专利名称：抗体与微珠连接方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体与微珠连接方法。
背景技术：
自1979年将聚苯乙烯微珠成功磁化并与抗体连接后，即成为一种效果极佳的分离方法，引发了生物分离技术上的一次革命。该方法具有以下优点:(1)分离速度快、效率高、可重复性好；(2)操作简单、不需要昂贵的仪器设备；(3)比表面积大，可提高检测灵敏度；(4)不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能。随着科学技术的发展以及纳米技术的推广，纳米材料已在生命科学研究领域发挥了重要作用。磁性纳米微珠作为一种新型的纳米技术，已经成功应用于核酸提取、废水处理、靶向药物、食品安全检测等系统上，并取得一定的进展。包被技术的进步能大大扩展磁性微珠的应用范围。因此，研究微珠表面的连接技术与方法，将使其运用至更广阔的分离、检测领域，并将极大地提高检测灵敏度。食品安全事关广大人民群众的身体健康，受到政府和老百姓的高度关注。近年来食品质量问题十分突出，非法使用违禁药物、滥用抗生素，超量超范围使用兽药等都对群众身体健康造成了很大危害。针对以上问题，一方面要加强监管；另一方面要开发特异性的快速分离、检测方法。对磁性微珠表面包被特异性的抗体将是一种较为简便且高效的检测方面。包被方法多样，较为常用的是将抗体直接通过基团作用固定至微珠表面。然而此种方法灵敏度有限，抗体在微珠上的非特异性吸附将大大降低其检测效果。
发明内容
本发明要解 决的技术问题是提供一种能提高检测灵敏度的抗体与微珠连接方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗体与微珠连接方法，包括以下步骤:1)、抗体与核苷酸交联:A、抗体的修饰与脱盐:25 lOOu g免疫球蛋白(Immunoglobulin,简称IgG)稀释成浓度为2 8mg/mL后与 SANH (Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone)均勻混合后，于20 30°C的摇床中孵育修饰2 6小时，SANH与免疫球蛋白的摩尔比为10 70:1 ;将所得的抗体修饰产物经洗涤、离心过滤，以除去多余的SANH ;得脱盐后的抗体修饰产物；测IgG的蛋白浓度，待用(目的是:计算修饰、脱盐步骤后抗体的回收率，避免因为超滤膜或操作问题导致样品过分损失。)B、核苷酸的修饰与脱盐:用pH7.0 7.6的磷酸缓冲液将核苷酸(寡核苷酸)稀释至6 12mg/mL，加入SFB(Succinimidyl 4-formylbenzoate)均勻混合,于20 30°C的摇床中孵育修饰2 6小时，SFB与核苷酸(寡核苷酸)的摩尔比为10 70:1 ;备注说明:上述核苷酸序列为GGGAA ATCTC TGCAG GCAAA TGTGA (5， 3’)，3’端修饰了氨基；将所得的核苷酸修饰产物经洗涤、离心、过滤，以除去多余的SFB ;得脱盐后的核苷酸修饰产物；测核苷酸浓度，待用(目的是计算修饰、脱盐步骤后寡聚核苷酸的回收率，避免因为超滤膜或操作问题导致样品过分损失。)C、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化将脱盐后的抗体修饰产物(为修饰成功的脱盐后的抗体修饰产物)和脱盐后的核苷酸修饰产物(为修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物)按照1:8 12的摩尔比均匀混合，于2 8°C充分反应8 24小时，将所得的交联后产物经洗涤、离心、过滤，除去游离寡核苷酸并进行脱盐；得纯化后的抗体一核苷酸交联体 ；在350nm下测定吸光值，待用(抗体和寡核苷酸的修饰基团在交联的过程中生成稳定存在的腙键，该腙键在350nm下有特异吸收峰；因此测定350nm是否有明显吸收峰生成是验证交联成功的有力证明；通过测定350nm下特异吸收峰值，可进一步计算出交联产物的浓度);2)、抗体一核苷酸交联体与微珠作用:微珠先经洗涤液洗涤，然后静置；将I 9Xl(Tnmol biotin 修饰的核苷酸(序列为 TCACA TTTGC CTGCA GAGATTTCCC5’ 3’，3’ biotin修饰)加入5 15 y I的Neutravidin包被的磁珠，于20 30°C的摇床孵育10 30分钟，接着用洗涤液洗涤；随后加入上述5 IOX 10_13mol纯化后的抗体一核苷酸交联体，在6XSSPE缓冲液(pH6.0)条件下于20 30°C的摇床孵育I 4小时，再用洗涤液洗涤；得微珠体系；所述洗涤液为将BSA用PBS溶液(pH7.4)稀释至质量浓度为0.1 0.5%而得。备注说明:步骤A所得的脱盐后的抗体修饰产物和步骤B所得的脱盐后的核苷酸修饰产物分别通过对硝基苯甲醛与2-肼吡啶二盐酸盐鉴定基团修饰是否成功；方法为各取少量脱盐后的抗体修饰产物或脱盐后的核苷酸修饰产物，分别加入过量对硝基苯甲醛、2-肼吡啶二盐酸盐，避光孵育后，测定产物基团在特定波长下的吸光值。当抗体鉴定产物在390nm下有特异吸收峰，则判定修饰成功；当寡核苷酸鉴定产物在350nm下有特异吸收峰，则判定为修饰成功。作为本发明的抗体与微珠连接方法的改进:将所得的微珠体系进行如下步骤:在Cy3标记的荧光二抗或转基因蛋白中加入微珠体系，在20 30°C条件下摇床孵育I 4小时；接着用PBS (pH7.4)洗去未结合的荧光二抗或转基因蛋白，最后用荧光显微镜观察结果。备注说明:在荧光显微镜下观察到荧光信号，则证明抗体已成功通过寡核苷酸的“联系”连接到了磁珠的表面。作为本发明的抗体与微珠连接方法的进一步改进:Cy3标记的荧光二抗与PBS缓冲液(pH7.4)的体积比为:1:10 30。作为本发明的抗体与微珠连接方法的进一步改进:
步骤I) A中:摇床的转速为50 150转/分；用pH8的0.1mM的EDTA溶液进行洗漆;步骤I )B中:摇床的转速为50 150转/分；用pH8的0.1mM的EDTA溶液洗涤；步骤I) C中:将所得的交联后产物用pH8的0.1mM的EDTA溶液洗涤。在步骤I)的A中:孵育完后收集修饰产物，将产物移入密理博的YM-100 (截留分子量大于IOOOOKDa的生物分子)滤管里面，用PH8的0.1mM的EDTA溶液洗涤、离心过滤2 4次，除去多余的SANH修饰剂，然后倒扣滤管离心，收集脱盐后的修饰产物。测IgG的蛋白浓度，待用。在步骤I)的B中:孵育完后收集修饰产物，将产物移入密理博的YM-3 (截留分子量大于3000KDa的生物分子)滤管里面，用PH8的0.1mM的EDTA溶液洗涤、离心过滤2 4次，除去多余的SFB修饰剂，然后倒扣滤管离心，收集脱盐后的核苷酸修饰产物。测核苷酸浓度，待用。在步骤I)的C中:由于交联后产物需要再次纯化，交联完后收集交联后产物，将产物移入密理博的YM-100 (截留分子量大于IOOOOKDa的生物分子)滤管里面，用pH8的0.1mM EDTA溶液洗涤、离心过滤2 4次，除去未交联的多余的核苷酸单体，然后倒扣滤管离心，收集纯化后交联产物。在350nm下测定吸光值，待用。在本发明中，任意一种抗体均可被固定到微珠上；与抗体交联的寡核苷酸长度一般在20-23个碱基，3’端修饰氨基，从而能够通过本发明所述的方法与抗体交联。选用的磁珠预先包被了抗生物素蛋白 ；与磁珠表面连接的寡核苷酸必须与抗体交联的寡核苷酸对应互补，并在3’端修饰有生物素，从而能够如本发明的方法与磁珠表面连接。具体而言，本发明开发了一种新型的抗体与微珠相连的方法，成功的对抗体与核苷酸进行交联，并保持其良好活性。本发明的连接方法是将带有生物素(biotion)的互补核苷酸链与包被有亲和素(Neutravidin)微珠连接后,通过两条核苷酸链杂交的方式,将抗体-核苷酸交联体连接到微珠表面来完成抗体与微珠的相连，最后以Cy3标记的二抗鉴定是否连接成功。具体原理如图1所示。本发明的抗体与微珠交联方法:包括抗体与核苷酸交联，核苷酸与微珠结合，核苷酸互补链杂交等流程。抗体与核苷酸交联包括抗体的修饰与脱盐、核苷酸的修饰与脱盐、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化等步骤。本发明是以双功能基团为核苷酸和抗体作修饰，通过醛基与氨基使其结合形成腙键结合。在本发明中，核苷酸与微珠的结合是由微珠上包被的亲和素与核苷酸链上修饰的生物素特异性吸附完成的；核苷酸互补链杂交通过特定的杂交液在一定温度条件下完成；通过Cy3标记的二抗在特定温度条件下孵育鉴定微珠上反应是否成功。本发明的抗体与微珠连接方法，具有如下优点:1、寡核苷酸作为“支撑臂”，将抗体与磁珠表面隔开一定距离，有利于避免抗体遭结构破坏，保护抗体活性。2解决了抗体固定于固相载体时的活性基团衍向问题。3、提高抗体与其他物质反应的灵活性。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1为抗体与微珠交联方法原理图。图2为抗体与微珠成功交联后荧光二抗鉴定图像。
具体实施例方式实施例1、兔免疫球蛋白(IgG)与磁珠的连接:I)、兔免疫球蛋白(IgG)与核苷酸交联A、兔免疫球蛋白(IgG)的修饰与脱盐将50 U g的兔免疫球蛋白(Rabbit Immunoglobulin,简称Rabbit IgG)用修饰缓冲液(IOOmM磷酸盐、150mM氯化钠，pH7.2-7.4)稀释成浓度为6mg/mL ;然后用SANH溶液(浓度为 6.89Xl(T2mol/L)修饰，SANH 与 Rabbit IgG 的摩尔比为 60:1。将 SANH 溶液与 RabbitIgG溶液均匀混合后，放置于25°C的摇床中，以100转/分钟的转速孵育修饰4小时。孵育完后将产物移入密理博的YM-100滤管里面，用pH8的0.1mM EDTA溶液洗涤、离心(5000转/分)过滤3次，以除去多余的SANH修饰剂，然后倒扣滤管离心(5000转/分)，收集脱盐后的抗体修饰产物。测Rabbit IgG的蛋白浓度为2.44mg/mL,待用。将以上步骤所得的脱盐后的抗体修饰产物取少量，通过与对硝基苯甲醛(4-nitrobenzaldehyde)反应鉴定基团修饰是否成功(反应如下)；
权利要求
1.抗体与微珠连接方法，其特征是包括以下步骤: 1)、抗体与核苷酸交联: A、抗体的修饰与脱盐: 25 100 ii g免疫球蛋白稀释成浓度为2 8mg/mL后与SANH均匀混合后，于20 30V的摇床中孵育修饰2 6小时，SANH与免疫球蛋白的摩尔比为10 70:1 ； 将所得的抗体修饰产物经洗涤、离心过滤，以除去多余的SANH ;得脱盐后的抗体修饰产物； B、核苷酸的修饰与脱盐: 用pH 7.0 7.6的磷酸缓冲液将核苷酸稀释至6 12 mg/mL，加入SFB均匀混合，于20 30 °C的摇床中孵育修饰2 6小时，SFB与核苷酸的摩尔比为10 70:1 ; 将所得的核苷酸修饰产物经洗涤、离心、过滤，以除去多余的SFB ;得脱盐后的核苷酸修饰产物； C、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化 将脱盐后的抗体修饰产物和脱盐后的核苷酸修饰产物按照1:8 12的摩尔比均匀混合，于2 8 V充分反应8 24小时， 将所得的交联后产物经洗涤、离心、过 滤，除去游离寡核苷酸并进行脱盐；得纯化后的抗体一核苷酸交联体； 2)、抗体一核苷酸交联体与微珠作用: 微珠先经洗涤液洗涤，然后静置； 将I 9X ICT11 mo I biotin修饰的核苷酸加入5 15 U I的Neutravidin包被的磁珠，于20 30 °C的摇床孵育10 30分钟，接着用洗涤液洗涤；随后加入上述5 IOX 10_13mo I纯化后的抗体一核苷酸交联体，在6X SSPE缓冲液(pH 6.0)条件下于20 30 °C的摇床孵育I 4小时，再用洗涤液洗涤；得微珠体系； 所述洗涤液为将BSA用PBS溶液(pH 7.4)稀释至质量浓度为0.f 0.5 %而得。
2.根据权利要求1所述的抗体与微珠连接方法，其特征是: 将所得的微珠体系进行如下步骤: 在Cy3标记的荧光二抗或转基因蛋白中加入微珠体系，在20 30 1:条件下摇床孵育I 4小时；接着用PBS (pH 7.4)洗去未结合的荧光二抗或转基因蛋白，最后用荧光显微镜观察结果。
3.根据权利要求1或2所述的抗体与微珠连接方法，其特征是: 所述步骤I) A中:摇床的转速为50 150转/分；用pH 8的0.1 mM的EDTA溶液进行洗涤； 所述步骤I) B中:摇床的转速为50 150转/分；用pH 8的0.1 mM的EDTA溶液洗涤； 所述步骤I) C中:将所得的交联后产物用pH 8的0.1 mM的EDTA溶液洗涤。
全文摘要
本发明公开了一种抗体与微珠连接方法，包括抗体与核苷酸交联，核苷酸与微珠结合，核苷酸互补链杂交等流程。抗体与核苷酸交联包括抗体的修饰与脱盐、核苷酸的修饰与脱盐、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化等步骤。本发明是以双功能基团为核苷酸和抗体作修饰，通过醛基与氨基使其结合形成腙键结合。在本发明中，核苷酸与微珠的结合是由微珠上包被的亲和素与核苷酸链上修饰的生物素特异性吸附完成的；核苷酸互补链杂交通过特定的杂交液在一定温度条件下完成；通过Cy3标记的二抗等在特定温度条件下孵育鉴定微珠上反应是否成功。 本发明以寡核苷酸作为“支撑臂”，将抗体与磁珠表面隔开一定距离，有利于避免抗体遭结构破坏，保护抗体活性。
文档编号C07K17/00GK103159854SQ201310072939
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者郑晓冬, 殷赟, 沙莎 申请人:浙江大学