一种镍-白蛋白螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种镍-白蛋白螯合物及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 血清白蛋白（HSA)是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众 多的内源性和外源性物质，这与它特异性结构密切相关。血清白蛋白是由肝脏合成的一种 简单蛋白质，仅由氨基酸组成，没有修饰基团和其他附属物。根据数据资料显示，牛血清白 蛋白（BSA)分子由583个氨基酸残基组成。而人血清白蛋白（HSA)比BSA多2个氨基酸， 即585个氨基酸残基组成。两者的差异在于BSA缺失HSA氨基酸序列116位和585位的残 基。白蛋白氨基酸成分最显著的特征是低含量的色氨酸，HSA和BSA每分子中分别含有1或 2个残基。苯丙氨酸和异亮氨酸含量也比较低。半胱氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸含量都 非常高。大量的离子化残基提供了白蛋白非常高的电荷，在PH7的条件下，每分子白蛋白带 有185个离子，这样就形成白蛋白易溶性。
[0003]白蛋白最独特的结构特点是二硫键模式。BSA序列包含35个半胱氨酸残基，形成 17个二硫桥，相邻的半胱氨酸对与链上最近的残基连结，形成10-47个残基长度的一对环。 S-S键交迭增加了白蛋白结构的刚性和稳定性。
[0004] 白蛋白的三级结构被认为是一种高度螺旋的分子，通过X射线衍射得知HNI晶体 中大约67%的残基参与形成了 28个a-螺旋体，10%残基参与形成0转角，23%残基形 成伸展链。
[0005] 生理机制上，白蛋白维持人体血浆胶体渗透压的80%。另外，白蛋白也是血液中各 种大分子物质的主要载体，在代谢物转运、生物转化中发挥着重要作用。它同时也是调节凝 血功能和炎性反应的组分。人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗传方面的研究。
[0006] 镍作为一种常见的有毒金属，广泛应用于生活、生产之中，包括生产硬币、珠宝、镍 合金不锈钢、制造Ni-Cd电池等，与人们的生活息息相关。随着科技的进步，人们将镍作为 催化剂用于生产碳纳米颗粒的生产之中，又进一步加深了镍对于人类的影响。对于普通人 群，镍主要是通过食入、饮入、接触等方式摄入镍，当然吸烟也是一重要途径。研究发现，过 量的镍会导致机体多处组织及器官损伤，导致多种疾病的发生，包括呼吸系统疾病（肺炎、 支气管炎、肺纤维化、哮喘、肺水肿等）、心血管疾病、肾脏疾病、皮肤疾病等，甚至还会导致 肿瘤的发生。
[0007] 流行病学资料显示，长期接触镍的工人，其患呼吸系统肿瘤的几率大大增加，并且 其因呼吸系统肿瘤致死的几率也大大增加。动物模型、体外模型试验也发现，镍可以诱导肿 瘤的发生。1990年，国际癌症研究机构（InternationalAgencyforResearchonCancer， IARC)已将镍化合物作为第一类致癌物质（Group1)，将金属镍作为2B类致癌物质（Group 2B)。可见，镍严重威胁人体的健康。
[0008] 镍与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。 随着对镍毒性研究的深入，人们逐渐认识到镍与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重 要的角色，被认为是了解镍的毒性机理的关键所在，因此，对镍和蛋白质相互作用的研究就 显得愈发重要。而现在关于镍与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与镍之 间的关系还不清楚，因而加强对于镍与蛋白质之间的关系至关重要。
【发明内容】
[0009] 针对镍污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种镍-白蛋白螯合物及其制备 方法，并建立镍-白蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测镍-白蛋白螯合物在 评价一个地区镍污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中镍-白蛋白螯合物可 以间接反映这个地区人群受镍污染的情况，从而间接反映这个地区镍污染程度。
[0010] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种镍-白蛋白螯合物，镍离 子与白蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
[0011] 本发明还提供一种上述的镍-白蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：
[0012] A)镍与白蛋白的螯合反应：在提纯源于人体的白蛋白或按照生物学方法重组的 白蛋白中加入镍离子进行螯合反应，得到反应溶液；
[0013] B)纯化镍_白蛋白螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应 的白蛋白以及多余的镍离子，即得镍-白蛋白螯合物。
[0014] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
[0015] (1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使镍-白蛋白螯合 物复溶；
[0016] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与白蛋 白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0017] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，白蛋白 与填料特异性结合；
[0018] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I;
[0019] (5)收集：收集洗脱液I ;
[0020] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0021] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与镍特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0022] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱；
[0023] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II;
[0024] (10)收集：收集洗脱液II;
[0025] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH20透析除盐，换水三 次后，4 °C透析过夜，收集样本，即得镍-白蛋白螯合物。
[0026] 其中，上述镍-白蛋白螯合物的制备方法，还包括步骤C):对镍-白蛋白螯合物的 鉴定；
[0027] 其中，步骤C)中具体如下：
[0028] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0029] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的镍-白蛋白螯合物，加入稀释缓冲液，并混 匀，然后加样于样品槽中；
[0030] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0031] (4)检测：在胶床上找出含镍的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有镍以及检测镍的含量。
[0032] 本发明还提供一种如上述的镍-白蛋白螯合物在制备检测人体内镍-白蛋白螯合 物的试剂或试剂盒中的应用。
[0033] 本发明还提供一种至少包括如上述的镍-白蛋白螯合物作为标准品的试剂盒。
[0034] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获白蛋白的物质或捕获镍的 物质。
[0035] 本发明还提供一种定量检测镍-白蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述的 镍-白蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫 与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯镍-白蛋白螯合 物与酶联免疫结合法、提纯镍-白蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯镍-白蛋白螯合 物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体 质谱结合法。
[0036] 实施本发明的镍-白蛋白螯合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
[0037] 1.本发明首次体外合成镍-白蛋白螯合物；
[0038] 2.本发明首次提出镍-白蛋白螯合物可用于制备检测血样中镍-白蛋白螯合物的 试剂或试剂盒中的应用。
[0039] 3.本发明建立了镍-白蛋白螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测镍-白蛋 白螯合物在评价一个地区镍污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中镍-白 蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受镍污染的情况，从而间接反映这个地区镍污染程 度。本发明建立的镍-白蛋白螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复 性得到大大提高。
【附图说明】
[0040] 图1为本发明所述的镍-白蛋白螯合物的非变性电泳条带图；
[0041] 图2为本发明所述的镍-白蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分析图。
【具体实施方式】
[0042] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0043] 本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可以通过市购方式 获得：
[0044] 磷酸盐溶液为 0? 05-0.lmol/LNa2HP04溶液或 0? 5-lmol/LNa2HP04溶液；
[0045] 提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0046] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种；
[0047] 捕获白蛋白的物质为Abeam公司生产的型号为abl06349的Anti-人类Serum Albumin抗体；其中，本发明所述与白蛋白特异性结合的物质、抗HSA抗体、抗白蛋白抗体均 为捕获白蛋白的物质；
[0048] 捕获镍的物质购买自广州然科生物科技有限公司的型号为RK14419的鼠抗Ni mAb;其中，本发明所述与镍特异性结合的物质、抗Ni抗体、抗镍抗体、镍抗均为捕获镍的物 质；
[0049] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0050] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0051] 洗涤液为含有KH2P040 . 2mg/ml、Na2HP04 ? 12H20 2. 90mg/ml、NaCl8.Omg/ml、KC1 0? 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的pH为 7. 4 的 0? 15MPBS溶液；
[0052] 封闭液为1% -5 %牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
[0053] 稀释缓冲液为含 1. 5mg/mLNa