一种炭疽杆菌荚膜表面三糖缀合物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种炭疽杆菌荚膜表面三糖缀合物及其制备方法和应用，所述三糖蛋白缀合物结构通式如式I所示：其中，所述R为载体蛋白KLH或BSA。本发明以氨基葡萄糖盐酸盐和D?半乳糖为原料，合成了如上式所示的三聚寡糖，并将其与载体蛋白偶联得到糖蛋白缀合物。将制备的化合物作为抗炭疽疫苗免疫小鼠，结果表明本发明的化合物能诱导机体产生较强的免疫应答，因此本发明具有较强的应用价值。
【专利说明】
一种炭疽杆菌荚膜表面三糖缀合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及糖蛋白缀合物，具体地说，是一种炭疽杆菌荚膜表面三糖缀合物及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 多数致病病原体的外壳通常包裹一层具有弱免疫原性的多糖，使其能够逃避过宿 主的免疫监控；由于其结构的高度保守性及免疫应答的可靠性，基于此类细菌荚膜多糖结 构的疫苗已经在感染性疾病控制方面取得了突破性的进展，已有针对新生儿、幼儿肺炎和 脑膜炎的疫苗上市，针对疟疾、肿瘤和多种真菌、细菌感染的疫苗处于不同的研究阶段，显 示出了良好的研究前景。
[0003] 炭疽杆菌为致病菌中最大的革兰氏阳性杆菌，属于需氧芽孢杆菌属，其繁殖体易 被杀灭。但是炭疽杆菌的芽孢可在动物、尸体及其污染环境和泥土中存活多年。炭疽杆菌一 旦进入人体，便会迅速产生外毒素，引起组织水肿、出血和坏死，使人丧失劳动力，直至死 亡。
[0004] 现有炭疽疫苗存在许多弊端，主要问题在于：（一)组成成分复杂而不确定；（二)免 疫反应所对应的抗原不够明确，针对性较差；（三)疫苗的支链难以控制，效果不稳定；（四） 免疫效果不理想。
[0005] 糖类合成的难点在于有更多的功能基团需要保护与去保护，且为了区分这些相似 的官能团，保护和去保护的方法必须具有很好的选择性和专一性;更重要的是，糖苷键的形 成还应具有较好的立体选择性，并且在后续合成中要保持其构型不变，这些因素都是限制 多糖合成的主要原因。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀 合物。
[0007] 本发明的再一的目的是，提供如上所述的炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物的制 备方法。
[0008] 本发明的另一的目的是，提供如上所述三糖蛋白缀合物的用途。
[0009] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0010] 一种炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物，所述三糖蛋白缀合物结构通式如式I所 示：
[0011]
[0012] 其中，所述R为载体蛋白KLH或BSA。
[0013] 所述三糖蛋白缀合物由三聚寡糖与载体蛋白偶联制得。
[0014] 所述组成寡糖的单糖单元为氨基葡萄糖和D-半乳糖。
[0015] 所述以戊二烯基作为三糖和载体蛋白的连接基团。
[0016] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0017] 如上任一所述炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物的制备方法
[0018] 包括如下步骤：
[0019] (1)化合物2与化合物3在NIS/AgOTf作用下发生反应制备化合物5;
[0020] (2)化合物5的4，6-位脱去苄叉基制备化合物6;
[0021] (3)化合物6与化合物4在NIS/TMSOTf作用下发生糖基化反应制备化合物7;
[0022] (4)化合物7脱除保护基分别制备得到化合物8和化合物1;
[0023] (5)化合物1在戊二醛和甘氨酸条件下活化偶联载体蛋白KLH或BSA，得目标糖蛋白 缀合物；
[0024]所述化合物1-8结构及合成路线如下：
[0025]
[0026] 优选地，所述的制备方法，包括如下步骤：
[0027] (1)化合物2与化合物3在无水DCM、NIS/AgOTf的条件下于-30°C反应制备化合物5; 所述NIS/AgOTf摩尔比为15:1;
[0028] (2)化合物5与对甲苯磺酸和乙硫醇在无水二氯甲烷条件下反应制备化合物6;所 述化合物5、对甲苯磺酸、乙硫醇的摩尔比为1:0.2:9;
[0029] (3)化合物6与化合物4在无水DCM、NIS/TMS0Tf的条件下于-70°C反应制备化合物 7;所述NI S/TMSOTf摩尔比为15:1;
[0030] (4)化合物7与乙二胺溶于正丁醇，在90°C加热回流4小时；产物溶于无水吡啶，与 醋酸酐及DMAP反应得到化合物8;
[0031] (5)化合物8在二氯甲烷、甲醇、氯化钯、氢气的条件下反应得到化合物1;所述二氯 甲烷与甲醇的摩尔比为1:4;
[0032] (6)化合物1溶解在蒸馏水中，BSA或KLH溶解在roS缓冲液中，将二者融合，先加入 戊二醛搅拌反应2小时后，再加入甘氨酸，反应得到目标糖蛋白缀合物。
[0033]优选地，所述制备方法如下：
[0034] (1)以氨基葡萄糖盐酸盐和D-半乳糖为原料，在反应助剂的作用下制备氨基葡萄 糖受体，氨基葡萄糖硫苷供体和2，3，4，6-0-四苄基半乳糖硫苷供体；
[0035] (2)上述制备的半乳糖供体和单糖受体在催化剂(NIS/AgOTf)作用下发生糖基化 反应制备二糖，在二糖的4,6-位脱去苄叉基制备二糖受体;二糖受体和氨基葡萄糖硫苷供 体催化剂(NI S/TMSOTf)作用下发生糖基化反应制备三糖;将三糖脱去所有保护基得化合物 1;
[0036] (3)化合物1在戊二醛和甘氨酸条件下活化偶联载体蛋白，即得相应糖蛋白缀合 物。
[0037] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0038] 如上任一所述三糖蛋白缀合物在制备预防和/或治疗抗炭疽感染的药物中的应 用。
[0039] 如上任一所述三糖蛋白缀合物在制备抗炭疽感染的疫苗中的应用。
[0040] -种药物组合物，它还包含权利要求1-4任一所述三糖蛋白缀合物和药学上可接 受的辅料或佐剂。
[00411 本发明提供了氨乙基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基_(α1-6)-(?Η)-吡 喃半乳糖基)-(al-3)_2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖的制备方法，包括：
[0042] (1)以氨基葡萄糖盐酸盐和D-半乳糖为原料，按照文献方法制备氨基葡萄糖受体， 氨基葡萄糖硫苷供体和2，3，4，6-0-四苄基半乳糖硫苷供体；
[0043] (2)上述制备的半乳糖供体和单糖受体在催化剂(NIS/AgOTf)作用下发生糖基化 反应制备二糖，在二糖的4,6-位脱去苄叉基制备二糖受体;二糖受体和氨基葡萄糖硫苷供 体催化剂(NIS/TMSOTf)作用下发生糖基化反应制备三糖;将三糖脱去所有保护基即得目标 化合物。
[0044] 本发明还提供了氨乙基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(al-6)-(i3-D- 吡喃半乳糖基)-(al-3)_2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖蛋白的制备方法，包括： [0045] (1)将按上述方法制备的氨乙基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基_(al - 6)-(?Η)_吡喃半乳糖基)-(al-3)_2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖在戊二醛和甘氨 酸条件下活化偶联载体蛋白，即得相应糖蛋白缀合物。
[0046] 本发明优点在于：
[0047] 1、本发明的糖蛋白缀合物作为抗炭疽疫苗免疫小鼠，结果表明本发明的化合物能 诱导机体产生较强的免疫应答，因此本发明具有较强的应用价值。
[0048] 2、本发明的三糖蛋白缀合物合成路线简洁，操作简单，原料成本低，通用性强，糖 基化反应立体选择性好，产物收率高。
【附图说明】
[0049]附图1是氨乙基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(al-6)-(i3-D-吡喃半 乳糖基)_(a 1-3) _2_脱氧_2_乙酰氨基-β-D-吡喃匍萄糖蛋白缀合物通式。
[0050]附图2是二糖、三糖合成路线。反应条件：a)4A-MS，NIS，AgOTf，-30°C;b)Ts0H， EtSH, DCM ； c) 4A-MS, NIS, TMSOTf, -70 °C ； d )NH2CH2CH2NH2, n-Butano 1,90 °C , ref lux ； then Ac2〇,DMAP,pyridine；then MeOH,NaOMe；e)Me0H,PdCb,H2〇 [0051 ] 附图3是化合物1-BSA的MALDI-T0F-MS谱图。
[0052]附图4是化合物1 -KLH免疫小鼠后检测血清中总抗体滴度。
【具体实施方式】
[0053]下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
[0054] 实施例1三糖缀合物1-BSA和1-KLH的合成
[0055] (1)二糖受体6的合成
[0056] 取化合物（3.29g，5. lmmol)(AcadJSecMilMed Univ,2016,37(2): 145-152)和3 (2g，3 · 4mmol )^111'.】.0作.(]]16111.2014,4577-4584)溶于无水00\1(4〇1111^)后加入分子筛 (2.5g)，在氩气保护下室温搅拌lh。降温至-30°C，迅速加入N-碘代丁二酰亚胺（1.15g， 5. lmmo 1)和三氟甲磺酸银(87.3mg，0.34mmo 1)继续搅拌lh。TLC(石油醚：乙酸乙酯=2:1，Rf = 0.5)监测反应完全。加三乙胺淬灭反应后，过滤除去分子筛，滤渣用DCM洗涤，合并滤液。 依次用饱和硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗两遍。有机层用无水 硫酸钠干燥后，浓缩硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯=6:1)得白色固体5 (2.94g，79 % )。咕 NMR(600MHz，CDCl3)S7.72(d，J=1.9Hz，2H，Ar)，7.40((1, J = 4.0Hz，2H，Ar) ,7.37-7 ·28(ι?， 18H,Ar),7.18-7.10(m,6H,Ar),7.05-6.98(m,6H,Ar),5.54(d ,J = 3.8Hz,lH,Hgaia-l),5.34 (s,lH,PhCH(0)2) ,5.28(d,J = 8.5Hz,lH,HgiuN-l) ,5.00(d,J=12.4Hz,lH) ,4.9-4.81(m, 4H) ,4.71(d,J= 11.2Hz, 1H),4.65(d,J= 11.6Hz, 1H),4.50(d,J= 12.4Hz, 1H) ,4.41-4.38 (m,2H),4.33-4.31(m,lH),4.25(d,J=11.2Hz,lH),3.92(s,2H),3.89-3.86(m,2H),3.83-3.73(m,3H),3.70-3.66(m,lH),3.63(s,lH),3.61-3.58(m,lH),3.38-3.36(m,lH),3.30-3.22(m，3H)，2.88-2.86(m，lH) .13C 匪R(150MHz，CDC13)S156.1，138.9，138.6，138.5， 137.92,136.9,136.5,134.2,131.3,129.3,128.5,128.4,128.2,128.1,128.1,128.0， 128.0. 127.4.127.3.127.2.127.1.127.0.126.3.101.7(PhCH(0)2),99.0(C gaia-l), 97.3 (CgiuN-1) ,78.1,75.4,74.8,74.8,73.3,72.9,72.5,71.7,69.4,69.1,68.7,67.8,66.6, 65 · 9，55 · 3，40 · 8 · ESI-MS calcd · for C65H64N2〇i4[M+Na]+m/z，1119 · 43，found: 1119 · 64。
[0057] 取化合物5(2 · 2g，2mmol)，对甲苯横酸(70mg，0 · 4mmol)和乙硫醇（1 · 3mL，1 8mmo1) 溶于无水二氯甲烷(50mL)，室温下搅拌反应3h，待TLC(石油醚：乙酸乙酯=3: 2，Rf = 0.3)检 测反应结束，加三乙胺淬灭反应。浓缩溶剂，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯= 1:1)得白色产 物6(1.848,91%)。咕匪1?(60010^，0)(：13)37.72((1，了 = 7.1抱，1!1，八〇,7.61(^ = 7.8!^， 1H,Ar),7.53-7.42(m,2H,Ar),7.39-7.26(m,18H,Ar),7.24-7.18(m,5H,Ar),7.15(d,J= 7.7Hz,2H,Ar),5.19(s,lH),5.11(d ,J = 8.3Hz,lH),5.10-4.97(m,2H),4.85(d ,J = 11.7Hz, 1H),4.78(d,J=ll.ΙΗζ,ΙΗ),4.74-4.65(m,4H),4.38-4.33(m,2H),4.17-4.07(m,3H), 3.98-3.90(m,4H),3.80-3.72(m,3H),3.68-3.54(m,3H),3.36-3.20(m,2H),3.10(t,J= 9.1Hz,1H). 13C 匪R(150MHz，CDC13)Sl68.5,167.7,156.2,138.6,138.2,138.1,136.91， 136.5.134.0. 133.9.131.6.128.8.128.6.128.5.128.4.128.3.128.1.128.1.128.0， 127.9,127.7,127.6,127.5,127.4,127.3,123.4,102·5,98·9,83·7,79·3,75.9,75.4, 74.9.74.6.74.0. 73.0.72.4.72.2.70.0.69.2.66.9.66.6.62.9.55.4.41·0·ESI-MS calcd.for C58H6〇N2〇i4[M+Na].m/z，1031 · 39，found: 1031 ·84〇
[0058] (2)目标化合物1的合成
[0059] 取化合物6(505mg，0 · 5mmol)和4(406mg，0 · 75mmol,Carbohydrate Research, 2008，343: 2894-2902)溶于无水DCM(15mL)后加入分子筛(500mg)，在氩气保护下室温搅拌 111。降温至-70°(：，迅速加入^碘代丁二酰亚胺（16811^，0.75111111〇1)和了]\^(^以0.111^， 0.05mmol)继续搅拌3LTLC(石油醚：乙酸乙酯=2:1，心=0.5)检测反应完全。加三乙胺淬 灭反应后，过滤除去分子筛，滤渣用DCM洗涤，合并滤液。依次用饱和硫代硫酸钠溶液，饱和 碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩硅胶柱层析(石油 醚：乙酸乙酯= 2:1)得白色固体7(54011^,76^)^11^^(60010^,00(:13)57.84-7.77(111,211, Ar),7.70-7.61(m,3H,Ar),7.58-7.56(m,lH,Ar),7.49-7.41(m,2H,Ar),7.38-7.27(m,16H, Ar),7.25-7.23(m,2H,Ar),7.22-7.18(m,5H,Ar),7.13-7.11(m,2H,Ar),5.81-5.78(m,lH), 5.48(d,J = 8.5Hz,lH),5.17(t,J = 9.6Hz,lH),5.06(t,J = 5.6Hz,lH) ,5.00(d,J=12.4Hz, lH),4.96-4.90(m,2H),4.79-4.74(m,2H),4.71-4.64(m,3H),4.58(d,J=3.4Hz,lH),4.38-4.30(m,3H),4.25-4.15(m,3H),4.14-4.07(m,2H),4.00-3.97(m,1H),3.93-3.86(m,3H), 3.85-3.79(m,1H),3.72-3.61(m，2H),3.57(t，J=8.5Hz，lH),3.40-3.32(m，3H),3.10-2.97 (m，3H)，2.26-2.23(m，lH)，2.13(s，3H，Ac)，2.03(s，3H，Ac)，1.86(s，3H，Ac). 13C 匪R (150MHz,CDC13)5170.3,169.7,169.0,167.9,167.2,155.7,138.0,137.7,137.6,136.4, 136.2.133.9.133.5.133.3.131.1.131.0. 130.8.128.2.128.1.127.9.127.7.127.6， 127.5.127.4.127.2.127.1.126.9.126.8.123.1.122.9.102.0. 97.7.83.1.78.7.75.1， 74·8，74·4，73·9，73·4，72·5，71·8，71·3，71·0，70·3，69·4，68·5，68·4，67·8，66·3，66 · 0， 61 · 5，54 · 8，54 · 2，40 · 4，20 · 3，20 · 2，20 · 0 · ESI-MS calcd · for C78H79N3O23 [M+Na]+m/z， 1448.50,found :1448.77〇
[0060]取化合物7(154mg，0. llmmol)和乙二胺（0· 15mL，2.2mmol)溶于正丁醇（5mL)，加热 回流(90°C)4h。反应完毕，蒸干溶剂，真空干燥，得中间产物;溶于无水吡啶(3mL)并加入醋 酸酐(0.5mL)和催化量DMAP室温下搅拌过夜。反应结束，加甲醇淬灭反应，蒸干溶剂，加 DCM (50mL)萃取，依次使用1M HC1溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无 水硫酸钠干燥，。硅胶柱层析纯化得白色产物8(10011^，73%)。 1!1匪1?(6001抱，〇)(：13)67.41-7.35(m 8H),7.33-7.27(m,13H),7.24-7.22(m,4H),5.31-5.25(m,lH),5.21(d,J=7.8Hz, lH),5.14-5.08(m,3H),5.04(t ,J = 9.6Hz,lH),4.94-4.89(m,2H),4.82(d ,J=12.0Hz,lH), 4.77(d ,J = 3.3Hz,lH),4.69-4.62(m,3H),4.56(d ,J=11.7Hz,lH),4.41(s,2H),4.31-4.28 (m,2H),4.23-4.20(m,lH),4.10-3.91(m,5H),3.78-3.76(m,1H),3.67(d,J=1.9Hz,1H), 3.64-3.60(m,3H),3.53-3.51(m,lH),3.32-3.29(m,3H),3.10-3.08(m,lH),2.79-2.76(m, 1H),2.06(s，3H，Ac),2.03(s，3H，Ac),2.01(s，3H，Ac),1.83-1.67(m，6H,Ac). 13C 匪R (150MHz,CDC13)5171.5,170.3,170.2,170.1,168.8,156.0,138.1,137.7,137.6,136.4, 136.1.128.1.128.1.128.0. 128.0.128.0.127.9.127.6.127.6.127.5.127.47.127.41, 127.21.127.10.101.08.98.98.98.59.79.23.77.99.75.03.74.0. 73.34.73.0.72.7.71.8， 71.4.70.5.70.1.69.0. 68.4.68.0.67.6.66.2.61.5.58.7.53.5.40.6.22.6.22.4.20.2, 20. l〇
[0061 ] 取化合物8(30mg,0.024mmol)溶于二氯甲烷和甲醇(DCM:MeOH= 1:4,5mL),加入催 化量氯化钯，通入氢气震荡反应3h。待反应结束，滤去氯化钯残渣，浓缩滤液，得中间产物。 置于含催化量甲醇钠的无水甲醇中搅拌反应20min，加入酸性树脂调节溶液pH=6~7,除去 树脂，浓缩滤液，再由P2凝胶柱纯化得白色终产物1 (10mg，67 % )。咕600MHz，CD30D/ D2〇)S5.35(d，J = 3.2Hz，2H，H-l，HgiUN_l) ,4.59-4.58(m，3H，Hgaia-l，NH2)，4.27(dd，J = 28.5,13.4Hz,lH),4.10-4.03(m,2H),3.96-3.81(m,10H),3.76-3.71(m,8H),3.66(d,J= 9 · 2Hz，1H)，3 · 29-3 · 13(m，3H)，2 · 06，2 · 02(s，6H,Ac) · 13C NMR( 150MHz，CD3OD/D2O)δ173 · 6， 100.5.99.2.80.0. 75.2.70.6.70.2.69.1.68.7.68.3.65.0.60.2.60.0.53.4.39.0.21.7〇
[0062] (3)三糖缀合物1-BSA和1-KLH的合成
[0063] 取三糖化合物l(2mg)和10mg BSA或KLH分别溶解在0.5ml蒸馏水和0.5ml PBS缓冲 液中，然后将二者融合。向混合液中加 lmL 0.2 %戊二醛(过量)后，旋转搅拌反应2小时。向 反应液中加 0.5mL 1M甘氨酸，继续旋转搅拌反应1小时。待反应结束，取反应液对蒸馏水透 析过夜，冻干得1-BSA或1-KLH白色粉末。
[0064] 实施例2本发明的化合物免疫活性测试
[0065] 一、试验材料及来源
[0066]供试化合物:本发明实施例1中所制备得到的糖蛋白化合物1-KLH。
[0067]二、试验方法 [0068](一)小鼠免疫方案
[0069] 1)选用6-8周雌性Balb/c小鼠（购于中国科学院上海实验动物中心），每组5只小 ￡3
[0070] 2)将糖蛋白化合物ι-KLH添加相应佐剂(溶于PBS)混悬液皮下注射小鼠，每次免疫 的糖蛋白含有2yg的糖，每隔3周再用同样方法加强免疫，共免疫3次。分别于免疫前和第三 次免疫后一周，分离血清并置于-80°C冰箱冻存待测。
[0071 ](二)小鼠免疫前后血清中抗体滴度测定
[0072] 1、包被抗原(ELI SA包被缓冲液，5yg/mL) 100μ 1 /we 11，4 °C包被过夜；
[0073] 2、Blacking:洗板，gelatin，200yL/wel 1，37 °C孵育 2 小时；
[0074] 3、Abl:洗板，以不同稀释倍数加入抗体血清，lOOyL/wel 1，37°C孵育2小时；
[0075] 4、Ab2:洗板，羊抗小鼠 -HRP，100yL/we 11，37 °C 孵育 1 小时；
[0076] 5、加底物显色：反应7min，加2M H2S〇4中止；
[0077] 6、ELISA 仪测4500D 值。
[0078]检测设置空白对照(本底），即在Abl反应时以稀释液代替样品。
[0079]三、试验结果
[0080] 本发明制备的KLH-糖蛋白缀合物1-KLH皮下免疫小鼠，均能诱导机体产生较强的 免疫应答，实验结果见附图4。
[0081] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种炭痘杆菌芙膜表面Ξ糖蛋白缀合物，其特征在于，所述Ξ糖蛋白缀合物结构通 式如式I所示：其中，所述R为载体蛋白KLH或BSA。2. 根据权利要求1所述炭痘杆菌芙膜表面Ξ糖蛋白缀合物，其特征在于，所述Ξ糖蛋白 缀合物由Ξ聚寡糖与载体蛋白偶联制得。3. 根据权利要求2所述炭痘杆菌芙膜表面Ξ糖蛋白缀合物，其特征在于，所述组成寡糖 的单糖单元为氨基葡萄糖和D-半乳糖。4. 根据权利要求2所述炭痘杆菌芙膜表面Ξ糖蛋白缀合物，其特征在于，W戊二締基作 为Ξ糖和载体蛋白的连接基团。5. 权利要求1-4任一所述炭痘杆菌芙膜表面Ξ糖蛋白缀合物的制备方法，其特征在于， 包括如下步骤： (1) 化合物2与化合物3在NIS/AgOTf作用下发生反应制备化合物5; (2) 化合物5的4,6-位脱去节叉基制备化合物6; (3) 化合物6与化合物4在NIS/TMSOTf作用下发生糖基化反应制备化合物7; (4) 化合物7脱除保护基分别制备得到化合物8和化合物1; (5) 化合物1在戊二醒和甘氨酸条件下活化偶联载体蛋白KLH或BSA，得目标糖蛋白缀合 物； 所述化合物1-8结构及合成路线如下：ο6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 化合物2与化合物3在无水DCM、NIS/AgOTf的条件下于-30°C反应制备化合物5;所述 NIS/AgOTf 摩尔比为15:1; (2) 化合物5与对甲苯横酸和乙硫醇在无水二氯甲烧条件下反应制备化合物6;所述化 合物5、对甲苯横酸、乙硫醇的摩尔比为1:0.2:9; (3) 化合物6与化合物4在无水DCM、NIS/TMSOTf的条件下于-70°C反应制备化合物7;所 述NIS/TMSOTf摩尔比为15:1; (4) 化合物7与乙二胺溶于正下醇，在90°C加热回流4小时；产物溶于无水化晚，与醋酸 酢及DMAP反应得到化合物8; (5) 化合物8在二氯甲烧、甲醇、氯化钮、氨气的条件下反应得到化合物1;所述二氯甲烧 与甲醇的摩尔比为1:4; (6) 化合物1溶解在蒸馈水中，BSA或化Η溶解在PBS缓冲液中，将二者融合，先加入戊二 醒揽拌反应2小时后，再加入甘氨酸，反应得到目标糖蛋白缀合物。7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下： (1) W氨基葡萄糖盐酸盐和D-半乳糖为原料，在反应助剂的作用下制备氨基葡萄糖受 体，氨基葡萄糖硫巧供体和2，3，4，6-0-四苄基半乳糖硫巧供体； (2) 上述制备的半乳糖供体和单糖受体在催化剂(NIS/AgOTf)作用下发生糖基化反应 制备二糖，在二糖的4，6-位脱去节叉基制备二糖受体;二糖受体和氨基葡萄糖硫巧供体催 化剂(NIS/TMSOTf)作用下发生糖基化反应制备Ξ糖;将Ξ糖脱去所有保护基得化合物1; (3) 化合物1在戊二醒和甘氨酸条件下活化偶联载体蛋白，即得相应糖蛋白缀合物。8. 权利要求1-4任一所述Ξ糖蛋白缀合物在制备预防和/或治疗抗炭痘感染的药物中 的应用。9. 权利要求1-4任一所述Ξ糖蛋白缀合物在制备抗炭痘感染的疫苗中的应用。10. -种药物组合物，其特征在于，它还包含权利要求1-4任一所述Ξ糖蛋白缀合物和 药学上可接受的辅料或佐剂。
【文档编号】C07K1/113GK106084037SQ201610407023
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】廖俊, 廖万清, 柴晓云, 黄蕾, 方文捷, 王保刚, 张治强, 潘玮华, 陈敏, 吴秋业
【申请人】中国人民解放军第二军医大学