一种人重组Irisin蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种人Irisin重组蛋白的DNA序列。本发明还公开了一种人Irisin重组蛋白。本发明还公开了人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。本发明还公开一种转基因重组菌。本发明还公开了一种人Irisin重组蛋白的制备方法。本发明还公开了一种人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。本发明所提供的方法步骤简便，生产成本低，生产周期短，通过本发明所提供的方法，可得到纯度较高的目的蛋白。
【专利说明】
一种人重组I r i s i η蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域中重组基因的真核表达和纯化方法，特别涉及一种人重 组Irisin蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化方法。
【背景技术】
[0002] Irisin是2012年年初在《自然》杂志上报道的一种新的肌肉因子，是蛋白水解酶剪 切III型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectin type III domain-containing protein 5，FNDC5)后形成的可分泌多肽片段。人FNDC5的N-端有一个信号序列，中间为III型纤连蛋 白结构域(FND)，紧接其后的为疏水氨基酸区和C-末端。Irisin是FNDC5中纤连蛋白结构域 的主要部分，是由112个氨基酸残基组成的N-糖基化蛋白质激素，其序列在种属间高度保 守，人和小鼠的Iris in氨基酸序列同源性为100 %。
[0003] 发现者用希腊神话中信使女神Iris的名字为Irisin命名，暗喻其像Iris-样，作 为骨骼肌的使者，传递骨骼肌的信号，并连接骨骼肌与外周组织的关系。Irisin最重要的生 物学功能是通过内分泌、旁分泌和自分泌的方式作用于白色脂肪细胞，使后者转变为具有 分解代谢脂肪特征的棕色脂肪细胞，以产热的方式消除白色脂肪，从而起到减肥作用。研究 表明，Irisin水平主要反映了肌肉质量，且在年轻的男性运动员中其量高于老年女性;另有 研究表明，II型糖尿病患者的血清Irisin水平是降低的，并且与新发II型糖尿病的发病率 呈反比，表明Irisin可能在糖耐量和II型糖尿病中发挥关键作用；此外，有关报道还指出 Irisin与非酒精性脂肪肝、心率衰竭等病理现象存在一定的相关性。
[0004] 可以看出Irisin必将是一个很有前景的活性因子，并成为代谢性疾病及其并发症 防治的新靶点，有非常大的潜在价值。因此，开发Irisin蛋白的可大规模生产并便于纯化的 方法，具有非常大的价值。
[0005] 但是目前国内外还没有研究报道将该人重组Irisin蛋白用于毕赤酵母中的表达 与纯化。
【发明内容】
[0006] 发明目的:本发明的第一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白的DNA序列。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种人Irisin重组蛋白。
[0008] 本发明的又一个目的是提供含有所述的人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达 载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
[0009] 本发明的又一个目的是提供一种含有所述的人Irisin重组蛋白的转基因重组菌。
[0010] 本发明的又一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白的制备方法。
[0011] 本发明的又一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应 用。
[0012] 技术方案:为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种人Irisin重组蛋白 的DNA序列，其喊基序列如SEQ ID N0:1所不。
[0013] 一种人Irisin重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0014] 含有所述的人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转 基因重组菌。
[0015]将所述的DNA序列插入到毕赤酵母分泌表达载体中得到的表达人Irisin重组蛋白 的DNA的重组表达载体。
[0016] 其中，上述毕赤酵母分泌表达载体为PPIC9K。
[0017] -种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入毕赤酵母中，筛选 得到转基因重组菌(转基因重组酵母菌株）。
[0018] 其中，上述毕赤酵母为GS115(购自ivitrogen公司）。
[0019]其中，上述的DNA序列、重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产人 Iris in重组蛋白中的应用。
[0020 ] -种人Irisin重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0021] 1)从人肌肉组织中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为模板，PCR得到 人Irisin的基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0022] 2)经过PCR将His标签插入人Irisin的基因片段，得到人Irisin-his片段；
[0023] 3)构建口？1091(-11^8；[11-11丨8重组表达载体:将人11^8；[11-11丨8片段插入毕赤酵母分 泌表达载体pP IC9K，得到重组表达载体pP IC9K-1 r i s i n-h i s;
[0024] 4)构建 GS115-pPIC9K-Irisin_his 重组酵母菌株：重组表达载体 pPIC9K_Irisin-his电转化毕赤酵母GS115,并通过组氨酸缺陷筛选和G418筛选得到转基因重组酵母菌株 GS115-pPIC9K-Irisin-his；
[0025] 5)人Irisin重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定:通过甲醇诱导表达和镍柱纯化得 到人Irisin重组蛋白，并通过细胞活性试验鉴定其活性。
[0026] 上述的人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。
[0027] 有益效果:本发明相对于现有技术，具有以下优点:本发明所提供的人Irisin重组 蛋白的制备方法具有方法易行，操作简便，表达量高，成本低廉，通过本发明所提供的方法， 可得到具有生物学活性的人Irisin重组蛋白，可用于代谢性疾病药物的制备。其最主要优 势在于:本发明首次以毕赤酵母表达系统实现人Irisin重组蛋白的分泌表达，并通过镍柱 纯化，可得到了经过糖基化修饰且具有生物学活性的人Irisin重组蛋白。
【附图说明】
[0028] 图l:pPIC9K-Irisin-his重组载体酶切检验琼脂糖电泳分析图（第1泳道Μ为DNA相 对分子质量标准DL5000;第2泳道1为经EcoRI、NotI双酶切的pPIC9K-Irisin-his重组载体； 第3泳道2为未经酶切的pPIC9K-Irisin-his重组载体;经双酶切后产生一条Irisin-his条 带和一条大于5000bp的质粒条带，表明Irisin-his序列已成功插入表达载体;）
[0029] 图2:GS115-pPIC9K-Irisin-his重组菌株表型鉴定图（筛选得到的转基因重组酵 母菌株在MD和MM平板上都能正常生长，证明本发明所得菌株表型为Mut+);
[0030] 图3:GS115-pPIC9K-Irisin-his重组菌株表型PCR法鉴定琼脂糖电泳分析图（第1 泳道Μ为DNA相对分子质量标准DL5000;第2泳道1模板为GS115基因组；第3泳道2模板为 口卩1091(-11^8；[11-11丨8重组载体;第4~8泳道3-7模板为63115-。？1091(-11^8；[11-11丨8不同菌株 基因组；以GS115基因组为模板只扩增出一条约2200bp的野生A0X1基因片段，以pPIC9K-Irisin-his重组质粒为模板只扩增出一条约含有目的基因的约800bp的片段，而以GS115-pPIC9K-Irisin-his重组菌株的基因组为模板扩展出了 2200bp和800bp两个片段，说明其表 型为Mut+;)
[0031] 图4:GS115-pPIC9K-Irisin-his基因组PCR检验琼脂糖电泳分析图（第1泳道Μ为 DNA相对分子质量标准DL2000;第2~6泳道1-5为以不同转化子基因组做模板PCR产物;第7 泳道6为阴性对照;提取重组菌株基因组做PCR能得到与人Irisin-his大小相符的条带，说 明 pPIC9K-Irisin-his 成功转入 GS115;)
[0032] 图5:GS115-pPIC9K-Irisin-his诱导上清SDS-PAGE电泳分析图（第l泳道M为蛋白 相对分子质量标准；第2~5泳道1-4为GS115-pPIC9K诱导1-4天上清；第6~9泳道5-8为 63115-卩卩1〇91(-11^8；[11-1118诱导1-4天上清;63115-卩?1091(-11^8；[11-1118菌株的诱导上清中， 在14-29KDa之间含有四个大小不同的明显的蛋白条带，并且这四个条带随着诱导时间的增 加而逐渐增加；而空载体菌株GS115-pPIC9K的诱导上清中却没有明显条带；提示GS115-pPIC9K-Irisin-his菌株的诱导上清中可能含有人Irisin重组蛋白；）
[0033] 图6:GS115-pPIC9K-Irisin-his诱导上清镍柱纯化SDS-PAGE电泳分析图（第1泳道 Μ为蛋白相对分子质量标准;第2泳道1为诱导液上清;第3泳道2为过柱液;第4泳道3为20mM 咪唑洗涤液I;第5泳道4为50mM咪唑洗涤液II;第6泳道5为500mM咪唑洗脱液;诱导上清中含 有14-29KDa之间含有四个大小不同的明显的蛋白条带;过柱液中不含有蛋白条带，表明这 四个大小不同的蛋白条带均被镍柱所吸附；20mM咪唑的洗涤液I只洗涤下少量蛋白；为了提 高目的蛋白纯度，将洗涤液咪唑浓度提高到50mM，但在洗涤II中也只有少量蛋白；最后，用 含有500mM咪唑的洗脱液洗柱，发现洗脱液中包含了四个大小不同的明显的蛋白条带，表明 纯化得到这四个条带都有可能是目的蛋白；）
[0034]图7:人Irisin蛋白的糖基化位点分析图（序列中有两个可能的N -糖基化位点，其 中一个位点发生糖基化的可能性更是高达将近80%，因此，极有可能是重组蛋白发生了N-糖基化，才导致了大小不均一。）
[0035]图8:人Irisin重组蛋白去糖基化SDS-PAGE电泳分析图（第1泳道Μ为蛋白相对分子 质量标准;第2泳道1为重组蛋白；第3泳道2为去糖基化酶处理的重组蛋白；含有14-29KDa之 间四个大小不同条带的重组蛋白经过去糖基化酶处理之后，只含有14-20KDa之间两个条 带，说明重组蛋白确实发生了 N-糖基化;）
[0036] 图9:人Irisin重组蛋白的Western-Blot鉴定图（第1泳道1为诱导上清；第2泳道2 为纯化的重组蛋白；第3泳道3为去糖基化的重组蛋白；GS115-pPIC9K-Irisin-his重组菌株 的诱导上清在14-20KDa和20-29KDa位置均呈现出特异性条带，表明本发明所构建的重组菌 株可以实现人Irisin的重组表达;镍柱纯化得到重组蛋白在14-20KDa和20-29KDa位置均呈 现出特异性条带，而经糖基化处理的重组蛋白只在14_20KDa位置均呈现出特异性条带，通 过镍柱纯化得到的重组蛋白所包含的四个条带均为人Irisin重组蛋白，只是在表达过程中 发生了不同的剪切、蛋白的降解以及糖基化修饰产生了不同大小的重组蛋白；）
[0037] 图10: C2C12细胞经人Irisin重组蛋白处理后UCPlmRNA相对于内参β-actin表达量 柱状图（11^8；[11-为无人11^8；[11重组蛋白处理的阴性对照组；11^8；[11+500为500叫/1111^人 Iris in重组蛋白处理组；Tri sin+1000为1000ng/m丨，人Tri sin重组蛋内处理.钥.;Irisin+2000 为2000ng/mL人Irisin重组蛋白处理组;经人Irisin重组蛋白处理后C2C12细胞的UCPlmRNA 表达量明显提高，与对照组相比**p〈0.01，表明本发明得到的人Irisin重组蛋白具有生物 学活性。）
[0038] 图11:C2C12细胞经人Irisin重组蛋白处理后elovl3mRNA相对于内参β-actin表达 量柱状图（11^8；[11-为无人11^8；[11重组蛋白处理的阴性对照组；11^8；[11+500为5001^/1111^人 Iris in重组蛋白处理组；Tri sin+1000为1000ng/m丨，人Tri sin重组蛋内处理.钥.;Irisin+2000 为2000ng/mL人148111重组蛋白处理组 ；经人14 8 111重组蛋白处理后02(：12细胞的 elovl3mRNA表达量明显提高，与对照组相比#p〈0.01，表明本发明得到的人Irisin重组蛋 白具有生物学活性。）
【具体实施方式】
[0039] 实施例1:构建人Irisin重组蛋白的重组表达载体和转基因重组酵母菌株 [0040] 1.构建 pPIC9K-Irisin-his 重组表达载体
[0041 ] 从人肌肉中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNAAenbank已公布人Irisin的 mRNA序列(NM_153756)设计引物，以上述得到的cDNA为模板，做PCR得到人Irisin的全长⑶S 片段。把上述人Irisin的基因片段插入到pMD19-T载体中。命名为pMD19-T-Irisin，并测序 确定正确获取目的基因。
[0042] 根据人Irisin的全长CDS序列设计引物，其中上游引物P1引入EcoR頂每切位点，下 游引物P2、P3引入Hi s标签、终止密码子和No t頂每切位点：
[0043] Pl(Irisin-his-E-F) :5，一TAgaattcGACAGTCCCTCAGCCCCA-3，
[0044] P2(Irisin-his-1-R) :5'一GTGATGGTGATGGTGCTCTTTCATGGTTAC-3'
[0045] P3(Irisin-his-2-R):5'一TAgcggccgcTTAATGGTGATGGTGATGGTG-3'
[0046] 以pMD19-T-Irisin质粒为模板，用P1、P2引物进行PCR扩增。
[0047] PCR 体系为：
[0048]
[0049] 反应条件为：
[0050]
[0051 ]用1 %琼脂糖凝胶回收PCR产物，将其做为模板，用PI、P3引物进行PCR扩增。
[0052] PCR 体系：
[0053]
[0054]反应条件为：
[0055]
[0056] 用1%琼脂糖凝胶回收PCR产物，把PCR产物经EcoRI、NotI双酶切后，连接至经 EcoRI、NotI双酶切的pPIC9K载体，并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。转化后的DH5a涂含有 氨苄的LB平板进行筛选，37°C培养12h，挑取单菌落接种至3mL含有氨苄的LB液体培养基，37 °(：摇床培养12h，做菌液PCR鉴定后，抽取质粒用EcoRI、NotI双酶切鉴定，并进行测序以确定 正确构建载体，测序正确的重组表达载体命名为pPIC9K-Irisin-his。
[0057] 2.构建GS115-pPIC9K-Irisin-his转基因重组酵母菌株
[0058] 将上述构建好的pPIC9K-Irisin-his重组表达载体用SacI线性化，将10yg线性化 的质粒和80yL毕赤酵母GS115感受态细胞混合，经1500V，6ms电转之后涂MD平板，28°C培养 箱培养3-5天长出转化子。将所有转化子用无菌去离子水洗下涂含有不同浓度G418的YH)平 板，28°C培养箱培养3-5天，筛选高拷贝数的转化子。采取煮-冻-煮法提取转化子基因组，做 PCR鉴定，鉴定正确的高拷贝转化子命名为GS115-pPIC9K-Irisin-his。
[0059] 3.GS115-pPIC9K-Irisin-his转基因重组酵母菌株表型鉴定
[0060]用灭菌的牙签挑取经G418筛选的高抗性菌株，分别点种至MM和MD平板上，做好标 记，确保先在MM平板上点，在28°C培养箱中培养3~5d，查看生长状况，确定表型。另外用煮- 冻-煮法提取高抗性菌株基因组，以5 ' A0X1和3 ' A0X1引物用PCR方法鉴定重组菌株的表型。 两种方法均证明本发明所得到的重组菌株的表型为Mut+。
[0061]实施例2:人Irisin重组蛋白的诱导表达、纯化及活性鉴定 [0062] 1.用甲醇诱导表达人Irisin重组蛋白
[0063] 将转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-Irisin-his单菌落接种于3mLYro培养基 中，28°C摇床培养18h活化;将上述菌液按照1 %接种于BMGY培养基中，28 °C摇床培养16-20h 至0D6Q()达到2-6，2500 X g，5min离心收集菌体，换用BMMY培养基诱导表达，每24h添加甲醇至 1%，连续诱导96h，分别在24h、48h、72h、96h收集上清，SDS-PAGE分析蛋白，筛选高表达菌 株。同时以同样条件诱导GS115-pPIC9K空载体菌株作为空白对照。结果显示，GS115-pPIC9K-Irisin-his菌株的诱导上清中，在14-29KDa之间含有四个大小不同的明显的蛋白 条带，并且这四个条带随着诱导时间的增加而逐渐增加;而GS115-pPIC9K菌株的诱导上清 中却没有明显条带。提示GS115-pPIC9K-Irisin-his菌株的诱导上清中可能含有人Irisin 重组蛋白。
[0064] 2.人Irisin重组蛋白的纯化
[0065] 取 100mL 的 GS115-pPIC9K-Irisin-his 诱导 96h 上清，用 8000KDa 透析袋在镍柱 2L 结 合液中透析18h，每6h换一次液;将透析后的诱导上清通过AKT用镍柱纯化，上柱子完成后， 分别20mM咪唑洗涤液I、50mM咪唑洗涤液I和500mM咪唑洗脱液洗柱，并收集透析液、过柱液、 洗涤液I、洗涤液II和洗脱液做SDS-PAGE电泳分析。结果表明，诱导上清中含有14-29KDa之 间含有四个大小不同的明显的蛋白条带;过柱液中不含有蛋白条带，表明这四个大小不同 的蛋白条带均被镍柱所吸附；20mM咪唑的洗涤液I只洗涤下少量蛋白；为了提高目的蛋白纯 度，将洗涤液咪唑浓度提高到50mM，但在洗涤II中也只有少量蛋白；最后，用含有500mM咪唑 的洗脱液洗柱，发现洗脱液中包含了四个大小不同的明显的蛋白条带，表明纯化得到这四 个条带都有可能是目的蛋白。
[0066] 3.人Irisin重组蛋白的糖基化鉴定
[0067] 用去糖基化酶Glycopeptidase F(购自TaKaRa公司）对含有14_29KDa之间四个大 小不同条带的人Irisin重组蛋白进行了去糖基化处理，反应20h后，进行SDS-PAGE电泳检测 纯化得到的人Irisin重组蛋白在去糖基化前后的变化。结果显示，含有14-29KDa之间四个 大小不同条带的重组蛋白经过去糖基化处理之后，只含有14_20KDa之间两个条带。说明，本 发明所得到的人Irisin重组蛋白确实发生了 N-糖基化。
[0068] 4.用BCA法测定人Irisin重组蛋白回收率
[0069] 用PBS将25mg/mL的BSA标准蛋白稀释成0 · 5mg/mL的标准品，将标准品按0，1，2，4， 8，12，16,2(^加到96孔板的标准品孔中別3补足到2(^，将纯化的人148丨11重组蛋白加入 到96孔板的待测样品孔中，每孔各加入200yLBCA工作液，37°C放置30分钟，用酶标仪测量吸 光度(A562nm)，用标准品吸光度绘制标准曲线( 7 = 0.9296^0.0908，1?2 = 0.998，其中7为蛋白 浓度mg/mL，x为吸光度），计算出样品浓度，最后得出本发明的人Irisin重组蛋白每升培养 物回收率达到20毫克以上。
[0070] 5.人Irisin重组蛋白的活性鉴定
[0071] 将C2C12细胞(购买于中科院上海细胞库)按照3X105cells/孔接种于24孔板中， 用DMEM完全培养基在37°C，5%C02的培养箱中培养贴壁培养24h;吸弃培养基，用37°C预热 的无菌PBS温和地清洗一次细胞；吸弃PBS，更换含有500、1000、2000ng/mL不同浓度人 Irisin重组蛋白的培养基继续在37°C，5%C02的培养箱中培养12h;提取细胞总RNA，用荧光 定量PCR方法检测重组蛋白对解偶联蛋白l(uncoupling protein 1，UCP1)和长链脂肪酸3 (elongation of very long chain fatty acids protein 3，elovl3)mRNA的表达的影口向。 其中，解偶联蛋白 1 (uncoupling protein 1，UCP1)和长链脂肪酸3(elongation of very long chain fatty acids protein 3，elovl3)mRNA由上海生工生物工程有限公司合成，其 结果表明，经过人Irisin重组蛋白处理12h后，C2C12细胞UCP1 mRNA的表达量有显著增高， 与对照组相比，其表达量增加了约2倍;elovl3 mRNA的表达量也有明显的增高，与对照组相 比，其表达量增加了约2.5倍;并且随着重组蛋白含量的提高，两个下游基因 mRNA的表达量 也有升高的趋势。表明本发明所得到的人Irisin重组蛋白能够促C2C12细胞UCP1和elovl3 mRNA表达的上调，即具有生物学活性。
[0072]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种人Irisin重组蛋白的DNA序列，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID N0:1所示。2. -种人Irisin重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。3. 含有权利要求1所述的人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系 统或转基因重组菌。4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的DNA序列插入 到毕赤酵母分泌表达载体中得到的表达人Irisin重组蛋白的DNA的重组表达载体。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述毕赤酵母分泌表达载体为 pPIC9K〇6. -种转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组表达载 体电转至毕赤酵母中，筛选得到表达人Irisin重组蛋白的转基因重组酵母菌株。7. 根据权利要求6所述的转基因重组菌，其特征在于，所述的毕赤酵母为GS115。8. 权利要求1所述的DNA序列、权利要求3所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基 因重组菌在生产人Irisin重组蛋白中的应用。9. 一种人Irisin重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 从人肌肉组织中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为模板，PCR得到人 Irisin的基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO: 1所示； 2) 经过PCR将His标签插入人Irisin的基因片段，得到人Irisin-his片段； 3) 构建pPIC9K-Irisin_his重组表达载体； 4) 构建63115_口？1091(-11'丨8；[11-]1丨8重组酵母菌株； 5) 人Irisin重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定。10. -种权利要求2所述的人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。
【文档编号】A61K38/39GK106084038SQ201610453493
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】顾志良, 何赛, 郁建锋, 韩曜平, 张燕萍
【申请人】常熟理工学院