拮抗性dr3配体的制作方法

拮抗性dr3配体的制作方法
【专利摘要】本公开内容涉及炎性疾病的治疗。具体地讲，本公开内容涉及可用于治疗炎性疾病的拮抗性DR3配体。
【专利说明】拮抗性DR3配体
[0001]背景
TLlA是由内皮细胞、树突细胞、单核细胞和其它免疫细胞产生的TNF超家族成员。TLlA通过DR3 (—种由活化T细胞和其它免疫细胞表达的TNF受体超家族成员)发出信号。通过TLlA的受体连接导致通过T辅助效应细胞的增殖和细胞因子产生增加。DR3和TLlA涉及RA和⑶，因此在治疗炎性疾病例如RA (类风湿性关节炎)和⑶(克罗恩病(CrohnsDisease))时会需要拮抗DR3诱导的作用。
[0002]W02011106707公开了 DR3特异性抗体(11H08)及其包含插入不同抗体构架的11H08 CDR序列(SEQ ID NO 14+15)的变体。11H08抗体以相对低的亲和力结合DR3，并且它不与CRDl结构域结合。因此，本领域需要可用于治疗炎性疾病的DR3拮抗剂。
[0003]概述
针对DR3产生的二价抗体具有激动作用。这些激动性DR3特异性抗体的几个具有阻断DR3与TLlA间的相互作用的能力。由于激动性抗体导致通过T辅助效应细胞的增殖和细胞因子产生增加，因此在有关炎性病症治疗时不期望使用二价DR3抗体。
[0004]本发明提供拮抗性DR3配体，其中所述配体对DR3具有单价特异性，且其中所述配体阻断TLlA与DR3结合。这类配体优选来源于二价激动性抗体，并且任选与半寿期延长部分(例如亲脂部分)缀合。这类配体优选具有高亲和力，和/或优选与DR3的CRDl结构域结合。本发明还涉及这类配体治疗炎性疾病的用途。本文表明本发明的DR3配体能够拮抗通过DR3诱导的作用。
[0005]附图简述
图1:本文提及的序列。
[0006]图2:通过FCM分析的CH0K1SV上的DR3表达。JD3是市售可获得的DR3抗体。
[0007]图3:用100 μΜ MSX培养的CH0K1SV上的稳定DR3表达。通过FCM分析的表达。
[0008]图4 =TNFRl和DR3胞外域的序列比对。每一行表示富含半胱氨酸的结构域(CRD)，该结构域可再被分成A和B亚结构域。突出显示了针对TNFRl测定的CRD中的保守二硫键模式。
[0009]图5:针对阻断人TLlA与过量表达DR3的CHO细胞结合的能力预筛选的各个小鼠血清。右边条形柱(黑色)是抗TLlA对照(ΜΑΒ7441 RnD Biosystems)。
[0010]图6:通过流式细胞术进行的阻断TL1A:DR3相互作用的抗体的实例。图6A显示与6种阳性DR3抗体的DR3细胞的特异性结合。图6B表示显示4种封闭性抗体和2种非封阻剂(non-blocker)的抑制研究。Y轴表示平均强度荧光。
[0011]图7:图7A 3种封闭性抗体和作为对照的非封闭DR3特异性ab的滴定曲线——用完全抗体和用Fab表不。
[0012]图8:在有或没有抗DR3 Fab或mAb时用IL12/IL18 +TLlA刺激的CD4+ T细胞。T细胞增殖在第5天测量。
[0013]发明详述
本发明的发明人认识到DR3抗原——其可溶形式及细胞表面表达的形式——的产生被证实是困难的，因为传统方法无一成功。人细胞系中DR3胞外域的重组表达通常导致含有大量寡聚体和高分子量复合物的可溶性蛋白质分泌(另见实施例3)。据推测这些寡聚化蛋白质批次对于免疫而已并不是最优的。与可溶性蛋白质表达最优化(如实施例3所述)的同时，小鼠用过量表达膜结合的DR3的细胞免疫。然而，过量表达DR3的稳定细胞系的产生并不简单。全长DR3中的死亡结构域在稳定转染的过量表达DR3的细胞系中导致细胞死亡，因此必须对全长DR3进行修饰(参见实施例2和5)。已在不同的小鼠品系(BALB/C、RBF和NMRCF1)中进行了免疫以提高抗体库多样性和产生中和性抗DR3 Ab的可能性。
[0014]鉴定出几百个DR3结合抗体；这些中仅少数~2%)能够阻断/抑制DR3:TL1A结合。因此推断具有阻断DR3: TLlA结合的能力的DR3抗体具有拮抗DR3诱导作用的能力。然而，结果的确是所有DR3抗体——不论它们是否具有阻断DR3:TL1A结合的能力——在TLlA存在和不存在时均是激动的(agonistic)，它们显然的确在某种程度上模拟TLlA结合诱导的对DR3的作用。
[0015]根据这些出人意料的观察结果，本发明人假设，对通过所有DR3抗体发挥的激动作用的解释可能是任何二价DR3抗体可导致DR3群聚，和DR3群聚可能具有诱导胞内DR3信号转导的潜力。这种设想还在有关TNFR家族成员Fas (⑶95)和TNFR2的最新出版物(Wang等(2010) Nature Struc.Mol.Biol.17，1324-1328 ;Mukai 等(2010) Sc1.Signal.3，ra83)中得到支持。Wang等人提供了结构数据和解析数据两者，表明了胞内信号转导复合物具有高级次，并含有至少5-7拷贝的受体。类似地，Mukai等人表明受体胞外部分的群聚由配体结合诱导。因此，两种出版物指出，这些TNFR家族成员的高级次群聚可能是信号转导的先决条件。
[0016]为了检验该假设，在功能测定法中测定了用木瓜蛋白酶裂解mAb所产生的Fab片段(单价DR3抗体)。来自这些测定法的出人意料的结果是，单价DR3抗体(根据具有阻断/抑制DR3:TL1A结合的能力的DR3抗体制备)在功能测定法中是拮抗性的，即它们具有抑制DR3诱导的作用的能力。因此单价DR3配体/抗体不促进DR3群聚，因此它们不具有激动作用。
[0017]不阻止TL1A:DR3相互作用的抗体被用作阴性对照。这种抗体类型在不存在TLlA时在极高浓度下是激动性的，但仅作为mAb。来自这些抗体的相应的Fab不能够阻止TLlA诱导的作用。
[0018]定义:
“炎症”是血管组织对有害刺激(例如病原体、受损细胞或刺激物)的复杂的生物反应。炎症是生物消除有害刺激以及启动组织愈合过程的保护性尝试。炎症不是感染的同义词——感染是由外源病原体引起的，而炎症是生物的免疫系统对病原体的反应。
[0019]通常，免疫系统能够区分机体正常细胞或“自身”和外来病原体或异常细胞或“异物”。免疫系统丧失识别“自身”为正常的能力并且针对组织或细胞的后续反应的过程，导致耐受性丧失(一种“自身免疫”的状态)。由自身免疫所致病理常常具有严重的临床后果，并且是全世界，尤其是发达国家的主要健康问题之一。
[0020]目前可获得生物治疗剂用于治疗某些自身免疫病和/或癌症。例如，类风湿性关节炎患者可用利妥昔单抗(抗⑶20)治疗,克罗恩病(Crohn’ s disease)患者可用英利昔单抗或那他珠单抗治疗。遗憾的是，接受这些生物制剂任一种的治疗的患者，还会遇到各种副作用和/或是无应答者和/或形成抑制剂。仍然需要特异性靶向病理组织和/或不影响健康组织和/或产生较不严重的副作用和/或产生较少副作用和/或可长期使用和/或不会导致抑制剂形成的备选生物药物。本发明涉及自身免疫病患者和慢性炎性疾病患者中的这些未被满足的需要。
[0021]本发明的配体因此适用于治疗炎性疾病和病况例如银屑病、I型糖尿病、格雷夫斯病(Grave’ s disease)、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃瘍性结肠炎、肠易激综合征、多发性硬化、类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性心肌炎、川崎病(Kawasaki disease)、冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺病、间质性肺疾病、自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、全身性硬皮病、银屑病性关节炎、骨关节炎、特应性皮炎、白斑、移植物抗宿主病、斯耶格伦综合征(Sj5ogrens’ s syndrome)、自身免疫性肾炎、古德帕斯彻综合征(Goodpasture’ssyndrome)、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、变态反应、哮喘和其它自身免疫病。
[0022]克罗恩病(CD/肉芽肿性/结肠炎)是肠的炎性疾病，可影响胃肠道从口到肛门的任何部位，引起各种症状。其主要引起腹痛、腹泻(其可有血)、呕吐或体重减轻，但还可引起胃肠道以外的并发症例如皮疹、关节炎、眼部炎症、疲劳和注意力缺乏。对于克罗恩病尚无已知的药物或手术疗法。治疗选择局限于控制症状、保持缓解和防止复发。
[0023]类风湿性关节炎(RA):RA是累及整个身体的全身性疾病，并且是最普通的关节炎形式之一。其特征在于内衬关节的膜的炎症，它引起疼痛、僵硬、发热、发红和肿胀。炎性细胞释放可消化骨和软骨的酶。由于类风湿性关节炎，发炎的关节内衬滑膜可侵入和损害骨和软骨，导致除其它生理作用以外的关节退化和严重疼痛。受累关节可能失去其形状和排列，导致疼痛和运动丧失。
[0024]有若干本领域已知的类风湿性关节炎动物模型。例如，在胶原诱发性关节炎(CIA)模型中，小鼠出现十分类似于人类风湿性关节炎的慢性炎性关节炎。由于CIA与RA共享类似的免疫学和病理学特征，因此这使之成为筛选潜在人抗炎化合物的理想模型。
[0025]“DR3 ”有时称为死亡受体 3、TRAMP、TNFRSF12、TNFR25、TNFRS25、AP0-3、DDR3、LARD、TR3、WSL-1或WSL-LR。人DR3是TNF受体(TNFR)超家族的成员，在胞外域包含4个富含半胱氨酸的基序，在胞质结构域包含“死亡结构域”。人DR3包含SEQ ID I中规定的氨基酸序列。DR3的胞外域(残基25-199)包含4个富含半胱氨酸的结构域(CRD1、CRD2、CRD3和CRD4)。各CRD通常含有形成3个二硫键的6个半胱氨酸残基。另外，每个CRD可再分为组件Al和B2，其通常在TNFR超家族的常见成员中观察到。
[0026]“阻断/抑制/减少DR3与TLlA结合”。本发明的单价配体/抗体具有抑制/阻断/减少DR3:TLlA结合的能力。其可在基于高通量成像的测定法中进行测定。这通过筛选结合DR3转染的CHO细胞的能力和针对野生型细胞的反筛选而在FMAT系统中进行(更多详情描述于实施例4)。如该测定法中测量的一样，如果DR3:TL1A结合降低至少10%、优选至少20%、优选至少25%、优选至少30%、优选至少40%、优选至少50%、优选至少60%、优选至少70%、优选至少75%、优选至少80%、优选至少90%、优选至少95%，最优选约100%，则本发明的单价配体/抗体具有阻断或抑制或减少DR3:TL1A结合的能力。
[0027]“延长基团(protractive group) ”/ “半寿期延长部分”在本文理解为这样的一个或多个化学基团，其与一个或多个氨基酸侧链官能团(例如-SH、-OH、-C00H、-CONH2, -NH2)或者一个或多个N-和/或O-聚糖结构连接并且当与多种治疗性蛋白质/肽缀合时，可延长这些蛋白质/肽的体内循环半寿期。延长基团/半寿期延长部分的实例包括但不限于:生物相容性脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)例如羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PolyEthylen Glycol,PEG)、聚(Glyx-Sery)n (HAP)、透明质酸(HA)、Heparosan 聚合物(HEP)、基于磷酰胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximer、葡聚糖、多聚唾液酸(PSA)、Fe结构域、运铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽、XTEN聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽及其任何组合。
[0028]本发明的“聚二乙醇化DR3配体变体”可具有与DR3配体多肽的任何部分(包括DR3配体多肽的任何氨基酸残基或糖部分)连接的一个或多个PEG分子。可采用化学和/或酶促方法使PEG或其它延长基团与本发明的单价DR3配体上的聚糖缀合。酶促缀合方法的实例描述于例如W003031464。聚糖可以是天然存在的，或可通过采用本领域众所周知的方法例如插入N联糖基化位点而被插入。本发明“半胱氨酸-聚二乙醇化DR3配体变体”具有与存在于DR3配体中的半胱氨酸的巯基缀合的一个或多个PEG分子。本发明的“半胱氨酸-酰化DR3配体变体”或“半胱氨酸-烷基化DR3配体变体”具有与引入DR3配体的半胱氨酸的巯基缀合的一个或多个疏水半寿期延长部分。此外，有可能使延长性半寿期延长部分与其它氨基酸残基连接 。
[0029]哺乳动物物种循环血中最丰富的蛋白质组分是血清白蛋白，通常以约3-4.5克/100毫升全血的浓度存在。血清白蛋白是约65，000道尔顿的血液蛋白质，在循环系统中具有若干重要功能。它起血液中存在的各种有机分子的转运蛋白的作用、起整个血液中各种代谢物(例如脂肪酸和胆红素)的主要转运蛋白的作用，并且由于其丰度而起循环血的渗透调节剂的作用。血清白蛋白具有一周以上的半寿期，延长蛋白质的血浆半寿期的一种方法是使蛋白质与结合血清白蛋白的部分缀合。可按/.Med.Chem., 43，1986，(2000)(其通过引用结合到本文中)所述来测定白蛋白结合性质。
[0030]疏水/亲脂半寿期延长部分:本发明的配体优选与性质上主要是亲脂/疏水的半寿期延长部分缀合。在一个优选的实施方案中，疏水半寿期延长部分能够与白蛋白形成非共价复合物(“白蛋白结合剂”)，因此促进衍生物随血流循环，还具有延长衍生物的作用时间的作用。因此，整体来看，优选的取代基或部分可称为白蛋白结合部分。
[0031 ] 与其与本发明的DR3配体的连接点相比，半寿期延长部分优选位于白蛋白结合部分的相对端或接近白蛋白结合部分的相对端。白蛋白结合部分的其它部分，即半寿期延长部分与肽连接点中间的部分，可称为接头部分、接头、间隔基等。然而，接头的存在是任选的，因此白蛋白结合部分可与半寿期延长部分相同。
[0032]在具体的实施方案中，白蛋白结合部分和/或半寿期延长部分是亲脂的，和/或在生理pH (7.4)下带负电荷。
[0033]白蛋白结合部分和/或半寿期延长部分可通过缀合化学法例如通过烷基化、酰化或酰胺形成与肽的氨基共价连接；或者例如通过酯化、烷基化与羟基共价连接；或通过肟化与其它基团共价连接。
[0034]在一个优选的实施方案中，白蛋白结合部分和/或半寿期延长部分的活性亲硫衍生物与抗DR3 Fab的半胱氨酸残基的巯基共价连接。这类亲硫基团包括但不限于马来酰亚胺、卤代-马来酰亚胺、卤化物(尤其α -卤代乙酰基)、丙烯酰-衍生物(例如丙烯酸酯和丙烯酰胺)、乙烯基砜、反应性二硫基(例如2-吡啶基)。因此，本发明的抗DR3 Fab’优选通过硫醚或二硫键与白蛋白结合部分连接。[0035]可设计本发明的单价抗体，例如Fab’片段，以含有来自构成完整抗体重链硫桥之一的部分的重链的天然存在半胱氨酸残基。该半胱氨酸残基称为C239 (Kabat编号)。半胱氨酸残基还可通过遗传工程插入，但是通过使用天然存在的半胱氨酸残基用于缀合目的，可能有相关安全优势。
[0036]在一个优选的实施方案中，在酰胺键形成(该过程称为酰化)的情况下，白蛋白结合部分和/或疏水半寿期延长部分的活性酯与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基共价连接。
[0037]按照本发明十分优选的实施方案，采用酶促方法(例如包括使用唾液酸转移酶的方法)，使白蛋白结合部分通过聚糖与配体连接。
[0038]对于本发明的目的，术语 “白蛋白结合部分”、“半寿期延长部分”和“接头”包括这些分子的未反应以及反应形式。不论是指一种形式还是另一种形式，从使用该术语的上下文来看都是清楚的。
[0039]术语“脂肪酸”是指具有4-28个碳原子的脂族一元羧酸，它优选是无支链的，和/或是偶数的，且它可以是饱和的或不饱和的。
[0040]术语“脂肪二酸”是指上述定义的但在ω位具有额外羧酸基的脂肪酸。因此，脂
肪二酸是二羧酸。
[0041 ] 命名法是本领域常用的，例如-COOH和HOOC-是指羧基；-C6H4_是指亚苯基；-C0_和-OC-是指擬基(O=C < ) ；C6H5-O-是指苯氧基；卤化物是指卤素-F、_Cl、-Br、_I和-At。
[0042]在一个优选的实施方案中，本发明的白蛋白结合部分包含通过接头和唾液酸残基或唾液酸衍生物与肽或蛋白质连接的脂肪酰基(-(CH2)n-CO-,其中η= 1,2,3,...40)或ω-羧基脂肪酰基(HO2C-(CH2)n-CO-,其中 η= 1,2,3,...40)。
[0043]在一个优选的实施方案中，本发明的白蛋白结合部分包含通过接头和半胱氨酸残基与肽或蛋白质连接的脂肪酰基(_(CH2)n-C0-，其中η= 1,2,3,...40)或ω-羧基脂肪酰基(H02C-(CH2)n-C0-，其中η= 1,2,3,...40)。在一个特别优选的实施方案中，η为16或18。
[0044]在另一个优选的实施方案中，本发明的白蛋白结合部分包含通过接头和半胱氨酸残基与肽或蛋白质连接的R-(CH2)n-C0-类型的脂肪酰基，其中η= 1，2，3，...40。R是包含酸性基团的基团，例如四唑-5-基或-0-C6H4-C00H。在一个特别优选的实施方案中，η为14或15。
[0045]在本发明的情况下，具有-(CH2) 12-部分的化合物是可能的白蛋白结合剂。如果这类化合物与蛋白质或肽连接，并导致所述蛋白质或肽的血浆半寿期延长，则要了解白蛋白结合剂可促使血浆半寿期的总体延长。
[0046]在一个优选的实施方案中，接头部分如果存在，则具有2-80个C原子，优选5-70个C原子。在其它优选的实施方案中，接头部分如果存在，则具有4-20个杂原子，优选2-40个杂原子，更优选3-30个杂原子。杂原子特别优选的实例为N和O原子。H原子不是杂原子。
[0047]在另一个实施方案中，接头包含至少一个OEG分子，和/或至少一个谷氨酸残基，更确切地说相应基团(0EG称为8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，即该基团:-NH-(CH2)2-0-(CH2)2-0-CH2-C0-)。
[0048]在一个优选的实施方案中，接头部分包含二羧酰胺部分，接头通过硫醚键与半胱氨酸残基连接。在优选的实例中，二羧酰胺部分含有2-30个C原子，优选4-20个C原子，更优选4-10个C原子。
[0049]在一个优选的实施方案中，接头部分包含通过酰胺键与唾液酸残基连接的二羧酰胺部分。在优选的实例中，二羧基残基具有2-30个C原子，优选4-20个C原子，更优选4-10个C原子。在其它优选的实例中，二羧基残基具有0-10个杂原子，优选0-5个杂原子。
[0050]在另一个优选的实例中，接头部分/间隔基包含含有氨基和通过其远端羧基经由酰胺键与唾液酸残基连接的远端羧基两者的基团。在一个优选的实施方案中，该基团是OEG基团。本文所用术语“亲水间隔基”意指这样的间隔基，其将本发明的单价DR3抗体/配体与白蛋白结合残基用包含至少5个非氢原子(其中30-50%既非N也非O)的化学部分分隔开。优选白蛋白结合残基通过亲水间隔基与Cys残基连接。[0051]氨基酸谷氨酸(Glu)包含2个羧酸基。其Y-羧基优选用于与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基，或与OEG分子的氨基(如存在的话)，或与另一 Glu残基的氨基(如存在的话)形成酰胺键。Glu的氨基进而与半寿期延长部分的羧基，或与OEG分子的羧基(如存在的话)，或与另一 Glu的Y -羧基(如存在的话)形成酰胺键。加入Glu的这种方法偶尔简称为“ Y -Glu”。
[0052]具有突变的Fe结构域的“Fe融合衍生物”或“Fe融合蛋白”或DR3抗体在本文意指包括与可来源于任何抗体同种型的Fe结构域融合的本发明的DR3配体，但是IgG Fe结构域通常将是优选的，因为IgG抗体的循环半寿期相对较长，优选IgGl和IgG4同种型。此外可对Fe结构域进行修饰以调节某些效应子功能，例如补体结合和/或与某些Fe受体的结合。此外可调节Fe结构域以提高对新生儿Fe受体的亲和力。本发明的DR3配体与具有结合FcRn受体的能力的Fe结构域融合，一般将导致融合蛋白的循环半寿期延长。IgGl Fe结构域第234、235和237位上的突变一般可导致与Fe Y RI受体的结合减弱，与Fe Y RIIa和Fe Y RIII受体的结合也可能减弱。这些突变不改变与FcRn受体的结合，FcRn受体通过胞吞再循环途径促进长的循环半寿期。优选本发明融合蛋白的修饰IgGl Fe结构域包含一个或多个下列突变，其分别可导致对某些Fe受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)，和导致Clq介导的补体结合减弱(A330S和P331S)。或者，Fe结构域可以是任选包含S241P/S228P突变的IgG4 Fe结构域。
[0053]本文所用术语“抗体”、“单克隆抗体”和“mAb”欲指免疫球蛋白分子及其具有与抗原特异性结合的能力的片段。全长抗体包含4条多肽链，即通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文简称为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文简称为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区还可再分成超变区，称为互补决定区(CDR)，其散布在更保守的称为构架区(FR)的区域内。每个VH和VL由3个⑶R和4个FR组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列:FRUDRl、FR2、raR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可呈不同同种型的形式；例如IgG (例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4)、IgGAU IgA2、IgD和IgE。全长抗体通常是二价的(b1-valent/d1-valent),即它具有以两个“臂”与抗原结合的能力。相比之下，本发明的单价抗体只包含一个对抗原/DR3有特异性的结合部位。[0054]“Fab区”/ “Fab结构域”/ “Fab片段”/ “Fab”含有界定抗体可结合的特定靶的可变部分。Fab片段是本发明的单特异性/单价DR3配体/DR3抗体的实例。
[0055]本发明的单价DR3配体/抗体的实例包括:Fab片段，由VL、VH、CL和CH I结构域组成的单价片段；二价片段，其包含例如通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段，其中这些Fab片段中仅一个对DR3有特异性；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的 VL和 VH 结构域组成的 Fv 片段，(V) dAb 片段(Ward 等(1989) Nature 341:544-546),其由VH结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR);和(V)对DR3是单价的双特异性抗体。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但可采用重组方法通过使之能够作为单一蛋白质链制备的合成接头将它们连接，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链 Fv (scFv);参见例如 Bird 等(1988) Science 242:423-426 ;以及 Huston 等(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883)。单链抗体的其它形式(例如双抗体)也包括在术语“单价DR3配体/抗体”内。
[0056]“双抗体”是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用太短以致于不允许同一链上的两个结构域间配对的接头，从而迫使结构域与另一链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合部位(参见例如Hol-1iger, P.等(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R.J.等(1994) Structure 2:1121-1123)。
[0057]本文所用术语“人抗体”意指具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的本发明的单价DR3抗体。本发明的人抗体可例如在CDR中，特别在CDR3中包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点专一诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
[0058]然而，本文所用术语“人抗体”无意包括这样的抗体，其中来源于另一种哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列被移植到人构架序列中，例如所谓的“人源化抗体”或人/小鼠嵌合抗体。人源化单价DR3抗体也是本发明的组成部分。
[0059]术语“嵌合单价抗体”是指本发明的单价DR3抗体，其轻链和重链基因通常通过遗传工程从属于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建。例如，可将来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段与人恒定区段连接。
[0060]本文所用术语“表位”意指单价抗体与之结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由分子(例如氨基酸或糖部分)的化学活性表面群聚组成，常常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。用于表征表位的方法的实例包括HX-MS、NMR, X射线、肽步查(peptide walking)、测定法等。术语“抗原互补位”是指识别抗原的抗体的部分。
[0061]可根据它们识别或特异性结合的DR3的一个或多个表位或部分，来描述或指定本发明的单价DR3抗体。例如可通过N端和C端位置，或通过连续氨基酸残基的大小来指定一个或多个表位或多肽部分。还可根据其交叉反应性来描述或指定本发明的单价DR3抗体。本文包括不结合多肽的任何其它类似物、直向同源物(ortholog)或同源物的抗体。
[0062]“表位框并法Gpitope binning) ”/”竞争结合测定法”是指利用竞争结合测定法鉴定能够或不能够同时结合DR3的配体/抗体对，从而鉴定结合DR3蛋白上的相同表位或重叠表位(参见实施例10)，或因位阻所致不能同时结合的本发明的配体/抗体。框并法(Binning)实验提供存在抗原上完全不同的表位的证据。然而，靠它们自身，它们无法鉴定表位或对表位“作图”至DR3蛋白的特定氨基酸序列或位置。可针对任何配体/抗体或片段对，对结合的竞争进行评价。通常，配体/抗体家族(或框(bin))的有利性质可与由抗体框/竞争基团界定的特定表位的结合相关联。
[0063]本文所用术语“免疫反应”或“免疫反应性”意指解离常数Kd低于10_4 M的配体/抗体与其表位的任何结合。适当时，术语“免疫反应”或“免疫反应性”与术语“特异性结合”互换使用。
[0064]本文所用术语“亲和力”意指本发明的配体/抗体与表位结合的强度。抗体/配体的亲和力用解离常数Kd测量，解离常数定义为[Ab] X [Ag] / [Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合抗体的摩尔浓度，[Ag]是未结合抗原的摩尔浓度。亲和常数Ka用Ι/Kd定义。通过竞争抑制确定抗体特异性和亲和力的优选方法可^jAL Harlow Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988) ；Colligan 等主编，Current Protocolsin Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N.Y., (1992,1993);以及 Muller, Meth.Enzymo1.92:589-601 (1983)。
[0065]可按本文所述，测量“降低RA患者滑液细胞中的IFN-Y释放”。要了解，在约0.1、0.5、1或5 μg单价抗体/ml的浓度下，采用本文描述的测定条件，RA患者滑液T细胞中的IFN- Y释放降低达至少15%、更优选达至少20%、更优选达至少25%、更优选达至少30%、更优选达至少35%、更优选达至少40%、更优选达至少45%、更优选达至少50%、最优选达至少60%、更优选达至少70%、更优选达至少75%、更优选达至少80%，最优选达至少95%。在反应性患者材料中，本发明的抗体降低RA以及CD患者材料中的干扰素释放(例如IFN- Y )。
[0066]可按本文所述，测量“降低来自CD患者肠活检样品的固有层单核细胞(LPMC)中一种或多种细胞因子的释放”。要了解，在约0.1、0.5、1或5 Pg单价抗体/ml的浓度下，采用本文描述的测定条件，CD患者LPMC中的细胞因子释放降低达至少15%、更优选达至少20%、更优选达至少25%、更优选达至少30%、更优选达至少35%、更优选达至少40%、更优选达至少45%、更优选达至少50%、最优选达至少60%、更优选达至少70%、更优选达至少75%、更优选达至少80%、最优选达至少95%。在反应性患者材料中，本发明的抗体降低RA以及⑶患者材料中的干扰素释放(例如IFN- Y )。
[0067]可按本文所述，测量“降低⑶4+ T细胞中一种或多种细胞因子的释放”。要了解，在约0.1、0.16、0.5、1或5 Pg单价抗体/ml的浓度下，采用本文描述的测定条件，⑶4+ T细胞中的细胞因子释放降低达至少15%、更优选达至少20%、更优选达至少25%、更优选达至少30%、更优选达至少35%、更优选达至少40%、更优选达至少45%、更优选达至少50%、最优选达至少60%、更优选达至少70%、更优选达至少75%、更优选达至少80%、最优选达至少95%。
[0068]包含本发明的DR3配体的“药物组合物”可以药盒提供，药盒装有包括本发明的配体的容器。治疗性多肽可以用于单剂量或多剂量的注射溶液的形式提供，或作为可在注射前复溶的无菌粉针剂提供。包含本发明配体的药物组合物适于皮下和/或IV给药。本发明的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体。
[0069]本文所用术语“治疗”是指有需要的任何人或其它动物受试者的药物疗法。预期医学或兽医学从业人员已对所述受试者进行了身体检查，所述从业人员给出了表明采用所述具体治疗有益于所述人或其它动物受试者的健康的试验性或决定性诊断。根据受试者的健康现状，所述治疗的时机和目的可在一个个体与另一个间变化。因此，所述治疗可以是预防性的、治标性的、针对症状的和/或治疗性的。
[0070]就本发明而言，预防性、治标性、针对症状的和/或治疗性治疗可代表本发明的各个方面。
[0071]本发明的配体可连同其它药物(例如甲氨蝶呤、地塞米松和泼尼松)和/或其它生物药物一起给予。
[0072]单价DR3抗体/配体可用重组技术产生。通常将编码本发明的单价DR3抗体/配体的DNA序列插入重组载体。载体优选为表达载体,其中DNA序列与DNA转录所需要的额外区段以及能够指导克隆基因或cDNA在所需宿主细胞中转录的启动子有效连接。
[0073]在细胞摄取DNA后，使它们在合适的生长培养基中生长，通常为1-2天，以开始表达目标基因。向其中导入编码单价DR3抗体/配体的DNA序列的宿主细胞可以是任何细胞，包括酵母、真菌、细菌和高级真核细胞。用于本发明的哺乳动物细胞系的实例为C0S-1、幼仓鼠肾(BHK)和293。优选的BHK细胞系为tk-tsl3 BHK细胞系，其可称为BHK 570细胞。另外，本发明内可使用多种其它细胞系，包括大鼠H印1、大鼠H印II> TCMK, NCTC 1469、CHO和DUKX细胞。
[0074]然后在允许单价DR3抗体/配体表达的条件下，将上述转化或转染的宿主细胞在合适的营养培养基中培养，之后可从培养物中回收所得肽的全部或部分。然后可通过常规方法(包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞；通过盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或滤液的蛋白质性组分；根据所述多肽的类型，通过多种层析法(例如离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法等)纯化)，从培养基中回收由细胞产生的单价DR3抗体/配体。
[0075]可采用转基因动物技术以产生本发明的单价DR3抗体/配体。优选在宿主雌性哺乳动物(优选绵羊、山羊或牛)乳腺内产生蛋白质。也可采用在转基因植物中的产生。表达可定向于特定器官，例如结节。
[0076]还可在上述产生的二价抗体的基础上获得单价DR3抗体，随后进行肽酶消化和所得Fab片段的分离。
[0077]随后可对单价DR3抗体/配体进行翻译后修饰以获得体内循环半寿期延长的蛋白质。
[0078]实施方案列表:
以下是本发明实施方案的列表。该实施方案列表并非限制性的，要了解本发明包括下列实施方案的任何组合。
[0079]实施方案1:一种单价拮抗性DR3抗体，其中所述单价抗体阻断DR3与TLlA结合，其中呈其二价形式的所述单价抗体是阻断DR3与TLlA结合的激动性抗体。
[0080]实施方案2:实施方案I的单价抗体，其中所述单价抗体不是具有W02011106707所示11H08抗体的⑶R序列(SEQ ID NO 14-15)的抗体。
[0081]实施方案3:实施方案1-2中任一个的单价抗体,其中所述单价抗体与亲脂部分缀合。[0082]实施方案4:实施方案3的单价抗体，其中所述亲脂部分包含-(CH2)n-CO-脂肪酰基，其中η为16-18。
[0083]实施方案5:实施方案3的单价抗体，其中所述亲脂部分包含-(CH2)n-CO-脂肪酰基，其中η为15。
[0084]实施方案6:实施方案3-5中任一个的单价抗体，其中所述抗体与选自以下式(I)、
(II)> (III) > (IV)、(V)和(VI)的亲脂部分缀合:
【权利要求】
1.一种单价拮抗性DR3抗体，其中所述单价抗体阻断DR3与TLlA结合，且其中呈其二价形式的所述单价抗体是阻断DR3与TLlA结合的激动性抗体。
2.权利要求1的单价抗体，其中所述单价抗体不是具有W02011106707所示11H08抗体的CDR序列(SEQ ID NO 14+15)的抗体。
3.前述权利要求中任一项的单价抗体，其中所述单价抗体与亲脂部分缀合。
4.权利要求3的单价抗体，其中所述亲脂部分包含-(CH2)n-CO-脂肪酰基，其中η为16-18。
5.权利要求3的单价抗体，其中所述亲脂部分包含-(CH2)n-CO-脂肪酰基，其中η为15。
6.权利要求3-5中任一项的单价抗体，其中所述抗体与选自以下式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的亲脂部分缀合:
7.权利要求3-6中任一项的单价抗体，其中所述亲脂部分通过亲水间隔基与抗体重链中的天然存在的C239 (Kabat编号)半胱氨酸残基连接。
8.前述权利要求中任一项的单价抗体，其中所述抗体与DR3上的表位结合，其中所述表位包含SEQ ID NO I的143和/或L45。
9.前述权利要求中任一项的单价抗体，其中所述抗体与DR3上的表位结合，其中所述表位包含SEQ ID NO I所示氨基酸G37-L45的至少一个和氨基酸L57-A59的至少一个。
10.权利要求9的单价抗体，其中所述表位包含SEQID NO I所示的氨基酸G37-L45和氨基酸L57-A59。
11.前述权利要求中任一项的单价抗体，其中所述配体是Fab片段。
12.前述权利要求中任一项的单价抗体，其中所述单价抗体以低于InM的解离常数结合 DR3。
13.前述权利要求中任一项的单价抗体，其中所述抗体与人DR3的CRDl结构域结合。
14.一种单价抗体，其包含SEQ ID NO 10所示的3个⑶R序列和SEQ ID NO 11所示的3个⑶R序列。
15.一种单价抗体，其中所述抗体包含人构架、SEQ ID NO 16所示⑶R3序列和SEQ IDNO 17所示CDR3序列以及重链的“S49A”回复突变。
16.权利要求15的单价抗体，其中所述抗体包含SEQID NO 16所示的3个⑶R序列和SEQ ID NO 17所示的3个⑶R序列。
17.前述权利要求中任一项的单价抗体，其中所述抗体与“0228”单价抗体竞争结合人DR3，其中0228重链的氨基酸序列如SEQ ID NO 16所示，0228轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO 17所示。
18.前述权利要求中任一项的单价抗体，其中所述抗体降低RA患者滑液细胞中的IFN- Y释放，其中所述滑液细胞用TLlA共刺激。
19.前述权利要求中任一项的单价抗体，其中所述抗体降低CD患者肠活检样品固有层单核细胞(LPMC)的一种或多种细胞因子的释放，其中所述细胞因子选自:TNF-a、IL-6、GM-CSF和IFN- Y，且其中所述LPMC用TL1A、IL-12和IL-18共刺激。
20.前述权利要求中任一项的单价抗体，其中所述抗体降低CD4+T细胞中一种或多种细胞因子的释放，其中所述细胞因子选自:TNF-a、11^-6、61^5?和正^￥，且其中所述1'细胞用TLlA共刺激。
21.前述权利要求中任一项的单价抗体，其中所述抗体是IgG4型抗体。
22.一种药物组合物`，其包含权利要求1-21中任一项的抗体。
23.用于治疗炎性疾病的权利要求1-21中任一项的单价抗体或权利要求22的药物组合物的用途。
24.用于治疗克罗恩病(CD)的权利要求1-21中任一项的单价抗体或权利要求22的药物组合物的用途。
25.用于治疗类风湿性关节炎(RA)的权利要求1-21中任一项的单价抗体或权利要求22的药物组合物的用途。
【文档编号】C07K14/705GK103517918SQ201280011136
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年3月1日 优先权日:2011年3月1日
【发明者】M.D.安德森, P.L.诺尔德拜, K.克贾尔加尔德, S.N.格雷尔, A.格鲁勒, J.布查尔特, H.S.安德森, S.帕德贾尔, J.卡斯特鲁普, K.哈亚坎斯森, L.霍努姆, B.弗里伊德里奇森, D.鲍恩斯加尔德 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司