Mth1体外活性测定方法及其在药物筛选模型建立中的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于药理学与分子生物学领域，涉及DNA氧化损伤主要修复酶8-羟基鸟嘌 呤核苷酸酶（MTH1)原核表达、活性测定及其抑制剂体外筛选模型的建立方法。
【背景技术】
[0002] 过量的自由基特别是活性氧可攻击许多重要生物大分子，如核酸、蛋白质。DNA 受到攻击后，产生20多种修饰碱基，其中以自由核苷酸形式存在的鸟嘌呤，其氧化点 位最低，更容易氧化，形成8-羟基鸟噪呤（8-〇xoguannine，8_oxoG)。在DNA复制或修复 时，8-0H-dGTP能以相同效率合成到DNA上碱基A和C对位，引起A:T-C:G及G:C-T:A 颠换，是合成DNA的强致突变底物，该氧化损伤具有遗传毒性，并可能在肿瘤形成及衰老过 程发挥重要作用。
[0003] 经研究，人体主要由hOGGl、hMYH及hMTHl修复基因联合参与8-0H-G的修复，其 中hOGGl蛋白与hMYH蛋白作用于DNA上8-0H-G位点，hMTHl蛋白即8-0H-dGTP酶则负责 清除核苷酸池8-0H-dGTP。MTH1可将8-0H-dGTP迅速水解成8-0H-dGMP，8-0H-dGMP体内不 能被重新磷酸化成8-0H-dGTP，在8-0H-dGMP酶作用下进一步脱磷酸形成8-羟基鸟嘌呤核 苷（8-0H-dG)，排出细胞，重新磷酸化限制与继续脱磷酸使8-0H-dGMP从细胞中彻底清除。 人类MutT同源体l(MutThomolog-1，MTH1) 8-羟基鸟嘌呤核苷酸酶通过转变8-oxo-dGTP 和2-0H-dATP为8-oxodGMP和2-0H-dAMP而解毒，否则导致错误配对、突变和细胞死亡。研 究发现过表达MTH1能抑制错配修复缺陷的结直肠癌细胞的突变表型，表明在癌中氧化的 dNTP池是引起突变的一个主要因素。而且，MTH1过表达能逆转Ras诱导的老化，亦表明了氧 化dNTP在癌中的重要性。综合提示，正常但不重要的MTH1蛋白对清除癌相关的dNTP池损 伤可能更重要，而且为癌细胞存活所必需，开发MTH1特异性的抑制剂具有良好抗癌前景。
【发明内容】
[0004] 本发明为探讨MTH1抑制剂对治疗癌症的作用机制，提供了一种简单、灵敏度高的 MTH1活性测定方法及其抑制剂体外筛选模型的建立。
[0005]为实现上述研究目的，本发明基于MTH1与dGTP反应生成dGMP和无机焦磷酸PPi， 而PPi可以在无机焦磷酸酶PPase的作用下生成无机磷酸根离子，通过孔雀绿法测定无机 磷酸根离子的量，可以来反映MTH1的DNA氧化损伤修复活性，并以无活性的突变蛋白E56A 做阴性对照，通过探索各反应试剂的浓度和反应时间，建立起一个方便可靠的MTH1抑制剂 体外筛选模型。具体采用以下技术方案：
[0006] 1.原核表达载体MTH1的获得
[0007] 原核表达载体pET28b-MTHl及其突变体pET28b-MTHl-E56A和化合物TH588C获赠 于瑞典卡罗林斯卡研究所医学生物化学与生物物理学系。
[0008] 2.MTH1及其突变体E56A的原核表达、提取与纯化
[0009] 将原核表达载体pET28b-MTHl及其突变体pET28b-MTHl-E56A转化入大肠杆菌 表达菌株BL21(DE)3中，挑选阳性表达菌株接种到含有卡那霉素的LB培养基中，37°C， 200rpm/min培养至0D600 = 0. 7,加入终浓度0. 25mmol*L1的异丙基-D-硫代吡喃半 乳糖苷（IPTG)，20°C诱导过夜。
[0010] 4000r离心 5min收集菌液，倒去上清，加lOmmol?L^ris-HCLO. 3mol?L^aCl, pH7. 4缓冲液10-20ml，清洗细菌，4000r再次离心5min;倒去上清，加4-6mL上述缓冲液重 悬细菌；将其放在冰上超声破碎，每次超声3s间隔15s，4°C12000r离心15min，取上清至 lOmlEP管中。
[0011] 上清用 0. 45um滤膜过滤后，上样至预先用lOmmol.LiTris-HCl，0. 3mol.LWaCl， lOmmol*L1咪唑，pH7. 4缓冲液平衡好的Ni2+亲和色谱柱中，室温结合lOmin后，用含不同咪 唑浓度的缓冲液由低到高（25、75、150、200、250mm〇l?L1)冲洗柱子，根据紫外检测仪的吸 光度变化，分别收集洗脱下来的蛋白；SDS-PAGE电泳分析纯度后，以BSA为标准用Bradford 法确定纯化的目的蛋白的浓度，加入甘油并保存于_80°C冰箱。
[0012] 3.MTH1的活性测定
[0013]在lOOmMTris-醋酸，pH8. 0,40mM氯化钠，10mM醋酸镁和ImMDTT缓冲液中加 入上述纯化的MTH1蛋白，室温孵育15min，再加入无机焦磷酸酶PPase和MTH1蛋白的反应 底物dGTP，25°C摇床上反应45-60min。最后加入孔雀绿、钼酸铵和柠檬酸、盐酸及溶剂吐温 20,室温反应至少45min后，用酶标仪在630nm处测吸光度。反应在96孔板中进行，反应总 体积为200yL。
[0014] MTH1的活性测定原理如下所示，
[0015]
[0016] 活性测定是基于MTH1与dGTP反应生成dGMP和无机焦磷酸PPi，而PPi可以在 无机焦磷酸酶PPase的作用下生成无机磷酸根离子，通过孔雀绿法测定无机磷酸根离子的 量，可以来反映MTH1的DNA氧化损伤修复活性。
[0017] 4.各种反应溶液最佳浓度、反应时间和反应条件的研究
[0018] 为使这个筛选平台测得的数据更精确，需要优化一下缓冲体系中各反应试剂的最 佳浓度、反应时间和反应条件。孔雀绿法在580nm-680nm处有一个吸收峰，且在630nm处都 有最大吸收。因此，确定630nm为本实验室的最佳测定波长。
[0019] 此外，无机磷标准液KH2P04S0. 2yg/mL，孔雀绿最适浓度范围为 0? 1125mg?mL1~0? 45mg?mL\钼酸铵最适浓度范围为3. 5%~4. 5%，优选在使用前将 孔雀绿与钼酸铵两种溶液按3 :1质量比混合，反应半个小时后，用0. 45yM滤膜过滤。在反 应过程中为防止盐酸易挥发不稳定，除盐酸外，加入lmol?L1柠檬酸作酸化液，使反应体 系的酸度能保持恒定，有利于未形成显色复合物的孔雀绿褪色，显色稳定性可达8小时以 上。
[0020] 优选孔雀绿最适浓度为0. 45mg?mLi，钼酸铵在反应体系中最适质量百分浓度为 4. 2%，并对溶剂用量进行了探索，以求测定的数据更精确。比如吐温，在反应体系中起增 溶和稳定显色的作用，若加入浓度太高，空白组长时间颜色过深，并且空白组和实验组之间 的差距太小；若加入浓度太小，反应体系不稳定，15min左右颜色几乎全为无色，空白组和 实验组的差距也较小，对于大量筛药来说，时间过长，并且灵敏度和精确度不高。用无机磷 标准溶液经探索后，确定吐温20的体积是孔雀绿体积1. 5%左右时，反应体系在45min后， 630nm吸光度随着磷酸根离子的量，有比较明显的增加（如图2)。此外，反应体系中，盐酸 对显色反应影响也较大，酸度太高灵敏度降低，酸度太低体系会出现浑浊。因此，本实验组 在已有的基础上进行了探索，发现当lmL钼酸铵体系中加70uL浓盐酸时，反应最灵敏。（如 图3)
[0021] 在显色条件确定后，开始加入重组蛋白MTH1。建立其抑制剂筛选平台，为使测得 数据更准确，首先必须确保MTH1反应完全，因此，可降低MTH1的量，加大dGTP和PPase的 量，尤其是PPase。为此，本实验组摸索了大量条件，最终确定，在200yL体系中，加入重组 蛋白MTH17. 5nM，再加入无机焦磷酸酶PPase(终浓度为8yg?mL4和反应底物dGTP(终 浓度为 200nmol?L3。
[0022] 最后是反应时间的研究，首先先将重组蛋白和缓冲液混合，若筛选化合物，将化合 物与其一同混合，室温孵育l〇_15min，为使重组蛋白与缓冲液充分混合而又不影响蛋白活 性，孵育时间定为15min。然后加入无机焦磷酸酶PPase和反应底物dGTP，由于酶活性较高 而且酶促反应速度也比较快，30min完全可以反应结束，为了减少反应中不必要的误差，最 终定为45min。最后加入孔雀绿和钼酸铵混合液和梓檬酸，反应45-60min后，测定的数据稳 定，放置24h-28h后，测得的数据更为准确。
[0023] 5.MTH1抑制剂的筛选模型的建立
[0024] 设定空白孔与对照孔，每孔先分别加入缓冲溶液（100mMTris-醋酸，pH8. 0,40mM 氯化钠，10mM醋酸镁和ImMDTT)，空白孔不加重组蛋白MTH1，分别用同体积的缓冲溶液替 代。对照孔加入重组蛋白MTH17. 5nM，加入需筛选的化合物，室温孵育15min，再加入无机焦 磷酸酶PPase(终浓度为8yg?mL4和反应底物dGTP(终浓度为200ymol?L^，于25°C 孵育45min，然后加入预先按3 :1质量比配制好的孔雀绿和钼酸铵的混合溶液，其中孔雀绿 溶液浓度为〇. 45mg?mL1 (吐温20加入量为孔雀绿质量的1. 5% )，钼酸铵溶液质量百分浓 度为4. 2% (lmL体系加70yL浓盐酸），在使用前lh将两种溶液混合，0. 45yM滤膜过滤， 以上两种溶液要当天用当天配。最后加入lmol吨1柠檬酸，室温摇床上反应至少45min后， 用酶标仪在630nm处测吸光度。
[0025] 抑制剂对MTH1蛋白的抑制率用以下公式计算：
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[0027] 本发明创新点及优点在于：将MTH1原核表达、提取及纯化，以无活性的MTH1突变 体E56A作为阴性对照，基于MTH1与dGTP反应生成dGMP和无机焦磷酸PPi，而PPi可以在 无机焦磷酸酶PPase的作用下生成无机磷酸根离子Pi，通过孔雀绿法测定无机磷酸根离子 的量，来反映MTH1的DNA氧化损伤修复活性。通过优化反应试剂的浓度、反应时间和反应 条件，使方法更直观、准确率更高。并将该方法应用于MTH1体外抑制剂的筛选和评价，对进 一步探讨MTH1对治疗癌症的作用机制，对推动我国开发自主知识产权药物有重要的应用 价值。
【附图说明】
[0028] 图1中，MTH1和对照物E56A电泳图；图中，A代表MTH1，1 :蛋白分子量标准，2-7 : 不同浓度的咪唑缓冲液洗脱下来的蛋白MTH1，其中2和3是25mM咪唑：；4是75mM咪唑；5 是150mM咪唑；6是200mM咪唑；7是250mM咪唑；B代表E56A，1 :蛋白分子量标准，2-8 :不 同浓度的咪唑缓冲液洗脱下来的蛋白E56A，其中2和3是25mM咪唑：；4是75mM咪唑；5是 100mM咪唑；6是15