专利名称：血小板检测用微芯片及使用该微芯片的血小板检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用微量血液检测血液中血小板功能的微芯片及使用该微芯片的检测装置。
背景技术：
(血小板凝集检测的现有技术存在的问题)血小板的活化及凝集在动脉中的血栓形成(白色血栓)或初期止血中发挥着关键作用。当血管受损时，血小板与血管内皮细胞下存在的胶原蛋白直接和间接地结合。在 血流缓慢的环境下(低剪切应力下)，它们的结合主要是经由诸如GPVI等胶原蛋白受体的直接结合；而在血流快速的环境下(高剪切应力下)，vWF与胶原蛋白结合，并且血小板的GPIba受体与vWF结合,从而导致血小板与胶原蛋白的间接结合。与胶原蛋白的直接和间接相互作用使血小板活化，并且通过这种刺激，从致密颗粒和a -颗粒释放诸如ADP和血清素等各种血小板活化物质。上述释放出的血小板活化因子可使血小板自身和周围的血小板活化。受到活化的血小板使纤维蛋白原受体GPIIb、IIIa经历活化型的结构变化，使血小板对于纤维蛋白原变为高亲和型。通过二聚体纤维蛋白原，活化的血小板彼此顺次交联，形成血小板凝集。但是，目前测定血小板凝集的装置多数为测定通过大量血小板活化试剂的刺激使血小板活化和凝集过程的方法(非专利文献I)。因此，在与生理性血小板活化条件很不相同的环境下诱发血小板活化反应，可测定各种受体的先天性功能异常等明显的功能差异，但是测定更多的生理性的血小板功能却很困难。PFA-100 (血小板功能分析仪非专利文献2)是测定孔堵塞的系统，所述孔堵塞是通过与固定化的胶原蛋白接触、剪切应力、与血小板诱导物质接触而引起综合性的血小板活化的孔堵塞。与目前单独的由血小板活化诱导物质的刺激引起的血小板凝集相比，这是一种更接近生理性环境的测定系统。但是，无法调节数据波动以及经过孔的血液中含有的诱导物质的浓度，因此，无法适宜地测定血栓症发病引起的血小板已被活化的患者中发现的血小板活化诱导物质浓度非常低或不存在的情况下诱导的血小板凝集，以及血小板功能异常患者中测定血小板功能的情况下由极高浓度的血小板诱导物质刺激引起的血小板凝集能力。此外，专利文献I中公开了一种测量血小板功能的方法，其特征在于，使血液经过毛细管内部，然后经过分隔件的开口部；随后，测定血栓形成堵塞开口部所需的时间。在该方法中，加入大量血小板活化试剂，在生物体内血小板被活化而使血小板数量减少的情况或血小板数量正常但血小板功能弱的情况等情况下，很难测定反映生物体状况的详细的血小板功能。专利文献
专利文献I :特开2007-298511号公报非专利文献非专利文献I :血小板凝集能検查(血小板凝集能力检测),Thrombosis and Circulation，vol. 12，No. 4，pl7_20，2004非专利文献2 =PFA-IOO d 6血小板凝集能測定(由PFA-100P测定血小板凝集能力)，Thrombosis and Circula tion, vol. 13, No. 3, p90-94, 200
发明内容
例如，败血症、弥散性血管内凝血综合征(DIC)等疾病中，由于血管内皮紊乱和血栓形成，血小板处于被活化的状态，进一步地，还形成血小板与白细胞的复合体等。此外，持续的血栓形成引起血小板显著被消耗,尽管生物体内有血栓形成,但同时还有出血症状。目前的血小板功能检验中，难以进行严格反映这种症状的检测。例如，在浊度法中，即使血小板数量减少，如果对于血小板诱导物质的反应性依然亢进，则判断血小板功能亢进(增强)。此外，对于生物体内的炎症反应等形成的血栓形成有较大影响的血小板-白细胞复合体在用于制成富含血小板的血浆进行离心分离时与红细胞共同沉淀，因此，在富含血小板的血浆中不含有该成分。此外，在使用PFA-100的情况下，由于无论血小板功能强的患者还是血小板功能弱的患者均在相同浓度的诱导物质下进行测定，因此，无法适当地进行检测以确认在没有诱导物质或诱导物质含量很少的状态下引起的自然凝集诱导或确认对于给予抗血小板药物的患者中在诱导物质浓度非常高的情况下该药物的效果。此外，即使通过PFA-100测定时堵塞时间延长的情况下，也难以进行血小板功能弱的情况和血小板功能亢进(生物体内受到活化)但血小板数量少的情况之间的数据比较等。鉴于上述情况，本发明的课题是提供一种在与血流同等环境下，使用微量血液可高效、正确地评价血小板功能的装置和方法。为解决上述课题，本发明提供一种微芯片，其特征在于，所述微芯片是通过血液在流路中流动以诱导血小板凝集而测定血小板功能的微芯片，所述微芯片具有设置在内部的流路，为了与血小板粘附，所述流路中至少局部涂覆有胶原蛋白，多个壁沿着所述流路中血液流动的方向延伸且将所述流路的宽度分隔形成流路分隔部，对所述壁施予表面粗糙度(Ra)变成IOlOOnm的处理。流路分隔壁的位置优选在流路上的血小板易粘附面(胶原蛋白涂覆部)存在的位置上沿着血液流动的方向延伸。此外，流路中，流路分隔部以外部分的表面粗糙度优选不到10nm。表面粗糙度(Ra)变成IOlOOnm的处理优选通过等离子体辐射或紫外线照射进行。此外，血液在流路中以一定速度流动形成血小板凝集块的同时测定血液流入压力时，前述微芯片的耐压性优选为80kPa以上。此外，前述微芯片优选为在流路分隔部的上游(该流路上以血液流动方向为基准的该血栓形成诱导部的上游)进一步设置有防杂质流入部。另外，本发明为提供含有前述任意微芯片的血小板功能检测装置。前述血小板功能检测装置优选进一步装配有用于收容血液的容器、用于将血液从所述容器输液至微芯片内的流路的输液泵以及测定施加于所述泵的压力的压力传感器。另外，前述血小板功能检测装置优选装配有废液储存部，所述废液储存部位于微芯片内部的胶原蛋白涂覆部的下游(该流路上以血液流动方向为基准的胶原蛋白覆盖部的下游)，用于储存经过胶原蛋白涂覆部的血液废液。另外，本发明提供一种血小板功能检测方法，其特征在于，通过使血液经过前述任意的微芯片或前述任意的血小板功能检测装置的流路，在流路分隔部和胶原蛋白涂覆部中引起血小板凝集的同时，测定所述血液流向所述流路的流入压力，由此检测血小板的功能。本发明的权利要求I中所述的血小板功能用微芯片，在微芯片内部流路的局部，设置有胶原蛋白涂覆部和配备有流路分隔壁的流路分隔部，所述流路分隔壁沿着所述流路中血液流动的方向延伸且将所述流路的宽度进行多个分隔。对所述壁施予表面粗糙度(Ra)变成IOlOOnm的处理，由于进行了上述处理，胶原蛋白上形成的血小板凝集块在流路分隔部得以稳定化，进一步引起强烈的、稳定的压力上升，提高数据的重现性。通过引起强烈的压力上升，可评价血小板凝集块的坚固性或脆弱性及其稳定性(持续性)。··本发明的权利要求2中所述的血小板功能用微芯片，由于表面粗糙度(Ra)变成IOlOOnm的处理通过等离子体辐射或紫外线照射进行，不仅是流路分隔壁表面的物理性质(表面粗糙度)还有化学性质(羟基、亚氨基、酰胺基等官能团的引入)都可处于适于血小板凝集的状态。本发明的权利要求3中所述的血小板功能用微芯片，由于流路中，流路分隔部以外部分的表面粗糙度不到10nm，在血小板易粘附面(胶原蛋白涂覆部)和流路分隔部特异性地促使血小板凝集块的形成，可特异性地分析血小板凝集块的形成。本发明的权利要求4中所述的血小板功能用微芯片，由于血液在流路中以一定速度流动形成血小板凝集块的同时测定血液的流入压力时，耐压性为SOkPa以上，可进行灵敏度更高的测定。本发明的权利要求5中所述的血小板功能用微芯片，由于流路分隔部的上游设置有防杂质流入部，不易产生由样品中的杂质引起的测定误差而可以进行正确的测定。本发明的权利要求6中所述的血小板功能检测装置，由于装配有权利要求广5中任意一项所述的血小板功能用微芯片，可高效地促进血小板凝集，在短时间内高灵敏地测定血小板功能。本发明的权利要求7中所述的血小板功能检测装置，由于装配有用于收容血液的容器、用于将血液从所述容器输液至微芯片内的流路的输液泵以及测定施加于所述泵的压力的压力传感器，因此，优选可通过流入血液的压力定量地评价血小板功能。本发明的权利要求8中所述的血小板功能检测装置，由于装配有废液储存部，所述废液储存部位于微芯片内部的胶原蛋白涂覆部的下游，用于储存经过胶原蛋白涂覆部的血液废液，因此，没有必要吸除血液废液，可简便地进行检测。本发明的权利要求9中所述的血小板功能检测方法，由于通过使血液经过前述任意微芯片或前述任意血小板功能检测装置的流路，在流路分隔部和胶原蛋白涂覆部中引起血小板凝集的同时，测定该血液流向流路的流入压力，由此检测血小板的功能，因此，可高效地促进血小板凝集，在短时间内高灵敏地测定血小板功能。
图I表示本发明的血小板检测用微芯片的第一实施方式的示意图。图2表示本发明的血小板检测装置的第一实施方式的示意图。图3表示本发明的血小板检测用微芯片的第二实施方式的示意图。图4表示使用具有流路分隔部经等离子体处理的微芯片(A)(试验例I)、经紫外线处理的微芯片(B)(试验例2)或未经处理的微芯片(C)(比较例I)的血小板检测装置来检测流入血液的压力的结果示意图。图5表示使用具有流路分隔壁经等离子体处理的微芯片的血小板检测装置来测定阿司匹林的血小板凝集效果的结果示意图(试验例3)。纵轴表示压力(kPa)，横轴表示时间(分钟)。从给予阿司匹林的受试者采集的血液(给予阿司匹林)和未给药的同一受试者采 集的血液(对照)以9 ii L/分钟和27 u L/分钟的流速流动进行评价。图6表示使用具有流路分隔壁未经等离子体处理的微芯片的血小板检测装置来测定阿司匹林的血小板凝集效果的结果示意图(比较例2)。纵轴表示压力(kPa)，横轴表示时间(分钟)。从给予阿司匹林的受试者采集的血液(给予阿司匹林)和未给药的同一受试者采集的血液(对照)以9 ii L/分钟和27 u L/分钟的流速流动进行评价。
具体实施例方式首先，参照图对本发明的血小板检测用微芯片和血小板检测装置进行说明。但是，本发明的血小板检测用微芯片和血小板检测装置不限于下述方式。此外，本发明中的“血液”包括全血和富含血小板的血浆。图I为显示本发明微芯片的第一实施方式的概念图。以下，基于图I进行说明。图I (A)为第一基板100表面的平面图，其中在表面上刻有构成微芯片I的流路101的沟槽。该沟槽的横截面形状可为凹字状、U字状、V字状等任意形状。由于血小板凝集块很脆，为测定压力上升，优选沟槽的深度为lOymlOO 以下。优选沟槽的宽度为10 u nT3mm0此外，构成流路101的沟槽的第一端部(流入口一侧的端部)和第二端部(排出口一侧的端部)之间的部分，设置有沿血液流动方向延伸的多个流路分隔壁102，该流路的宽度被多个分隔形成流路分隔部103。此外，优选流路分隔壁102之间的间隔为200 u m以下。如果宽度在200 U m以下，在形成血小板凝集块的区域，即使在高血流、高剪切应力下，该凝集块也不被血流冲走而能使内部压力上升。此外，流路分隔部103中，流路101的宽度优选被流路分隔壁102分隔为5个以上。即，如果流路的宽度分隔为5个流路以上，可使各分隔流路的堵塞平均化，容易得到波动较小的数据。此外，只要能将流路101的宽度进行多个分隔，流路分隔壁102的形状则无特殊限制。为了提高与血小板凝集块的粘附性，对流路分隔壁102施予表面粗糙度(中心线平均粗糙度Ra)变成IOlOOnm的处理。特别是由于血小板的大小为f 2 y m左右，因此，优选引入IOlOOnm的粗糙度，可以不损坏分隔流路的形状，提高血小板凝集块的粘附性。优选通过等离子体或紫外线照射等进行该处理。
认为血小板凝集块对流路分隔壁的粘附性与流路分隔壁表面的物理性质(表面粗糙度)和表面的化学性质(羟基、亚氨基、酰胺基等官能团的引入)两方面有关。通过等离子体或紫外线照射处理不仅能使表面粗糙度增大，还能在流路分隔壁表面引入官能团。作为等离子体处理，可列举常压等离子体、真空等离子体、电晕处理等；作为紫外线处理可列举使用准分子激光、汞灯等进行处理。特别是对于常压等离子体，由于装置便宜可连续进行等离子体处理，因此优选。等离子体对流路分隔部进行特异性的辐射，由于可促进在血小板易粘附面(胶原蛋白涂覆部)和位于其附近的流路分隔部特异性地形成血小板凝集块，对血小板凝集块的形成进行特异性的分析，因此优选。健康正常人的血液以一定速度经过微芯片的流路，在流路分隔部形成血小板凝集块时，血液的流入压力上升至约80kPa。因此，优选微芯片的耐压性为SOkPa以上。流路分隔部103的上游(即，流路分隔壁102和第一端部(流入口一侧端部)之间的部分)在流路的宽度方向上以规定间隔设置有多个柱状体104，这形成防杂质流入部105。柱状体之间的间隔(空隙的长度)为可使血液通过但不能使杂质通过的长度为宜，优选为10^200umo对柱状体的形状没有特殊限制，可列举圆柱、多角柱等。图I (B)为第二基板110的平面图，其上刻有构成微芯片I的流入口 106和排出口 107的通孔。构成流入口 106的通孔和构成排出口 107的通孔的位置分别为叠置第一基板100时对应于第一基板100上的流路101的第一端部的位置和流路101的第二端部的位置。此外，第二基板110的内表面与第一基板100叠置时，覆盖第一基板100上的流路分隔壁102的位置上涂布胶原蛋白，由此形成血小板易粘附面108 (胶原蛋白涂覆部)。具体来说，如图I (C)所示形态，为了安全起见，将胶原蛋白大范围地涂覆在覆盖流路分隔壁102的位置上。此外，血小板易粘附面(胶原蛋白涂覆部)也可遍及流路的全长。图I (C)为微芯片I的平面图，其中，使第一基板100的沟槽与第二基板110的胶原蛋白涂覆部朝向内侧，将第一基板100与第二基板110叠置。虚线所示为流路101在微芯片I内部的存在位置。此外，本发明微芯片的第二实施方式中，如图3所示，如图I第二基板中对应于流路的第二端部的位置设置有通孔来取代排出口，第二基板210中对应于流路201的第二端部设置有连续的沟槽，通过与第一基板200贴合，也可作为储存经过血小板易粘附面208(胶原蛋白涂覆部)的血液废液的废液储存部207。由于废液储存部207的容积大于试验中使用的血液量，因此没有必要如第一实施方式中用泵等将血液废液从排出口吸出，因而可更简便地进行检测。此外，废液储存部207上设置有通孔，该孔也可作为空气孔209。此外，如果在对应于微芯片2的表面的空气孔209的位置上设置有血液吸收材料，即使在血液样品的量较多的情况下，血液废液也不会飞溅到微芯片外。作为血液吸收材料，可贴附例如海绵或布等。此外，也可在空气孔209上连接排出管，用于吸除血液废液。本发明的微芯片中，血小板易粘附面使用涂布的胶原蛋白，也可含有胶原蛋白和组织凝血激酶。血小板易粘附面是以不会随血流流出这样的高粘附强度将胶原蛋白涂布于血小板易粘附面108、208。胶原蛋白的涂覆通过例如特开平05-260950号公报或Blood. 1995年4月I日，85
(7):1826-35中记载的那样，将胶原蛋白溶解于酸性溶液，再将该溶液涂布于赋予亲水性的、玻璃或聚苯乙烯等基板的规定位置上，然后洗涤和干燥基板等方法，可以高粘附强度简便地进行涂覆。在将要涂覆于疏水性树脂等的情况下，在树脂表面进行亲水化处理之后，将胶原蛋白溶液涂布于所需区域，自然干燥或减压干燥，可得到涂层。在使用塑料作为基质材料的情况下，对表面进行亲水化处理后，用吸液管或注射器等分配器将胶原蛋白溶液涂布于所需区域，通过自然干燥或减压干燥，可容易地涂覆胶原蛋白或含有组织凝血激酶的胶原蛋白。微芯片的材质优选为金属、玻璃或塑料、硅树脂等。此外，从用于血液观测(特别是图像分析)的观点来看，优选透明的材质。进一步地，从形成回路的观点来 看，优选塑料，特别优选透明的塑料。材质为PDMS (聚二甲基硅氧烷)等硅树脂制成的情况下，由于基板之间的粘着性优异，使得甚至通过按压就可以将第一基板与第二基板叠置，而无需使用粘合剂等进行粘合，但是，在向微芯片的内部施加高压时，优选使用粘合剂。此外，通过使用聚(丙烯酸2-甲氧基乙基酯KPMEA)还可简便且有效地在非预期的区域抑制血液凝固。此外，微芯片的基板上设置的沟槽或孔可由刀具或激光束刻成，但在微芯片材质为塑料的情况下，可通过注射成型来形成。由于通过注射成型来形成可高效地制造稳定品质的微芯片，因此优选。对使用本实施方式的微芯片I的血小板功能检测的一个例子基于图I (C)进行说明。在第一流入口 106上连接有未图示的导管，通过导管连接有未图示的血液储存器(血液收容部)及输液泵。此外，通过连接的泵，将该泵内的液体注入储存器，将该储存器中的血液注入微芯片I的流路中。输液泵的液体为矿物油或生理盐水等比血液比重小的液体，通过输液泵将该液体导入预先填充血液的储存器中，该液体层叠在血液上，通过泵将该液体压出，可使血液导入流路中。通过测定该液体的流入压力可间接地测定血液流向流路的流入压力。此外，也可在储存器预先填充的血液中混合血小板活化试剂。血小板活化试剂可以干燥或液体状态预先置于储存器内，然后与血液混合。血液优选进行过抗凝处理。此处，作为抗凝处理使用的抗凝处理剂，可列举柠檬酸钠或钾、草酸钠或钾、A⑶(酸性柠檬酸葡萄糖)、乙二胺四乙酸(EDTA)盐等。上述抗凝处理剂可以作为粉末形式、冷干品形式、水溶液等溶液形式来使用。上述抗凝处理剂中，常用的3. 2%的柠檬酸钠由于可容易获得而优选。上述情况下，对于9体积血液，优选使用I体积的该抗凝处理剂。作为其他的抗凝处理剂，可使用肝素、水蛭素、凝血激酶适配体、玉米来源的胰蛋白酶抑制剂(1977. J. Biol. Chem 252. 8105)等。此外，也可使用多种抗凝处理剂。使用的抗凝处理剂为水蛭素的情况下，与柠檬酸进行抗凝处理的情况相比较，即使没有血小板活化试剂的处理，也会引起更强烈的血小板凝集，因此适用于剪切应力依赖性的血小板功能测定。通过柠檬酸进行抗凝处理血液的情况下，可对血小板活化试剂的刺激依赖性的血小板功能进行准确测定，适用于抗血小板剂的评价等。作为得到经抗凝处理的血液的方法，可在注射器或真空采血管中预先放置上述的抗凝处理剂再进行采血，此外，采血后迅速向血液中加入抗凝处理剂的方法也可得到经抗凝处理的血液。
进一步地，使用含有肝素的真空采血管等采血之后，加入肝素酶和适用于检测目的的抗凝处理剂，由此通过肝素酶分解肝素，可与适用于测定目的的抗凝处理剂置换。在抗凝处理的血液与血小板活化试剂混合的情况下，作为使用的血小板活化试齐U，可列举ADP、胶原蛋白、凝血酶、花生四烯酸和瑞斯托菌素等。该情况下，可进行对血小板活性试剂的血小板活化能力的评价。将血小板活化试剂以引起弱血小板活化的浓度与经抗凝处理的血液混合。可引起弱血小板活化的浓度为静止状态下不会引起不可逆的血小板凝集(血小板二次凝集)的浓度，例如，ADP的情况下，这一浓度为0. 001 u M^5 u M ;花生四烯酸的情况下，这一浓度为0. OOlmlTlmM。但是,在血小板功能异常和由于给予抗血小板剂引起的对于上述血小板活化试剂的反应性明显降低的情况下，测定该降低状态时，优选加入超过上述浓度的血小板活化试剂进行测定。从流入口 106导入并经过流路101的血液，经过流路分隔部103，产生剪切应力，增强血小板活化，在血小板易粘附面(胶原蛋白涂覆部)上粘着积聚。由此，由于血液的流入压力上升，通过检测血液的流入压力可对血液中含有的血小板功能进行评价。此外，观测经过流路分隔部103的血液的流速或性状，可进行血小板功能检测。 此外，血液样品中的杂质残留在防杂质流入部105，不会流入流路分隔部103，因此不会妨碍血小板凝集反应。供检测的血液从设置在流路101终端的排出口 107排出。然后，对使用微芯片I的本发明的血小板检测装置进行说明。图2为本发明的血小板检测装置的第一实施方式的血小板检测装置A的示意图，所述血小板检测装置由透明基板构成的微芯片I而组装。以下，基于图2对第一实施方式进行说明。微芯片I的流入口 106连接有倒置的容纳经抗凝处理的血液的储存器109 (血液收容部)，该储存器109连接有供给矿物油的输液泵111。输液泵111连接有未图示的压力传感器。这样，矿物油从输液泵111压入储存器109内，层叠在血液上，将血液压出到微芯片I的流路101内。血液经过流路101,到达具有血小板易粘附面108的流路分隔部103。另一方面，血液样品中的杂质残留在防杂质流入部105。通过输液泵111上连接的压力传感器测定流入压力可定量检测血小板功能。此夕卜，通过摄像机113观察在流路分隔部103中的血小板活化(血小板的粘着、凝集等)或伴随上述情况的毛细管堵塞，可进行血小板功能检测。进一步地，通过测定血液经过流路101的经过时间或经过量，可进行血小板功能检测。摄像机113连接有图像分析装置115，通过该装置可将血小板活化的状态成像。将通过拍摄内部血小板活化的视觉评价及通过压力上升对血小板活化的定量检测组合使用，对患者血液的状态进行综合判断是非常重要的。例如，在DIC等病变中，血小板在生物体内已经受到活化的同时血小板消耗而显著减少的情况下，压力上升或堵塞时间延迟。即使在上述情况下，通过摄像机拍摄内部也可从检测刚开始后立即确认血小板向血小板易粘附面(胶原蛋白涂覆部)的粘着和凝集的上升等，可综合判断患者血小板的状态。摄像机113也可沿着流路101的血流方向移动。此外，通过奎纳克林等对血小板进行荧光标记后分析血小板，该情况下，通过分析图像因发射荧光的单位面积的亮度进行观测，由此使观测结果数值化，可获得作为数据的观测结果。此外，将微芯片I置于平台状的加热器11 2上，通过加热器112加热至37°C，可在近似于生物体内的条件下进行测定。经过流路分隔部103的血液混合液可从排出口 107经排出管114平稳排出。实施例以下，通过列举具体的实施例对本发明进行进一步详细说明，但本发明不限于下述实施例。(微芯片和血小板功能检测装置的制造)准备两块透明基板图I (A)所示的第一基板100和图I (B)所示的第二基板110(株式会社U ★二 >制造的注射成型产品)。在第一基板100中，流路101的长度为20mm、深度为40 u m、宽度为2mm ;对于流路分隔部103，长度I. 5mm、宽度40 y m、高度40 y m的流路分隔壁102以40 y m为间隔等间隔设置，这部分形成流路分隔部103。进一步地，距离第一端部7. 5mm的位置以lOOym为间隔设置有13根直径为50 ii m的圆柱，形成防杂质流入部105。此外，将流路分隔部103置于々二 ” ^株式会社PS-601SW型常压等离子体辐射表面改性装置中，辐射探头设置在3. 5mm的高度，使用传送装置(12. 5mm/秒)进行4次等离子体辐射处理；以及通过七 >特殊光源株式会社制造的PL2002N-18型光表面处理装置在距离紫外灯30mm的位置进行5分钟的紫外线照射。将未处理、等离子体处理后、紫外线照射处理后,通过Zygo社制造的NewView6200型非接触表面形状测定仪分析各自的梳状区域的平滑性，结果如表I所示。表I
~PV~Ra
处理前20. 75 27&2
等离子体处理后 181.21 35. 56~
紫外线照射后105.28 102~PV :0. 14X0. 105mm中最大与最小的差值(单位nm)Ra :距离平均的高度偏离(平均分6 ^高怒^解離)/测定点数(单位nm)通过以上等离子体处理、UV照射处理可形成IOlOOnm水平上的表面粗糙度。此外，下述的实验中，使用流路分隔部经如下处理的微芯片进行等离子体处理的微芯片、紫外线照射处理的微芯片及未处理的微芯片。第二基板100中，流入口 106和排出口 107所形成的孔为内径2mm、深2mm的圆形横截面的通孔。此外，在第二基板110与第一基板100的流路分隔部103重合的位置上，涂布0. 75mg/mL的I型胶原蛋白(新田七’十 >制造)，再经真空干燥，得到血小板易粘附面108。使构成第一基板100的流路101的沟槽的开口面与第二基板110的具有血小板易粘附面108的面相对，通过硅烷偶联剂，在60°C进行3小时的热压贴合，制成图I (C)所示的微芯片I。如图2，将制造的微芯片I置于平台状的加热器112(加热至37°C)上，微芯片I的流入口 106与储存器109连接，储存器109通过导管与泵111连接，施加于泵的压力用未图示的压力传感器进行测定。排出口与排出管114连接，完成分析后的血液可由此排出。此夕卜，在微芯片I的流路分隔部103的上方设置有连接了图像分析装置115的摄像机113，由此可观察到流路分隔部103中血小板活化的状态。试验例I、2和比较例I从健康正常人采集的血液经水蛭素(25 y g/mL)进行抗凝处理。该经抗凝处理的血液流经等离子体处理的微芯片(试验例I)、紫外线照射的微芯片(试验例2)和未处理的微芯片(比较例I)的流路。具体而言，储存器109中填充有经抗凝处理的血液，泵111中填充有矿物油，泵111与储存器109连接，储存器109的下端与微芯片I的流入口 106连接。以18 ii L/分钟的流速，从泵111将矿物油向储存器中注入，层叠在血液上，储存器内的血液 以同样的流速压出后注入微芯片1，通过未图示的压力传感器对矿物油的流入压力(即，血液的流入压力)分别进行了 3次测定。结果分别如图4A、4B和4C所示。相比于流路分隔部未经处理的微芯片(图4C)，经等离子体处理的微芯片(图4A)、紫外线处理的微芯片(图4B)可促使稳定的压力上升，此外压力曲线(pattern)的波动小。可推测流路分隔部经等离子体处理和紫外线照射处理可成为提高血小板凝集块粘附性的原因。试验例3
服用阿司匹林IOOmg前后进行样本采血，得到的血液经水蛭素(25 U g/mL)进行抗凝处理。该经抗凝处理的血液流过流路分隔部经等离子体处理的微芯片的流路。具体而言，储存器109中填充有经抗凝处理的血液(服用阿司匹林IOOmg前后)，泵111中填充有矿物油，泵111与储存器109连接，储存器109的下端与微芯片I的流入口 106连接。以27iiL/分钟和L/分钟的流速，从泵111将矿物油向储存器中注入，层叠在血液上，储存器内的血液以同样的流速压出后注入微芯片1，通过未图示的压力传感器测定矿物油的流入压力(即，血液的流入压力)。比较例2除了使用流路分隔部未经等离子体处理的微芯片以外，与试验例3进行同样的操作，测定矿物油的流入压力。试验例3和比较例2的结果分别如图5和图6所示。使用流路分隔部未经等离子体处理的微芯片的情况下，压力上升不充分，导致几乎不能判断阿司匹林的效果。与此相t匕，使用流路分隔部经等离子体处理的微芯片的情况下，可引起低流速下约50kPa的压力上升、高流速下约SOkPa的压力上升，可充分判断阿司匹林的效果。根据上述内容，通过等离子体辐射，可在进一步引起高的压力上升的高流速条件下进一步分析血小板凝集块的稳定性。发现具有抗血小板作用的阿司匹林可降低血小板凝集块的形成速度，而不是降低所形成的血小板凝集块的稳定性。工业实用性
通过本发明的微芯片，可使用微量血液检测血液的血小板功能,可应用于医疗、诊断、检测、研究等领域。
附图标记说明A :血小板检测装置;1、2 :微芯片;100、200 :第一基板;101、201 :流路；102、202 流路分隔壁；103、203 :流路分隔部;104、204 :柱状体;105、205 :防杂质流入部;106、206 流入口 ；107 :排出口 ；207 :废液储存部；108、208 :血小板易粘附面(胶原蛋白涂覆部)；109 储存器:209 :空气孔(排出口);110、210 :第二基板；111 :泵；112 :加热器；113 :摄像机；114:排出管；115:图像分析装置。
权利要求
1.一种微芯片，其特征在于，所述微芯片是通过血液在流路中流动以诱导血小板凝集而测定血小板功能的微芯片，所述微芯片具有设置在内部的流路，为了与血小板粘附，所述流路中至少局部涂覆有胶原蛋白，多个壁沿着所述流路中血液流动的方向延伸且将所述流路的宽度分隔形成流路分隔部，对所述壁施予表面粗糙度(Ra)变成IOlOOnm的处理。
2.如权利要求I所述的微芯片，其中，所述表面粗糙度(Ra)变成IOlOOnm的处理通过等离子体辐射或紫外线照射进行。
3.如权利要求I或2所述的微芯片，其特征在于，所述流路中，所述流路分隔部以外部分的表面粗糙度不到10nm。
4.如权利要求广3中任意一项所述的微芯片，其中，血液在所述流路中以一定速度流动使得形成血小板凝集块的同时测定血液的流入压力时，所述微芯片的耐压性为SOkPa以上。
5.如权利要求广4中任意一项所述的微芯片，其特征在于，所述流路分隔部的上游进一步设置有防杂质流入部。
6.一种包含权利要求广5中任意一项所述微芯片的血小板功能检测装置。
7.如权利要求6所述的血小板功能检测装置，其中，所述血小板功能检测装置进一步装配有 用于收容血液的容器； 用于将血液从所述容器输液至微芯片内的流路的输液泵；以及 测定施加于所述泵的压力的压力传感器。
8.如权利要求6或7所述的血小板功能检测装置，其中，所述血小板功能检测装置装配有废液储存部，所述废液储存部位于微芯片内部的胶原蛋白涂覆部的下游，用于储存经过所述胶原蛋白涂覆部的血液废液。
9.一种血小板功能检测方法，其特征在于，通过使血液经过权利要求I飞中任意一项所述的微芯片或权利要求61中任意一项所述的血小板功能检测装置的流路，在所述流路分隔部和所述胶原蛋白涂覆部中引起血小板凝集的同时，测定所述血液流向所述流路的流入压力，由此检测血小板的功能。
全文摘要
本发明的目的是提供一种微芯片，其特征在于，所述微芯片是通过血液在流路中流动以诱导血小板凝集而测定血小板功能的微芯片，所述微芯片具有设置在内部的流路，为了与血小板粘附，所述流路中至少局部涂覆有胶原蛋白，多个壁沿着所述流路中血液流动的方向延伸且将所述流路的宽度分隔形成流路分隔部，对所述壁施予表面粗糙度(Ra)变成10~200nm的处理。
文档编号G01N33/49GK102762991SQ201180008579
公开日2012年10月31日 申请日期2011年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者和田朋子, 寺田真纪, 深泽征司, 细川和也, 近藤太郎 申请人:藤森工业株式会社