分钟，离心弃去沉淀，lOOOrmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀，lOOOrmp离心 5-8分钟，离心弃去沉淀；
[0110] 3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以1% -5% 牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗 涤，洗涤完成后，ELISA板于36. 5-37. 5°C放置1-2小时；
[0111] 4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的镍-白蛋白 螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至10-40倍，加入微孔中，37°C作用1-2小 时；
[0112] 5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入洗脱液，在 37°C下洗脱1-3小时。
[0113] 6)检测：从ELISA板的微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于白蛋白上的镍， 并绘制标准曲线，读出数值；
[0114] 该方法利用ELISA原理的基础上结合原子吸收光谱（AAS)原理，利用原子吸收光 谱仪检测螯合于白蛋白上的镍，由于溶液中仅含有白蛋白，且所用试剂中不含任何重金属 (阴性对照组结果为阴性），不会对结果造成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即 可证明检测出白蛋白上螯合的金属镍。
[0115] 方法三：酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法（ELISA法+ICP-MS法）检测 镍-白蛋白螯合物按照如下步骤检测：
[0116] 1)将能够捕获白蛋白的物质，如抗白蛋白抗体（抗HSAAb)包被于固相载体上：用 稀释缓冲液将抗HSAAb稀释至1000-8000倍，加入ELISA板微孔中，4°C过夜16-18小时， 或37°C水浴1-3小时，储存冰箱；
[0117] 2)从循环系统取全血，作待检样品，lOOOrmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀， lOOOrmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀，lOOOrmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀，lOOOrmp离心 5-8分钟，离心弃去沉淀；
[0118] 3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以1% -5% 牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗 涤，洗涤完成后，ELISA板于36. 5-37. 5°C放置1-2小时；
[0119] 4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的镍-白蛋白 螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至10-40倍，加入微孔中，37°C作用1-2小 时；
[0120] 5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入洗脱液，在 37°C下洗脱1-3小时。
[0121] 6)酸化：在步骤5)中的溶液中加入酸化剂对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化， 加入过氧化氢，并且加热赶酸；
[0122] 7)检测：从步骤6)的ELISA板的溶液中取0. 5ml液体，于电感耦合等离子体质谱 仪下检测螯合于白蛋白的镍，并绘制标准曲线，读出数值。
[0123] 该方法在利用ELISA原理的基础上，结合感耦合等离子体质谱（ICP-MS)原理，用 电感耦合等离子体质谱仪检测螯合于白蛋白上的镍，由于溶液中仅含有白蛋白，且所用试 剂中不含任何重金属（阴性对照组结果为阴性），不会对结果造成干扰，因而当所读取的结 果显示为阳性时，即可证明检测出白蛋白上螯合的金属镍。
[0124] 方法四：提纯镍-白蛋白螯合物与酶联免疫结合法(提纯法+ELISA法）检测 镍-白蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
[0125] 1)从全血中提取白蛋白：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超滤或凝 胶过滤等方法从全血提取纯化血液中的白蛋白，并将白蛋白复溶于溶液中，得到白蛋白溶 液；
[0126] 2)将抗NiAb包被于固相载体上：用稀释缓冲液将抗NiAb稀释至5000-40000 倍，加入ELISA板微孔中，4°C过夜16-18小时，或37°C水浴1-3小时，储存冰箱；
[0127] 3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以1% -5% 牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗 涤，洗涤完成后，ELISA板于36. 5-37. 5°C放置1-2小时；
[0128] 4)加待检样品，并且温育：从步骤1)中的溶液中取样，作待检样品；以已知含量 的镍-白蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释待检样品稀释至10-40倍，加入微孔中， 37°C作用1-2小时；
[0129] 5)酶结合物温育：移去步骤4)中的待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成 后，加入用稀释缓冲液稀释的酶标抗体，使稀释的酶标抗体的浓度为2yg/mL，，37°C作用 1-2小时，使其与酶标抗体反应；
[0130] 6)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物， 37°C避光作用30分钟；
[0131] 7)终止反应：将终止液滴加至每一微孔；
[0132] 8)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读取待检样 品和标准品的0D值，通过绘制标准曲线，求得待检样品的含量（也可不使用酶标仪，直接通 过显色情况进行定性检测）。
[0133] 方法五：提纯镜-白蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法（提纯法+AAS法）检测血 样中镍_白蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
[0134] 1)从全血中提取白蛋白：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超滤或凝 胶过滤等方法从全血提取纯化血液中的白蛋白，并将白蛋白复溶于溶液中，得到白蛋白溶 液；
[0135] 2)检测：从步骤1)得到的溶液中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于白蛋白上的 镍，并绘制标准曲线，读出数值。
[0136] 方法六：提纯镍_白蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法（提纯法 +ICP-MS法）检测镍-白蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
[0137] 1)从全血中提取白蛋白：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超滤或凝 胶过滤等方法从全血提取纯化血液中的白蛋白，并将白蛋白复溶于溶液中，得到白蛋白溶 液；
[0138] 2)酸化：从步骤1)得到的溶液中取样，在溶液中加入酸化剂（如硝酸）对溶液进 行酸化，封口过夜，彻底酸化，加入过氧化氢，并且加热赶酸；
[0139] 3)检测：从步骤2)得到的溶液中取0. 5ml液体，于电感耦合等离子体质谱仪下检 测螯合于白蛋白上的镍，并绘制标准曲线，读出数值。
[0140] 方法七：电泳与酶联免疫法或原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱结合法 (电泳法-ELISA法/AAS法/ICP-MS法）检测镍-白蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
[0141] 1)从全血中提取白蛋白：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超滤或凝 胶过滤等方法从全血提取纯化血液中的白蛋白，并将白蛋白复溶于溶液中，得到白蛋白溶 液；
[0142] 2)制备胶床：根据需要选择琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶或SDS-聚丙烯酰胺凝 胶等作为介质，按照常规方法制备好胶床；
[0143] 3)加样：取步骤1)得到的溶液8yL加入2yL上样缓冲液，混匀，短暂离心；（注 意此处步骤不能煮）
[0144] 4)电泳：连接电泳板，进行电泳分离；
[0145] 5)检测：在胶床上找出含有镍的蛋白条带，将该条带取出，将该蛋白条带溶于液 体之中，然后再分别利用ELISA或ICP-MS或AAS检测溶于液体中的镍含量。此外，还可以 利用此方法检测螯合镍的白蛋白的等电点、分子量及含量等。
[0146] 方法七中的白蛋白可以用多种方法提纯出来（例如超速离心法或高压液相层析 法或凝胶过滤层析法或凝胶电泳法或ELISA方法等），将提纯出来的白蛋白复溶于溶液中， 取一定量的白蛋白，利用电荷移动原理，进行电泳（electrophoresis，EP)，在凝胶板（可根 据需要采用不同介质）上可根据分子量、等电点等不同跑出不同的条带，寻找出富含镍的 相应条带，将凝胶中的蛋白质复溶于溶液中，即可以在特定波长下检测相关白蛋白的含量， 也可以利用ELISA或AAS或ICP-MS等原理检测出螯合于白蛋白上的镍含量，由于溶液中仅 含有白蛋白，且所用试剂中不含任何重金属（阴性对照组结果为阴性），不会对结果造成干 扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出白蛋白上螯合的金属镍。
[0147] 实施例1:镜-白蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：
[0148] A)镍与白蛋白的螯合反应：在人源的白蛋白中加入镍离子进行螯合反应，得到反 应溶液；
[0149] 试剂配制：
[0150] 1)硼酸盐缓冲液（0. 01M):称取0. 31g硼酸溶于400ml超纯水中，用0. 1M的NaOH 调节pH至9. 0,定容至500mL。
[0151] 2)白蛋白溶液：称取4.Omg白蛋白溶于4.OmL0. 01MpH9. 0硼酸盐缓冲液中，充 分振荡溶解，配制成1.Omg/mL的蛋白溶液；
[0152] 3)EDTA-NaHC03 混合溶液：称取EDTA? 2H20 1. 86g、NaHC0316. 8g溶于 900mL超纯 水中，用1. 〇MNaOH调整pH至8. 0定容至1000ml，高压灭菌，室温保存；
[0153] 4)ITCBE购买自日本同仁化学研究所，货号为M030 ;
[0154] 5)透析袋购自BioshopInc，截留分子量14000。
[0155] 镍-白蛋白螯合物的螯合步骤：
[0156] 1)透析袋的处理：将透析袋放入500ml的EDTA-NaHC(V混合溶液中，煮沸10min; 倾弃EDTA/NaHC(V液，用超纯水轻轻漂洗，再用500ml的5mmol/LEDTA溶液煮沸10min;弃 掉煮沸液，用超纯水彻底清洗，加入超纯水浸泡透析袋4°C过夜。使用时，戴上手套，取出透 析袋，用超纯水彻底冲洗其内外表面；
[0157] 2)取 2.OmgITCBE溶于 2mlDMS0 中；
[0158] 3)取4.Omg白蛋白溶于4. 0ml硼酸盐缓冲溶液中；
[0159] 4)缓慢将步骤2)配制的液体加入步骤3)配制的白蛋白溶液中，边滴加边震荡，置 于温度为25°C，转速为lOOr/min的摇床中反应24h，然后用透析袋