gac atg tct tgg gtt cgc cag act ccg 480Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro145 150 155 160gag aag agg ctg gag tgg gtc gca acc att agt agt ggt ggt agt tac 528Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr165 170 175acc tac tat cca gac agt gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac 576Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp180 185 190aat gcc agg aac acc ctg tac ctg caa atg agc agt ctg agg tct gag 624Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu195 200 205gac acg gcc ttg tat tac tgt gca aga cga ggt ggt aac tac gcc tgg 672Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Asn Tyr Ala Trp210 215 220ttt gct tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 714Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser *225 230 235<210>2<211>238<212>PRT<213>Artificial Sequence
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Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Ash Tyr Ala Trp210 215 220Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser *225 230 23权利要求
1.抗人酸性成纤维细胞生长因子的单链抗体基因，其特征是由连接肽连接抗体的VL和基因VH建立，该基因由714个碱基组成该基因的核苷酸序列为atg acc cag tct cca gca atc ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc 48aca atg act tgc agg gcc agc tca agt gta agt tac atg cac tgg tac 96cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc144aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg192acc tct tac tct ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc240act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac cca ccc acg ttc ggt gct288ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt336ggc tct ggc gga ggt ggc tct cag gtg aag ctg cag cag tca ggg gga384ggc tta gtg aag cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct432gga ttc gct ttc agt agc tat gac atg tct tgg gtt cgc cag act ccg480gag aag agg ctg gag tgg gtc gca acc att agt agt ggt ggt agt tac528acc tac tat cca gac agt gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac576aat gcc agg aac acc ctg tac ctg caa atg agc agt ctg agg tct gag624gac acg gcc ttg tat tac tgt gca aga cga ggt ggt aac tac gcc tgg672ttt gct tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca714该基因的氨基酸序列为Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys ValThr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp TyrGln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr SerAsn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala AlaThr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly AlaGly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly GlyGly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala SerGly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr ProGlu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser TyrThr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg AspAsn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser GluAsp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Asn Tyr Ala TrpPhe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser *。(*终止密码子)
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体说涉及抗人酸性成纤维细胞生长因子的单链抗体基因、及其重组载体和表达产物。本发明提供的是有实用价值的单链抗体(single－chain Fv，ScFv)。ScFv是由一条连接肽将轻链(VL)和重链(VH)连在一起所形成的两个可变区首尾相接的单一肽链，通过正确折叠，两个可变区由非共价键形成具有抗原结合功能的片段，ScFv分子量小仅为完整IgG的1/6，易穿入固体组织及肿瘤内部，具有亲本抗体结合抗原的特性和功能，因此，ScFv是具有应用价值的免疫治疗制剂。
文档编号C07K16/18GK1800394SQ20051011904
公开日2006年7月12日 申请日期2005年11月30日 优先权日2005年11月30日
发明者朱筱娟, 王兴智, 杨涛 申请人:东北师范大学