专利名称:血小板形态扫描成像和血小板活化功能评估的方法
技术领域：
本发明涉及一种血小板形态扫描成像和血小板活化功能评估的方法。
背景技术血小板是血液中具有特定的形态结构和生化组成的有形成分之一，其主要生理功能是参与凝血与止血。血小板结构复杂且个体差异较大，因能运动和变形，往往表现为多形态。循环血液中正常状态的血小板呈椭圆形或圆盘形，平均直径约2 4微米。血小板易受机械、化学刺激而活化并导致形态改变。当血小板一旦与创伤面或激活剂接触，可扩展成为圆片状血小板，以增加凝血与止血的面积。凝血酶、ADP、肾上腺素和胶原等都是血小板的激活剂。任何凝血与止血过程也都涉及血小板的活化，因此通过体外实时检测激活剂作用下血小板形态的变化，即可直观评估血小板的生理功能。目前用于检测血小板形态的方法和仪器种类较多，其中普通光学显微镜及激光共聚焦显微镜的分辨率仅能达到200纳米左右，不能满足血小板微观形貌高分辨率观测的需要。扫描电镜(SEM)尽管具有足够高的分辨率，但需要对血小板进行固化和特别处理以实现样品的导电性，这势必会改变、甚至破坏血小板表面的微观结构，因此根本不适合活体血小板的观测。而扫描探针显微镜家族中作为高分辨率生物成像研究有力工具的原子力显微镜(AFM)，已被用于血小板微形貌的三维拓扑结构研究，但由于其利用探针针尖与血小板膜间的相互作用力进行负反馈控制以实现扫描成像，扫描中探针与活体血小板的轻微接触不可避免，不仅会损伤血小板的表面结构，其机械作用力也可激活血小板引起形态变化，因此也不能满足血小板激活剂作用前后微形貌成像的需要。
为了克服原子力显微镜需要扫描探针与样品接触而损伤或激活生物样品的缺点，加州大学的Hansma教授于1989年发明了非接触式的扫描离子电导显微镜技术(scanningion conductance microscopy, SICM),由于当时负反馈控制方法及精确定位技术的局限与不足，纤细的玻璃微滴管探针在扫描时经常意外地与样品接触并导致针尖或样品损坏，SICM技术在其发明后的很长一段时间仅适用于平坦的聚酯薄膜扫描成像。近年来SICM技术通过改进定位及扫描控制技术实现了在生理液态培养条件下实时、非接触式地对活体生物样品表面三维微观结构的探测。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种血小板形态扫描成像的方法。
本发明的第二个目的是提供一种血小板活化功能评估方法。
本发明的技术方案概述如下
一种血小板形态扫描成像的方法，包括如下步骤
( I)血小板样品的制备
取2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，离心后得到富血小板血浆；取200 μ L所述富血小板血浆放置于涂覆有200 μ L浓度为2mg/mL的纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育20-30分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入
I.5-2mLPBS缓冲液后备用；
(2)将连接在扫描离子电导显微镜的Ag/AgCl参比电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中；将连接在扫描离子电导显微镜的探测电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中，所述探测电极是一设置在充灌有PBS缓冲液的纳米吸管内的Ag/AgCl电极；
(3)用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的距离，记录下所述探测电极的位置，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图。
一种血小板活化功能评估方法，包括如下步骤
(I)血小板样品的制备
取2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，离心后得到富血小板血浆；取200 μ L所述富血小板血浆放置于涂覆有200 μ L浓度为2mg/mL纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育20-30分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入
I.5-2mLPBS缓冲液后备用；
(2)将连接在扫描离子电导显微镜的Ag/AgCl参比电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中；将连接在扫描离子电导显微镜的探测电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中，所述探测电极是一设置在充灌有PBS缓冲液的纳米吸管内的Ag/AgCl电极；
(3)用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的距离，记录下所述探测电极的位置，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图；
(4)再向细胞培养皿中加入激活剂，作用10-20分钟，通过计算机绘制得到加入所述激活剂10-20分钟血小板表面形貌的三维拓扑结构图。
所述激活剂为凝血酶或ADP,所述凝血酶的加入量是使凝血酶的终浓度为2U/mL,所述ADP的加入量是使ADP的终浓度为5 μ M0
激活剂还可以选择肾上腺素或胶原，其浓度可以根据实际情况进行调节。
本发明一种血小板形态扫描成像的方法及一种血小板活化功能评估方法，能实时直观地观察在添加激活剂前后血小板的形态学表现，不仅可简便快捷地精准测定扫描范围内血小板数量(PLT)和平均血小板体积(MPV)等形态参数，更可以通过上述血小板在添加激活剂后的活化形态改变来评估血小板的活化功能。此检测方法无需染色及任何特殊处理，更无需昂贵的试剂，且操作简便。
图IA为计算机绘制的实施例I得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图。
图IB为计算机绘制的实施例2得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图。
具体实施方式
实施例I
一种血小板形态扫描成像的方法，包括如下步骤
( I)血小板样品的制备[0026]抽取健康人2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，150Xg离心15分钟得到富血小板血浆；取200 μ L所述富血小板血浆放置于涂覆有200 μ L浓度为2mg/mL人纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育30分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入I. 5mL PBS缓冲液后备用；
(2)将连接在扫描离子电导显微镜的Ag/AgCl参比电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中；将连接在扫描离子电导显微镜的探测电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中，所述探测电极是一设置在充灌有PBS缓冲液的纳米吸管内的Ag/AgCl电极；
(3)用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的恒定距离(即探测电极与血小板不发生任何物理接触)，记录下所述探测电极的位置(记录下在扫描范围内达到距血小板表面设定距离时探测电极的针尖的位置)，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图，见图1A，并能准确获得扫描范围内血小板数量(PLT)为20和平均血小板体积(MPV)经扫描离子电导显微镜图形处理软件分析计算为9. 93fL。
实施例2
一种血小板活化功能评估方法，包括如下步骤
(I)- (3)同实施例 I 的(I)- (3);
(4)再向细胞培养皿中加入激活剂凝血酶，使凝血酶的终浓度为2U/mL作用10分钟，利用SICM技术对加入凝血酶10分钟后活体血小板表面形貌进行观测以SICM控制器监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得探测电极与血小板保持恒定距离，探测电极在细胞表面的轨迹即为加入一定浓度激活剂10分钟后活体血小板的表面三维拓扑结构，并准确获得激活后的圆片状血小板的数量；通过计算机绘制得到加入凝血酶血小板表面形貌的三维拓扑结构图，(见图1Β，50Χ50μπι)。血小板活化后展开成圆片状，圆片状血小板数量与激活剂作用前相比增加了 2. 5倍。)
利用SICM图像处理分析软件比较激活剂作用前后血小板形貌的变化来评估其活化功能。
实施例3
一种血小板形态扫描成像的方法，包括如下步骤
( I)血小板样品的制备
取2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，离心后得到富血小板血浆；取200 μ L所述富血小板血浆放置于涂覆有200 μ L浓度为2mg/mL人纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育20分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入2mLPBS缓冲液后备用；
(2)同实施例I的(2);(3)用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的恒定距离(即探测电极与血小板不发生任何物理接触)，记录下所述探测电极的位置(记录下在扫描范围内达到距血小板表面设定距离时探测电极的针尖的位置)，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图，该图与实施例I的通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图相似。
实施例4[0041]一种血小板形态扫描成像的方法，包括如下步骤
( I)血小板样品的制备
取2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，离心后得到富血小板血浆；取200 μ L所述富血小板血浆放置于涂覆有200 μ L浓度为2mg/mL人纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育30分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入2mLPBS缓冲液后备用；
(2)同实施例I的(2);
(3)用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的恒定距离(即探测电极与血小板不发生任何物理接触)，记录下所述探测电极的位置(记录下在扫描范围内达到距血小板表面设定距离时探测电极的针尖的位置)，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图，该图与实施 例I的通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图相似。
实施例5
一种血小板活化功能评估方法，包括如下步骤
(I)- (3)同实施例 I 的(I)- (3);
(4)再向细胞培养皿中加入ADP，使ADP的终浓度为5μ M作用20分钟，通过计算机绘制得到加入ADP 20分钟血小板表面形貌的三维拓扑结构图。所述血小板表面形貌的三维拓扑结构图与实施例2的血小板表面形貌的三维拓扑结构图相似。
实验证明，激活剂凝血酶或ADP的终浓度作适当调整，也可以用于本发明。
实验证明，选用肾上腺素或胶原作激活剂，也可以用于本发明。
通过商用膜片钳技术测量探测电极的阻值110ΜΩ。
通过SICM扫描软件设定好扫描参数后，通过负反馈控制使得探测电极逐渐接近血小板，并最终达到探测电极与血小板保持恒定距离的状态，同时应监控流入探测电极电流的变化，以监测整个接近过程的稳定性。探测电极达到in control状态时，即可开始对血小板形貌进行扫描成像，其走过的轨迹即为正常血小板的三维拓扑结构(见图2A，50Χ50μπι)。在扫描离子电导显微镜血小板形貌的三维拓扑成像图中，可以精确地得到在扫描范围内的血小板数量(PLT)为20 (见图1A);这些血小板的平均血小板体积(MPV)经扫描离子电导显微镜图形处理软件分析计算为9. 93fL。
扫描完成后，加入血小板激活剂凝血酶，其终浓度为2U/mL，作用时间为10分钟，再进行扫描，即可得到被凝血酶激活后血小板形貌的三维拓扑结构(见图1Β，50Χ50μπι)。血小板活化后展开成圆片状，圆片状血小板数量与激活剂作用前相比增加了 2. 5倍。
本发明的扫描离子电导显微镜采用英国ionscope公司扫描离子电导显微镜及图像处理软件。
扫描离子电导显微镜包括扫描离子电导显微镜扫描头、扫描控制器及信号米集处理器、压电陶瓷电源与驱动器等构成，用于实时记录血小板在加入一定浓度激活剂前后微观形貌的变化。
上述所说的生理液态体外扫描环境为PBS缓冲液。
上述所说的组成探测电极的纳米吸管(硼硅酸盐或石英微电极玻璃毛细管)均由微探针拉制仪拉制而成。
权利要求
1.ー种血小板形态扫描成像的方法，其特征是包括如下步骤 (1)血小板样品的制备 取2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，离心后得到富血小板血浆；取200 μ L所述富血小板血浆放置于涂覆有200 μ L浓度为2mg/mL的纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育20-30分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入I. 5-2mLPBS缓冲液后备用； (2)将连接在扫描离子电导显微镜的Ag/AgCl參比电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中；将连接在扫描离子电导显微镜的探测电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中，所述探测电极是一设置在充灌有PBS缓冲液的纳米吸管内的Ag/AgCl电极； (3)用扫描离子电导显微镜监控流入探測电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃 的探测电极与血小板间保持设定的距离，记录下所述探测电极的位置，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图。
2.—种血小板活化功能评估方法，其特征是包括如下步骤 (1)血小板样品的制备 取2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，离心后得到富血小板血浆；取200 μ L所述富血小板血浆放置于涂覆有200 μ L浓度为2mg/mL纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育20-30分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入I.5-2mLPBS缓冲液后备用； (2)将连接在扫描离子电导显微镜的Ag/AgCl參比电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中；将连接在扫描离子电导显微镜的探测电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中，所述探测电极是一设置在充灌有PBS缓冲液的纳米吸管内的Ag/AgCl电极； (3)用扫描离子电导显微镜监控流入探測电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的距离，记录下所述探测电极的位置，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图； (4)再向细胞培养皿中加入激活剂，作用10-20分钟，通过计算机绘制得到加入所述激活剂10-20分钟血小板表面形貌的三维拓扑结构图。
3.根据权利要求
2所述的ー种血小板活化功能评估方法，其特征是所述激活剂为凝血酶或ADP，所述凝血酶的加入量是使凝血酶的终浓度为2U/mL，所述ADP的加入量是使ADP的终浓度为5 μ M0
专利摘要
本发明公开了一种血小板形态扫描成像和血小板活化功能评估的方法，血小板形态扫描成像方法的步骤为(1)血小板样品的制备；(2)将连接在扫描离子电导显微镜的参比电极和探测电极放置在步骤(1)获得的细胞培养皿中；(3)用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的距离，记录下所述探测电极的位置，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图。本发明的方法，能实时直观地观察在添加激活剂前后血小板的形态学表现，不仅可简便快捷地精准测定扫描范围内血小板数量和平均血小板体积等参数，还可评估血小板的活化功能。本发明的方法操作简便，成本低。
文档编号G01Q60/44GKCN102662088SQ201210156850
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月18日
发明者张建宁, 张彦军, 董京飞 申请人:天津医科大学总医院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan