组0D值均低于其他几组，说明该浓度洗脱液洗脱效果最优（即将ELISA孔 壁上结合的抗NiAb-酶标复合物洗脱程度达到最大，因而0D值最低）；而洗脱时间不管是 lh、2h、3h，各组0D值变化均不大，可见随着时间的延长，酶活力逐渐减弱，在酶浓度不变的 情况下，延长消化时间并不能提高消化率，所以本试验中洗脱液的洗脱时间为l_3h皆可。
[0221] 应用实施例1
[0222] 取采用ELISA法检测100份标本血浆中的镍-白蛋白螯合物，按照以下步骤进行 检测：酶联免疫法（ELISA法）检测镍-白蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
[0223] 1)将抗HSAAb包被于固相载体上：用稀释缓冲液将抗HSAAb稀释至2000倍，加 入ELISA板微孔中，37°C水浴1小时，储存冰箱；
[0224]2)从循环系统取全血，作待检样品，lOOOrmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀， lOOOrmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀，lOOOrmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀，lOOOrmp离心 5-8分钟，离心弃去沉淀；
[0225] 3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加2%牛血清白 蛋白作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA 板于37°C放置1小时；
[0226] 4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的镍-白蛋白 螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释将待检样品稀释至20倍，加入微孔中，37°C作用1小 时；
[0227] 5)加入可以捕获镍的物质，并且温育：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗 涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释10000倍，37°C作用1小时，使抗NiAb与白蛋白上的金 属镍反应；
[0228] 6)酶结合物温育：移去抗镍抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀 释缓冲液稀释的HRP酶标抗体，37°C作用1小时，使其与酶标抗体反应；
[0229] 7)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物， 37°C避光作用30分钟；
[0230] 8)终止反应：将终止液滴加至每一微孔；
[0231] 9)取波长为405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读取待检 样品0D值（也可不使用酶标仪，直接通过显色情况进行定性检测），具体检测值如表5所 不。
[0232] 表5 :100份血样标本中镍-白蛋白螯合物的ELISA检测结果
[0233]
[0235]应用实施例2
[0236] 采用酶联免疫与原子吸收光谱结合法（ELISA法+AAS法）检测100分标本血样中 的镍-白蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
[0237] 1)将能够捕获白蛋白的物质，如抗白蛋白抗体（抗HSAAb)包被于固相载体上： 用稀释缓冲液将抗HSAAb稀释至2000倍，加入ELISA板微孔中，4°C过夜18小时；
[0238] 2)从循环系统取全血，作待检样品，lOOOrmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀， lOOOrmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀，lOOOrmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀，lOOOrmp离心 5-8分钟，离心弃去沉淀；
[0239] 3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入2%牛血清 白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤 完成后，ELISA板于37°C放置1小时；
[0240] 4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的镍-白蛋白 螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至20倍，加入微孔中，37°C作用1小时；
[0241] 5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入木瓜蛋白酶浓 度为100ng/ml的洗脱液，洗脱1-3小时；
[0242] 6)检测：从ELISA板的微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于白蛋白上的镍， 检测值如表6所示。
[0243] 表6 :100份血样标本中镍-白蛋白螯合物的AAS检测结果
[0244]
[0246] 应用实施例3
[0247] 采用酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法（ELISA法+ICP-MS法）检测100 分标本血样中的镍-白蛋白螯合物含量，按照如下步骤检测：
[0248] 1)将能够捕获白蛋白的物质，如抗白蛋白抗体（抗HSAAb)包被于固相载体上： 用稀释缓冲液将抗HSAAb稀释至2000倍，加入ELISA板微孔中，4°C过夜18小时；
[0249] 2)取100份标准血样作为待检样品；
[0250] 3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入2%牛血 清白蛋白作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后， ELISA板于37°C放置1小时；
[0251] 4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的镍-白蛋白 螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至20倍，加入微孔中，37°C作用1小时；
[0252] 5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入木瓜蛋白酶浓 度为100ng/ml的洗脱液，洗脱1-3小时；
[0253] 6)酸化：在步骤5)中的溶液中加入硝酸对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化，加 入过氧化氢，并且加热赶酸；
[0254] 7)检测：从步骤6)得到的溶液中取样，于电感耦合等离子体质谱仪下检测螯合于 白蛋白的镍，检测值如表7所示。
[0255] 表7 :100份血样标本中镍-白蛋白螯合物的ICP-MS检测结果
[0256]
[0258] 对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种 相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围 之内。
【主权项】
1. 一种镍-白蛋白螯合物，其特征在于，镍离子与白蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基 螯合而成。2. -种如权利要求1所述的镍-白蛋白螯合物的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： A) 镍与白蛋白的螯合反应：在提纯源于人体的白蛋白或按照生物学方法重组的白蛋 白中加入镍离子进行螯合反应，得到反应溶液； B) 纯化镍-白蛋白螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的白 蛋白以及多余的镍离子，即得镍-白蛋白螯合物。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于， 所述步骤B)具体如下： (1) 溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使镍-白蛋白螯合物复 溶； (2) 平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与白蛋白特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱； (3) 上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，白蛋白与填 料特异性结合； (4) 洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷酸盐 溶液进行洗脱，得到洗脱液I ; (5) 收集：收集洗脱液I ; (6) 透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后， 4 °C透析过夜，收集样本； (7) 平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与镍 特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱； (8) 上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱； (9) 洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷酸盐 溶液进行洗脱，得到洗脱液II ; (10) 收集：收集洗脱液II ; (11) 透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后， 4°C透析过夜，收集样本，即得镍-白蛋白螯合物。4. 根据权利要求2所述的镍-白蛋白螯合物的制备方法，其特征在于，还包括步骤C): 对镍-白蛋白螯合物的鉴定； 其中，步骤C)中具体如下： (1) 制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床； (2) 加样：取步骤B)中提取纯化得到的镍-白蛋白螯合物，加入稀释缓冲液，并混匀， 然后加样于样品槽中； (3) 电泳：连接电泳板，进行电泳； (4) 检测：在胶床上找出含镍的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有镍以及检测镍的含量。5. -种如权利要求1所述的镍-白蛋白螯合物在制备检测血样中镍-白蛋白螯合物的 试剂或试剂盒中的应用。6. -种至少包括如权利要求1所述的镍-白蛋白螯合物作为标准品的试剂盒。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括包被液，该包被液含有捕获白蛋 白的物质或捕获镍的物质。8. -种定量检测镍-白蛋白螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的权利要求1所述 的镍-白蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免 疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯镍-白蛋白螯 合物与酶联免疫结合法、提纯镍-白蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯镍-白蛋白螯 合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子 体质谱结合法。
【专利摘要】本发明公开了一种镍-白蛋白螯合物及其制备方法和应用，该镍-白蛋白螯合物是镍离子与白蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。本发明建立了镍-白蛋白螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测镍-白蛋白螯合物在评价一个地区镍污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中镍-白蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受镍污染的情况，从而间接反映这个地区镍污染程度。本发明建立的镍-白蛋白螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。
【IPC分类】G01N27/447, G01N1/28, G01N27/62, G01N21/31, G01N33/53
【公开号】CN105021549
【申请号】CN201510411356
【发明人】张积仁, 阳帆, 董欣敏, 吴婧, 蔡睿, 孙遥, 赵乙木
【申请人】上海拜豪生物科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月14日