一种提高白细胞介素il?34热稳定性的方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高白细胞介素IL?34热稳定性的方法，属于生物技术领域。所述方法通过对人源IL?34cDNA中编码98号丝氨酸的密码子agc，定点突变为编码半胱氨酸的密码子tgt；将含有S98C IL?34突变体编码序列的转移质粒与BacVector?3000杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞来制备表达S98C IL?34的杆状病毒；再使用杆状病毒转导HEK 293细胞表达S98C IL?34。所述方法获得的S98C IL?34与native IL?34相比，热稳定性得到提升。经过M?NFS?60细胞增殖实验和CSF?1R磷酸化实验，证明S98C IL?34活性与native IL?34没有显著差别。
【专利说明】
一种提高白细胞介素IL-34热稳定性的方法
技术领域
[0001 ] 本发明涉及一种提高白细胞介素 IL-34( interleukin-34, IL-34)热稳定性的方 法，具体地说，涉及一种通过氨基酸定点突变提升IL-34热稳定性的方法，属于生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 白细胞介素-34( interleukin-34, IL-34)是一个新近发现的细胞因子(Haishan Lin et al. Science 2008)。它是集落刺激因子-1 受体（colony-stimulating factor lreCeptor，CSF-lR)的一个新配体，它能特异识别并独立激活CSF-1R。IL-34发挥生物活性 的形式为二聚体形式，生物二聚体的分子量50KD，每个单体的分子量为25KD，单体的氨基酸 序列为：
[0003]
[0004]
[0005] IL-34自从被识别为CSF-1R的新配体以来，它的功能以及结构已经被深入的研究。 IL-34虽然有着与CSF-1相似的激活CSF-1R的效应，但是激活效应更强，半衰期更短(Eda Η et al.Cytokine.2010)。在许多组织都能分泌IL-34,但以脾脏的分泌为主导(Clavel G et al. Joint Bone Spine. 2013)。IL-34能促进单核细胞的存活，增殖以及分化成巨噬细胞。 IL-34也能促进破骨细胞生成。有研究表明，类风湿性关节炎患者关节液中的IL-34水平相 比一般的关节炎患者有提升，同时IL-34在滑膜以及关节液中的表达水平与炎症的严重程 度成正相关（Baud'huin M et al.J Pathol 2010;Hwang S-J et al.ArthritisRes Ther 2012)。
[0006] 虽然IL-34有着与CSF-1相似的激活CSF-1R的能力，但研究指出它们的功能是不重 叠的，它们的表达方式存在时空差异（Wei，S.et al _J.Leukoc.Biol · 2010) aTetsuya Mizuno报道IL-34能够选择性的增强小鼠小胶质细胞对于神经毒性的修复能力（T Mizuno.et al.Am J Pathol.2011)。同时有研究通过IL-34LacZ/LacZ小鼠模型，发现IL-34具 有组织限定性(Wang，Y.et al.Nat Immunol.2012)。该研究发现IL-34主要由皮肤和中枢神 经系统分泌，在IL-34缺失时，上皮的朗格汉斯细胞发育受到影响而使小鼠出现接触过敏症 状，而缺少IL-34的小神经胶质细胞会在数量上受到影响，削弱小胶质细胞对于中枢神经系 统的保护能力。这个研究展示出IL-34在神经保护和修复方面具有成药潜力。
[0007] IL-34在神经元修复中展现的有意义影响使得IL-34具有了成药可能性(Wang， Y.et al.Nat Immunol.2012)。对于蛋白类药物，保质期以及在体内的半衰期是能否成药的 重要条件，这些条件都与蛋白的热稳定性有关系。一个新的细胞因子如果要成为上市药物， 必须要提升蛋白的稳定性，但是自发现以来尚无提升IL-34热稳定性的方法。
【发明内容】
[0008]针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种提高IL-34热稳定性的方 法，所述方法通过对IL-34进行氨基酸定点突变来提高IL-34的热稳定性，在提高IL-34热稳 定性的同时，保持了 IL-34的生物活性，让IL-34具有更大的成药潜力。
[0009] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
[0010] -种提高IL-34热稳定性的方法，所述方法通过对IL-34进行氨基酸定点突变，将 IL-34的98号丝氨酸突变成半胱氨酸来提高IL-34的热稳定性，下文中，用S98C IL-34指代 98号丝氨酸残基突变成半胱氨酸的IL-34,所述S98C IL-34单体的氨基酸序列如下：
[0011]
[0012]
[0013] 所述方法具体步骤如下：
[0014] 将GeneBank ID:NM_152456的表达蛋白质的IL-34 cDNA中表达98号丝氨酸的密码 子agc，采用基因定点突变为表达半胱氨酸的密码子tgt;将突变后的S98C IL-34 cDNA与 BacVector-3000杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞来制取表达S98C IL-34的杆状病毒;再使 用杆状病毒感染HEK 293细胞表达S98C IL-34。
[0015] 有益效果
[0016] 1.本发明提供了一种提高IL-34热稳定性的方法，所述方法基于已有的IL-34结构 (PDB ID:4DKC)分析，发现在蛋白核心处98号丝氨酸残基与168号半胱氨酸残基距离很近， 两者Ca的距离为5.8A。为了提升IL-34的热稳定性，将IL-34的98号丝氨酸残基突变成半胱 氨酸，下文用native IL-34指代未突变的IL-34，S98C IL-34指代98号丝氨酸残基突变成半 胱氨酸的IL-34;
[0017] 2.本发明提供了一种提高IL-34热稳定性的方法，所述方法通过蛋白晶体技术结 晶S98C IL-34蛋白并解析其结构，从晶体结构层面证实S98C IL-34突变成功，并证实在98 号半胱氨酸与168号半胱氨酸之间形成了native IL-34不具备的二硫键；
[0018] 3.本发明提供了一种提高IL-34热稳定性的方法，所述方法获得的S98C IL-34与 native IL-34相比，Tm(melting temperature)提升了7.6°C，说明S98C IL-34相比native IL-34热稳定性得到了提升。同时经过M-NFS-60细胞的增殖实验和CSF-1R的磷酸化实验，证 明S98C IL-34的生物学活性与native IL-34没有显著差别。
【附图说明】
[0019] 图1为PCR程序设置示意图。
[0020] 图2为Native IL-34和S98C IL-34的SDS-PAGE鉴定图。
[0021] 图3为Native IL-34和S98C IL-34经分子筛系统纯化图。
[0022] 图4为条件优化后得到的S98C IL-34晶体。
[0023] 图5为S98C IL-34晶体结构（左）与native IL-34晶体结构图（右）。
[0024] 图6为S98C IL-34晶体结构的单体中Cys98-Cysl68二硫键的Fo-Fc差值电子密度 图（左:A链;右:B链;F〇-Fc level = 3.0)。
[0025]图7为native IL-34在不同温度下的同步辐射⑶图谱。
[0026]图8为S98C IL-34在不同温度下的同步辐射CD图谱。
[0027] 图9为Native IL-34和S98C IL-34的二态转化平衡拟合图。
[0028] 图10为S98C IL-34和native IL-34刺激M-NFS-60细胞增殖的浓度依赖曲线图。
[0029] 图11为S98C IL-34和native IL-34激活产生磷酸化的CSF-lR(pCSF-lR)与细胞内 总体CSF-lR(Total CSF-1R)的Western blot条带图。
[0030] 图12为S98C IL-34和native IL-34激活产生磷酸化的CSF-lR(pCSF-lR)与细胞内 总体CSF-lR(Total CSF-1R)的Western blot条带的灰度比值柱状图。
[0031]图13为不同种属的IL-34的氨基酸序列比对图（参考Uniprot数据库，用单字母表 示氨基酸）。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1
[0033] 1.表达质粒的构建
[0034] 材料：
[0035] IL-34的cDNA购自Origene公司。所使用的克隆载体为BacMam载体。
[0036]实验所用的大肠杆菌菌种为DH5a菌株，购自鼎国生物公司。
[0037] PCR引物由北京三博远志公司合成。
[0038] PCR相关试剂：Vent DNA聚合酶（NEB)，dNTP mixture(NEB)，MgS04(NEB)，DMS0 (NEB)，10XPCR buffer(NEB)。
[0039] DNA克隆相关试剂：琼脂糖（invitrogen)，限制性内切酶（NEB)，T4 DNA ligase (仙8)，凝胶回收试剂盒（？1'0111683)，质粒小提试剂盒（？1'0111683)，核酸染料66 11^(1 (Biotium)〇
[0040] 细菌培养试剂:酵母提取物(0X0ID)，蛋白胨(0X0ID)，氨苄青霉素(4111代％〇)，1^-Agar(Sigma-Aldrich)〇
[0041 ] 实验用超纯水由Milli-Q纯水系统制备。
[0042]方法和结果：
[0043] (1)从cDNA中扩增基因片段
[0044]此步骤主要使用聚合酶链式反应（PCR)来扩增及定点突变IL-34cDNA，以生成 native IL-34和S98C IL-34的基因。PCR实验的反应体系总体积为50yL。体系组分如表1， PCR程序设置如图1表示，PCR引物见表2。
[0045] 表1 PCR反应体系组分
[0050] (2)PCR产物的回收提纯
[0051 ] PCR实验结束后，取5μ1反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确定PCR反应是否成功扩 增目的条带。琼脂糖凝胶电泳的设置参数为电压100V，电泳时间30min。
[0052]琼脂糖凝胶电泳后，使用Promega公司的PCR产物回收试剂盒提取产物中的目的基 因。提取步骤按照试剂盒说明书进行。
[0053] (3)目的基因的双限制酶切及连接
[0054]使用限制性剪切酶处理纯化后的产物以及载体质粒BacMam。根据引物设计时的酶 切位点选择相应限制性剪切酶，实验中使用的限制性剪切酶包括BamHI，NotI，XhoI等，反应 体系如表3。
[0055]表3双限制连接酶实验组分
[0056]
[0057] 将酶切反应体系置于37°C水浴3h。然后使用琼脂糖凝胶电泳得到酶切好的目的产 物条带以及载体质粒条带。使用Promega公司的DNA回收试剂盒提取凝胶中的目的基因与载 体质粒。提取步骤按照试剂盒说明书进行。
[0058]双限制性酶切处理后，将目的基因与载体质粒连接，反应体系见表4。反应在室温 下进行60min。
[0059] 表4目的基因与载体连接的反应组分
[0060]
[00611 (4)连接产物的转化
[0062]将连接产物加入从_80°C冰箱里取出后加入刚刚融化的100μΙ DH5a感受态细胞 中，在冰上静置30min。然后在42°C水浴中热激90s，迅速转移至冰上放置2min左右。在超净 台中加入800μ1 S0C培养基，放入37 °C、5rpm摇床中复苏40min。最后将菌液均匀涂布在加有 氨苄青霉素的LB平板上进行抗性筛选，在37°C培养箱中放置14~16h。
[0063] (5)阳性克隆的筛选
[0064]挑取单菌落接种于添加有氨苄青霉素的3ml LB培养基中，放入37°C、180rpm摇床 中培养12~14h。利用Promega质粒小提试剂盒提取质粒，并进行酶切鉴定，选取鉴定结果为 阳性的克隆进行基因测序，测序工作测序公司完成。将测序结果正确的质粒保存于_20°C冰 箱中备用。
[0065] 2.重组蛋白的表达
[0066] 材料：
[0067] 本实施例中用于病毒扩增的的细胞系为sf9昆虫细胞，用于表达蛋白的细胞系为 HEK293细胞。
[0068] 表5用于病毒制备和蛋白表达的真核细胞系
[0069]
[0070]昆虫细胞培养基包括:Grace，SF-II 900(Gibco)
[0071] 哺乳动物细胞培养基:DMEM(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，青链霉素 (Gibco)
[0072] 转染试剂：〇6111^(31:;[11(111￥；[1：1'0区611)
[0073]方法：
[0074] (1)利用昆虫细胞制备重组杆状病毒
[0075]①取对数生长期的sf 9细胞，使用台盼蓝染色法染色。当存活率在98 % (即98 %以 上的细胞没有被台盼蓝染色）时，取sf9细胞加入6孔板中，让每孔中细胞总数约1.0 X 107 个，体积约为2ml。将6孔板放入27 °C培养箱中静置贴壁lh。
[0076] ②取测序阳性的质粒6μ1与2μ1 BacVector-3000杆状病毒DNA混合，孵育5min。取 10μ1 Cellfectin转染试剂与100μΙ无双抗SF900昆虫培养基混合均匀。将上述两种混合液 混合均匀，孵育30min。
[0077] ③sf9细胞贴壁后，弃去原培养基，换成无双抗sf900培养基，并加入步骤2中的混 合液。放入27 °C培养箱中静置培养6h。
[0078]④6h后，将六孔板中的无双抗培养基替换成有双抗的sf900培养基。继续在27°C培 养箱中静置培养。
[0079] ⑤7d后，收获每孔的上清液，即为对应质粒的P1病毒。P1病毒滴度低，主要用于扩 增P2病毒或者储存于_80°C冰箱中保存。
[0080] ⑥将P1病毒按1:1000的体积比感染对数生长期的Sf9细胞。让细胞在27°C培养箱 中继续振摇培养。
[0081] ⑦感染约4d左右，当观察到细胞已经生长停滞，细胞变大，并且约半数细胞崩解 后，收获细胞的上清，即得P2病毒，保存于4 °C中以备使用。
[0082] ⑧如有需要，可以利用P2病毒按照步骤6，7来制备大批量的P3病毒。
[0083] (2)利用哺乳动物细胞表达蛋白
[0084] 此步骤将利用人胚胎肾细胞，即HEK293细胞表达蛋白。
[0085]①将HEK293细胞培养至密度约为3.0X106个/ml，并用台盼蓝染色法确保细胞存 活率在90%以上。
[0086]②将P2或P3病毒适量的加入HEK293细胞中，72h后，离心弃去细胞，收集上清培养 基。使用切向流超滤系统对培养基进行浓缩并不断加入HBS缓冲液，使目的蛋白的环境从 DMEM培养基交换到HBS缓冲液。
[0087]③将交换浓缩之后的目的蛋白溶液使用高速离心机，13000g离心20min，以清除溶 液中的细胞碎片。
[0088] (3)利用亲和层析提取目的蛋白
[0089] 此步骤利用设计蛋白时C末端加入的6个组氨酸标签(-HHHHHH)，采用Ni-NTA琼脂 糖凝胶颗粒为固定相，对目的蛋白进行洗脱提纯。
[0090] ①将适量偶联Ni -NTA的琼脂糖凝胶颗粒加到高速离心后的蛋白溶液中，4 °C孵育1 ~2h〇
[0091] ②用含有20mM咪唑的清洗缓冲液清洗Ni-NTA琼脂糖凝胶颗粒，以洗去不与Ni-NTA 络合的非目的蛋白。
[0092]③使用含有40mM以及300mM咪唑的洗脱缓冲液对Ni -NTA琼脂糖凝胶颗粒进行洗 脱，收集洗脱液，置于4 °C冰箱保存。
[0093] (4)利用SDS-PAGE检测目的蛋白
[0094]此步骤利用不同分子量的蛋白在SDS-PAGE蛋白电泳中前进的距离不同，从而鉴定 洗脱的蛋白是否为目的蛋白。
[0095]①取5μ1经亲和层析纯化的蛋白样品加入5 X上样缓冲液，混匀，95 °C加热5min，蛋 白充分变性后，于室温冷却。
[0096]②用微量加样器定量吸取经SDS变性的蛋白样品，加入电泳胶的加样孔中。
[0097]③设置电压140V，电泳时间约90min，待电泳至溴酚蓝指示剂达凝胶下缘时，停止 电泳。
[0098]④小心取下凝胶，放入盛有考马斯亮蓝R-250染色液的器皿中，盖好皿盖，在摇床 上于室温染色过夜。
[0099]⑤将凝胶移入盛有脱色液的器皿中，于室温下在水平振荡摇床上振荡脱色，直至 凝胶背景干净透明，蛋白条带显色良好为止。
[0100]⑥依据蛋白Marker的指示，鉴定所得蛋白是否为目的蛋白。
[0101] 结果：
[0102] native IL-34和S98C IL-34表达成功，单体分子量为25KD，符合预期，SDS-PAGE结 果参见图2。
[0103] 3.蛋白纯化鉴定
[0104] 材料：
[0105] 0·22μπι 滤膜(PALL)
[0106] 超滤离心管(截留分子量为10000) (Merk)
[0107] GE AKTA FPLC蛋白纯化系统
[0108] GE superdex-200分析筛凝胶层析柱
[0109] 方法：
[0110] (1)经过SDS-PAGE的鉴定后，将相同的蛋白合并。使用截留分子量为10000的超滤 离心管将目的蛋白进行适当浓缩，以减少分子筛系统的上样次数。
[0111] (2)将浓缩好的蛋白样品用高速冷冻离心机离心，离心参数为4°C，13000rpm，离心 时间为l〇min。
[0112] (3)准备分子筛纯化系统的流动相。所有用于分子筛纯化系统的超纯水、缓冲液、 以及储存液(20%乙醇），用孔径为0.22μπι的滤膜过滤，然后用真空栗抽气lOmin，以排尽液 体内的气体。
[0113] (4)将GE superdex-200分析筛柱连接上纯化系统后，设置系统流速为0.5ml/min， 压力上限为1.5MPa，使用超纯水冲洗一个柱体积，再使用HBS洗脱缓冲液平衡一个柱体积。 [0114] (5)蛋白样品上样前，先使用HBS缓冲液清洗上样环，上样后，让系统开始洗脱，设 置接样体积为lml、洗脱体积为1.2个柱体积。
[0115] (6)将收集到的纯化液按进行SDS-PAGE实验，鉴定蛋白是否纯化成功。
[0116] 结果：
[0117] native IL-34和突变体S98C IL-34均能经过分子筛纯化系统纯化，洗脱峰集中于 15~17ml，参见图3。
[0118] 4.S98C IL-34蛋白晶体结构测定
[0119] 材料：
[0120] 结晶条件筛选试剂盒:包括Hampton、Wizard、Propl ex、Mems tart、Memsys这五个商 用筛选试剂盒。每个试剂盒包含96种筛选条件。
[0121] 用于配置结晶条件优化的各类试剂：
[0122] NaCl(Sigma-Aldrich)，Na-Citrate(Sigma-Aldrich)，LiS〇4(aladdin)，Na2HP〇4 (国药集团），KH2P〇4(国药集团），PEG系列（Sigma-Aldrich)，CHES(Sigma-Aldrich)，Tris (Genview)，（NH4)2S〇4(Alfa Aesar)，NaAc(Amresco)，MgCl2(Sigma-Aldrich)，CaCl2(国药集 团）。
[0123] 方法及结果：
[0124] 使用结晶条件筛选试剂盒，用座滴法在20°C筛选S98C IL-34的结晶条件。待S98C IL-34结晶后，按照筛选的结晶条件进行优化，优化的结晶条件如表6，S98C IL-34的蛋白质 晶体如图4。
[0125] 表6 6017晶体的优化条件
[0126]
[0127] 晶体衍射数据的收集工作在北京高能物理所同步辐射装置（BSRF)完成。用 HKL2000软件处理衍射数据，用CCP4软件解析晶体结构。得到S98C IL-34的晶体结构与 native IL-34的结构没有明显差异（图5KFO-FC差值电子密度图表明S98C IL-34的第98号 残基已经突变成半胱氨酸，并与第168号半胱氨酸残基形成二硫键(图6)。
[0128] 5.同步辐射光源圆二色谱法(⑶)测量热稳定性
[0129] 仪器和材料：
[0130] (1)仪器
[0131] 同步辐射圆二色谱所使用的仪器位于BSRF的4B8真空紫外光束线(BSRF 4B8 VUV beamline)，该束线能提供125~360nm的真空紫外和紫外光、4~90°C的温度范围用于圆二 色谱测试。
[0132] 实验站提供的石英样品池包括不同的光程:0.01mm，0.1mm，0.2mm，1mm。其中光程 1mm的样品池，容积为350yL。光程0.1mm的样品池，容积约为数十微升。实验中，我们使用的 是光程为〇.1_的样品池。
[0133] 实验站圆二色谱仪器的控制采集软件为BSRF 4B8 VUV Station。通过软件的控制 界面，可以直接选择圆二色谱扫描的起始与终止波长，扫描波长的间隔，每次扫描的次数以 及恒温时间等，因此可以通过控制软件来设置参数进行自动的连续变温实验。
[0134] (2)实验样品
[0135] 实验为表达的native IL-34和S98C IL-34重组蛋白。
[0136] 样品准备时将PBS中原来的NaCl更换成NaF，以减少Cr对于圆二色谱的干扰。
[0137] 方法：
[0138] (1)装样
[0139] 实验中使用的样品池光程为0.1mm。
[0140] 样品池由两片圆形石英玻璃叠合而成。两片石英玻璃在盖合时，标记的区域严格 贴合在一起。在装样完毕，两片样品池玻璃按标定位置叠合并严格确认没有气泡后，将样品 池装入样品架。
[0141] 样品池装入样品架时，样品池的叠合点对应样品架的外侧凹槽。然后将组装好的 样品架放入样品室，之后盖上样品室的保温罩，并合上样品室的盖子。
[0142] (2)光谱测量
[0143] 实验中的溶液组分为native IL-34和S98C IL-34的浓度分别为80μΜ，变性剂盐酸 胍的浓度为1Μ，溶液缓冲体系为PBS，PBS中的NaCl被替换成NaF。
[0144] 变温过程中，设置 10个温度点，分别为：25°C，35°C，45°C，50°C，55°C，60°C，65°C， 70°C，75°C，80°C，到达最高温度点载返回25°C的最低点进行一次测量。每个温度点恒温时 间为5分钟，让蛋白充分加热。每次测量的波长范围为200nm~260nm，扫描间隔为lnm，每个 温度点测量三次。
[0145] 结果：
[0146] 同步辐射圆二色谱仪器记录同一个温度所有三次测量的读数，因此同一个温度下 会有三组实验数据，实验得到的原始数据图像见图7和图8。
[0147] 选取原始数据中的222nm的椭圆率计算出的去折叠成分Fu为因变量(等式A)，温度 为自变量，使用二态转化平衡公式（Jackson · et al · Biochemistry · 1991; Nicholson · et al .Biochemistry. 1996;等式 B)来拟合 native IL-34 和S98C IL-34 的Tm。
[0148] . A
[0149] 其中，[Θ]Ν为起始温度时蛋白处于100%折叠状态下的CD值，[Θ]为不同温度下的 ⑶值，[9]d为蛋白已经100%变性去折叠的⑶值。
[0150] B
[0151] 其中，R为理想气体常数，R=1.987cal/(K · mol)，T为蛋白质所处的温度，Tm为蛋 白质在热变性过程中的melting temperature，AHm为温度处在Tm时蛋白质的洽变。
[0152] 表7 native IL-34和S98C IL-34的二态转化方程的求解结果
[0153] 拟合结果如表7,拟合曲线参见图9。
[0154]
[0155] 根据拟合计算结果，native IL-34的Tm为50.9°C，S98C IL-34的Tm为58.5°C，S98C IL-34的Tm相比native IL-34提高了7.6°C，说明本实施例的突变体S98C IL-34的热稳定性 优于native IL-34。
[0156] 6.细胞增殖实验
[0157] 材料：
[0158] M-NFS-60 细胞
[0159] 用于M-NFS-60细胞复苏以及传代的rhCSF-Ι购自Gibco以及义翘神州。使用的培养 基配方为：
[0160] PRMI 1640培养基(Gibco)
[0161] 10% 胎牛血清(Gibco)
[0162] 100U/ml penicillin&streptomycin(Gibco)
[0163] 60ng/ml rhCSF-1
[0164] 方法：
[0165] (1)用含rhCSF-1的培养基悬浮培养M-NFS-60细胞至对数期，再在无 rhCSF-1培养 基中饥饿24小时；
[0166] (2)将细胞按照每孔0.1 X 106个加入到96孔全不透光白板中；细胞分为四组，只加 PBS为阴性对照组，rhCSF-Ι为阳性对照组，实验组为native IL-34、S98C IL-34两组。加入 蛋白的浓度梯度为：
[0167] 10-3，10-2，10-1，10。，10 1，1〇2，1〇3，1〇4, l〇5(ng/ml)
[0168] (3)将细胞放入37°C二氧化碳培养箱悬浮培养;3d后使用CellTiter-Glo试剂盒处 理细胞，并使用Flexstation焚光测量仪测量相对焚光读值(relative light units，RLU)。
[0169] 细胞样品的RLU分别对rhCSF-l、native IL-34、S98C IL-34的剂量依赖关系曲线 如图10所示;推算出三者促细胞增殖的EC5Q值如表8所示。
[0170] 表8
[0171]
[0172] 其中，native IL-34、S98C IL-34的EC5q浓度分别为 1066ng/ml和973ng/ml说明 S98C IL-34和native IL-34促M-NFS-60细胞增殖的能力相近。
[0173] 7 .S98C IL-34和native IL-34激活CSF-1R能力的对比
[0174] 材料：
[0175] 此步骤中用于转染表达全长CSF-1R的宿主细胞为HEK293细胞。
[0176] -抗为兔源CSF-1R抗体（anti-CSF-lR)，兔源磷酸化CSF-1R抗体（anti-phosphoCSF-lR-Tyr723)，均购自 CST〇
[0177] 二抗为山羊抗兔IgG抗体(碧云天）。
[0178] 细胞裂解液(碧云天）
[0179] 方法：
[0180] (1)取37°C二氧化碳培养箱中正常生长的HEK293细胞，等量分入六孔板中，每孔细 胞数为1 .〇X 1〇6。在每孔中加入等量且适量的CSF-1R杆状病毒。
[0181 ] (2)72h后使用无血清DMEM将每孔细胞洗细胞两遍，并将细胞置于无血清DMEM中饥 饿 16h。
[0182] (3)将细胞分为三组:实验组为native IL-34和S98C IL-34，每孔加入蛋白至其终 浓度为5μg/ml;阴性对照组细胞中仅加入PBS。
[0183] (4)5min后将细胞离心，并用4°C PBS洗三遍，然后在裂解液冰上裂解30min。
[0184] (5)取细胞裂解液于Nanodrop蛋白定量仪上定量，确保每个上样孔的蛋白量相同， 然后进行SDS-PAGE电泳。
[0185] (6)SDS-PAGE结束后，对电泳胶进行Western blot处理。其中一抗(anti-CSF-lR和 anti-phosphoCSF-lR-Tyr723)稀释度为1:1000，孵育2h;二抗稀释度为1:2000,孵育时间为 50min。然后进行曝光处理，收集图像结果。
[0186] 结果：
[0187] 图11以及图12表明S98C IL-34和native IL-34突变体激活CSF-1R自磷酸化的能 力没有明显差异，从而说明S98C IL-34与native IL-34具有相近的生物学活性。
[0188] 8.S98C IL-34分子内部二硫键Cys98-C168的保守性分析
[0189] 如图13的灰色区域所示，人源IL-34(Uniprot ID:Q6ZMJ4)的Ser98和Cysl68在其 他物种的IL-34 (小鼠 Q8R1R4、牛A6QL48、大鼠 Q4KM46、斑马鱼L8AZT5、黑猩猩H2QBG6、猫 M3XD55、大熊猫G1L622)中绝对保守。在其他物种IL-34中与人源IL-34的98和168号残基同 源的位置上引入二硫键，以提高其热稳定性的做法，视为与在S98C IL-34分子内部引入二 硫键Cys98-C168提高热稳定性的原理相同，属于本发明的保护范围。
[0190]虽然结合了附图描述了本发明的实施方式，但是对于本领域技术人员来说，在不 脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种提高白细胞介素 IL-34热稳定性的方法，其特征在于：所述方法通过对人源IL- 34进行氨基酸定点突变，将人源IL-34的98号丝氨酸突变成半脫氨酸，即S98C IL-34dS98C 比-34的氨基酸序列如下：2. -种提高白细胞介素 IL-34热稳定性的方法，其特征在于:所述方法通过杆状病毒- 哺乳动物细胞表达系统制备化-34突变体。在本发明中，将GeneBank ID:NM_152456的表达 蛋白质的化-34 cDNA中编码98号丝氨酸的密码子age,采用基因定点突变为编码半脫氨酸 的密码子tgt;将突变后的S98C化-34 cDNA克隆至转移载体BacMam，获得的转移质粒与 BacVector-3000杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞，W制备S98C比-34的重组杆状病毒；再 使用重组杆状病毒转导HEK 293细胞表达S98C IL-34。3. -种提高白细胞介素 IL-34热稳定性的方法，其特征在于：在人源IL-34分子内部即 98和168号氨基酸残基之间，或在其他物种IL-34中与人源IL-34的98和168号残基同源的位 置上引入二硫键。
【文档编号】C07K14/54GK106084030SQ201610255350
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年4月25日 公开号201610255350.1, CN 106084030 A, CN 106084030A, CN 201610255350, CN-A-106084030, CN106084030 A, CN106084030A, CN201610255350, CN201610255350.1
【发明人】刘合力, 黄国龙, 丁焕弟, 李硕
【申请人】北京大学