意图。
[0020]图6为CSFl活化后间充质干细胞的成软骨能力示意图。
[0021 ]图7为CSFl活化后造血干细胞对肿瘤模型小鼠成活率影响的示意图。
【具体实施方式】
[0022]本发明提供一种基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0023]本发明提供一种基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其中，采用集落刺激因子I对干细胞动员、增殖与活化。通常情况下，处于静息状态下的干细胞，其迀移、归巢、增殖以及分化成其他功能细胞的速度一般比较缓慢。比如，造血干细胞在正常生理条件下主要存在于骨髓，而外周血中含量甚微，在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或应急条件下，大量造血干细胞被动员，从而释放到外周血中，并启动了造血干细胞向红细胞、免疫细胞以及血小板的分化过程。本发明采用集落刺激因子I(CSFl)能够有效刺激体内干细胞的动员、增殖与活化过程。另外，本发明采用CSFl与G-CSF联合处理小鼠模型，可有效增强造血干细胞动员效率。
[0024]本发明采用CSFl作为添加物，在体外培养能促进间充质干细胞的增殖，但又不影响这类干细胞的分化潜能，这类干细胞包括脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞。
[0025]本发明采用CSFl作为活化剂，作用于哺乳生物或其相应的干细胞，包括但不局限人或小鼠来源的体内干细胞动员或体外干细胞的增殖。
[0026]优选地，所述干细胞为造血干细胞，CSFI对造血干细胞动员的步骤包括:收集小鼠，将CSFl及G-CSF联合皮下注射，三天之后，尾静脉采血于添加有肝素抗凝剂的抗凝管中，采用偶联有FITC的CD34抗体示踪动员之后外周血中造血干细胞的数量，流式细胞仪分选检测CD34阳性细胞数量。
[0027]优选地，CSFl对造血干细胞增殖的步骤包括:经⑶34分选获得的造血干细胞采用造血干细胞无血清培养基培养，造血干细胞接种培养袋后培养，每过数小时温和摇动培养袋，整个培养过程培养基一直额外添加有CSFl;然后显微镜下目测造血干细胞密度，并用MTT法测定造血干细胞总密度。
[0028]优选地，所述干细胞为间充质干细胞，CSFl对间充质干细胞增殖的步骤包括:选用脂肪、骨髓间以及脐带三种组织器官来源的间充质干细胞做体外细胞培养，间充质干细胞接种密度控制在10-20%之间，接种前培养皿用细胞贴壁材料室温处理1-2小时或3-4°C保温过夜，接种后加入培养基培养;然后每隔10-12小时通过MTT法测一次间充质干细胞密度。
[0029]优选地，CSFl活化后间充质干细胞分化成脂肪细胞的步骤包括:CSF1活化后培养获得的间充质干细胞，然后采用如下步骤进行检测:I)首先配制分化培养基A和B，其中分化培养基A组分包括:基础培养基，胎牛血清，青霉素链霉素，谷氨酰胺，胰岛素，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，罗格列酮，地塞米松及吲哚美辛；分化培养基B组分包括:基础培养基，胎牛血清，青霉素链霉素，谷氨酰胺以及胰岛素，配制完毕之后混合均匀，放冰箱避光保存备用;2)在六孔板中接种细胞/孔，继续培养细胞;3)待细胞长到100%汇合度后，吸去旧的培养基，每孔加入分化培养基A; 4)三天后吸去分化培养基A，每孔加入分化培养基B; 5)24小时后，吸去分化培养基B，每孔加入分化培养基A; 6)轮换加入分化培养基A和B，重复d-e步骤4-5次;7)最后加入分化培养基B培养7天;8)诱导结束之后，吸去培养基，向每孔中加入的多聚甲醛固定30-35分钟;9)用PBS洗2-3遍；10)向每孔中加入油红O染色液，染色30-35分钟；11)用PBS洗2-3遍，然后置于倒置显微镜下观察拍照，统计脂肪细胞所占比率。
[0030]优选地，CSFl活化后间充质干细胞分化成骨细胞的步骤包括:CSFl活化后培养获得的间充质干细胞，然后采用如下步骤进行检测:I)首先配制分化培养基，包括基础培养基，胎牛血清，青霉素链霉素，谷氨酰胺，维生素C，i3_甘油磷酸以及地塞米松，混合均匀，放冰箱避光保存备用;2)将六孔板用明胶预处理，接种细胞前用明胶处理，或者加入明胶之后把六孔板封上，放冰箱备用;3)六孔板在使用前吸去多余明胶液体，然后在明胶预处理的六孔板中接种适量细胞;接着在培养箱中培养;5)培养完成后吸去培养基，换上成骨诱导分化培养基;6)每3天换一次成骨诱导分化培养基，诱导2-3周;7)诱导结束之后，吸去培养基，向每孔中加入多聚甲醛固定30-35分钟;8)用PBS洗2-3遍;9)向每孔中加入茜素红S染色液，染色5-10分钟;9)用PBS洗2-3遍，然后置于倒置显微镜下观察拍照，统计骨细胞所占比率。
[0031]优选地，CSFl活化后间充质干细胞分化成软骨细胞的步骤包括:CSF1活化后培养获得的间充质干细胞，然后采用如下步骤进行检测:I)首先配制分化培养基，包括基础培养基，地塞米松，抗坏血酸，胰岛素-转铁蛋白-砸添加物，丙酮酸钠，脯氨酸以及TGF-阳，混合均匀，放冰箱避光保存备用;2)将六孔板用明胶预处理;3)六孔板在使用前吸去多余明胶液体，然后在明胶预处理的六孔板中接种适量细胞;4)加入成软骨分化培养基，2-3天换一次液;5)细胞分化3-4周后，吸去培养基，用多聚甲醛固定30-35分钟;6)用I3BS洗2-3遍;7)向每孔中加入阿利新蓝染色液，染色30-35分钟；8)用PBS洗3-4遍，然后置于倒置显微镜下观察拍照，统计软骨细胞的比率。
[0032]优选地，CSFl活化后造血干细胞对肿瘤模型小鼠存活率的影响的测试包括步骤:将急性B淋巴细胞系白血病细胞株用含青霉素、链霉素、灭活新生牛血清组成RPM1-1640的完全培养液，在含CO2的培养箱中培养细胞；用无菌PBS液将环磷酰胺浓度调整到10-12mg/mL，对小鼠的腹腔注射所述环磷酰胺，连续注射2天；24h后，收集处于对数生长期的Nalm-6细胞并进行离心，悬浮于无菌PBS液中，调整Nalm-6细胞密度至2.5 X 17个/mL，对小鼠进行尾静脉注射，制备白血病动物模型，并进行放疗处理；放疗处理之后辅助以造血干细胞治疗，4-5个月之后统计小鼠的存活率。
[0033]下面通过具体实施例对本发明进行详细描述。
[0034]实施例1、
CSFl对造血干细胞的动员作用收集5个月龄的小鼠，每克体重按I微克CSFl及I微克G-CSF联合皮下注射，阳性对照每克体重按I微克G-CSF联合皮下注射，阴性对照注射等体积的生理盐水。三天之后，尾静脉采血于添加有肝素抗凝剂的抗凝管中，采用偶联有FITC的CD34抗体示踪动员之后外周血中造血干细胞的数量，流式细胞仪分选检测CD34阳性细胞数量。具体操作如下:I)用PBS将细胞洗3遍;2)按照抗体使用说明书用PBS稀释抗体，注意避光；3)将稀释好的抗体加入到细胞中，轻轻吹打均匀成单细胞悬液，冰上避光孵育30分钟;4)孵育完成后，以1200转/分钟低温离心10分钟；5)去掉上清，用I3BS洗3遍;6)将细胞用I3BS重悬，注意避光;7)重悬的细胞用带滤网的流