将环磷酰胺浓度调整到10mg/mL，对小鼠的腹腔注射所述环磷酰胺(2mg/只)，连续注射2d(d指天数)；24h后，收集处于对数生长期的Nalm-6细胞并进行1000r/min离心5min后，悬浮于无菌I3BS液中，调整Nalm-6细胞密度至2.5X 17个/mL，对小鼠进行尾静脉注射(5 X 16个/只)，制备白血病动物模型，并进行放疗处理。放疗处理之后辅助以造血干细胞治疗，即注射按以上方法扩增的造血干细胞2.5 X 15个/只。4个月之后统计动物的存活率，结果表明造血干细胞治疗前动物存活率由原来的18%提高到79%，数据为1次独立实验的平均SEM( P〈0.01)(如图7所示)。
[0041]综上所述，本发明提供的一种基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，本发明利用CSFl对干细胞动员、增殖以及激活，CSFl不仅可以促进干细胞的体外增殖，还可促进体内干细胞的动员、增殖与活化，有望在细胞培养、疾病治疗以及抗衰老保健中发挥重要作用。
[0042]应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其特征在于，采用集落刺激因子I对干细胞动员、增殖与活化。2.根据权利要求1所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其特征在于，所述干细胞为造血干细胞，CSFI对造血干细胞动员的步骤包括:收集小鼠，将CSFI及G-CSF联合皮下注射，三天之后，尾静脉采血于添加有肝素抗凝剂的抗凝管中，采用偶联有FITC的CD34抗体示踪动员之后外周血中造血干细胞的数量，流式细胞仪分选检测CD34阳性细胞数量。3.根据权利要求2所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其特征在于，CSFl对造血干细胞增殖的步骤包括:经⑶34分选获得的造血干细胞采用造血干细胞无血清培养基培养，造血干细胞接种培养袋后培养，每过数小时温和摇动培养袋，整个培养过程培养基一直额外添加有CSFl;然后显微镜下目测造血干细胞密度，并用MTT法测定造血干细胞总密度。4.根据权利要求1所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞，CSFl对间充质干细胞增殖的步骤包括:选用脂肪、骨髓间以及脐带三种组织器官来源的间充质干细胞做体外细胞培养，间充质干细胞接种密度控制在10-20%之间，接种前培养皿用细胞贴壁材料室温处理1-2小时或3-4°C保温过夜，接种后加入培养基培养;然后每隔10-12小时通过MTT法测一次间充质干细胞密度。5.根据权利要求4所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其特征在于，CSFl活化后间充质干细胞分化成脂肪细胞的步骤包括= CSFl活化后培养获得的间充质干细胞，然后采用如下步骤进行检测:I)首先配制分化培养基A和B，其中分化培养基A组分包括:基础培养基，胎牛血清，青霉素链霉素，谷氨酰胺，胰岛素，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，罗格列酮，地塞米松及吲哚美辛;分化培养基B组分包括:基础培养基，胎牛血清，青霉素链霉素，谷氨酰胺以及胰岛素，配制完毕之后混合均匀，放冰箱避光保存备用；2)在六孔板中接种细胞/孔，继续培养细胞;3)待细胞长到100%汇合度后，吸去旧的培养基，每孔加入分化培养基A; 4)三天后吸去分化培养基A，每孔加入分化培养基B; 5) 24小时后，吸去分化培养基B，每孔加入分化培养基A; 6)轮换加入分化培养基A和B，重复d_e步骤4-5次;7)最后加入分化培养基B培养7天;8)诱导结束之后，吸去培养基，向每孔中加入的多聚甲醛固定30-35分钟;9)用PBS洗2-3遍；10)向每孔中加入油红O染色液，染色30-35分钟；11)用I3BS洗2_3遍，然后置于倒置显微镜下观察拍照，统计脂肪细胞所占比率。6.根据权利要求4所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其特征在于，CSFl活化后间充质干细胞分化成骨细胞的步骤包括:CSFl活化后培养获得的间充质干细胞，然后采用如下步骤进行检测:I)首先配制分化培养基，包括基础培养基，胎牛血清，青霉素链霉素，谷氨酰胺，维生素C，i3_甘油磷酸以及地塞米松，混合均匀，放冰箱避光保存备用;2)将六孔板用明胶预处理，接种细胞前用明胶处理，或者加入明胶之后把六孔板封上，放冰箱备用;3)六孔板在使用前吸去多余明胶液体，然后在明胶预处理的六孔板中接种适量细胞;接着在培养箱中培养;4)培养完成后吸去培养基，换上成骨诱导分化培养基;5)每3天换一次成骨诱导分化培养基，诱导2-3周;6)诱导结束之后，吸去培养基，向每孔中加入多聚甲醛固定30-35分钟；7)用PBS洗2-3遍;8)向每孔中加入茜素红S染色液，染色5_10分钟;9)用I3BS洗2-3遍，然后置于倒置显微镜下观察拍照，统计骨细胞所占比率。7.根据权利要求4所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其特征在于，CSFl活化后间充质干细胞分化成软骨细胞的步骤包括:CSF1活化后培养获得的间充质干细胞，然后采用如下步骤进行检测:I)首先配制分化培养基，包括基础培养基，地塞米松，抗坏血酸，胰岛素-转铁蛋白-砸添加物，丙酮酸钠，脯氨酸以及TGF-03，混合均匀，放冰箱避光保存备用;2)将六孔板用明胶预处理;3)六孔板在使用前吸去多余明胶液体，然后在明胶预处理的六孔板中接种适量细胞;4)加入成软骨分化培养基，2-3天换一次液;5)细胞分化3-4周后，吸去培养基，用多聚甲醛固定30-35分钟;6)用PBS洗2-3遍;7)向每孔中加入阿利新蓝染色液，染色30-35分钟;8)用PBS洗3-4遍，然后置于倒置显微镜下观察拍照，统计软骨细胞的比率。8.根据权利要求2所述的基于集落刺激因子I对干细胞的活化方法，其特征在于，CSFl活化后造血干细胞对肿瘤模型小鼠存活率的影响的测试包括步骤:将急性B淋巴细胞系白血病细胞株用含青霉素、链霉素、灭活新生牛血清组成RPM1-1640的完全培养液，在含CO2的培养箱中培养细胞;用无菌PBS液将环磷酰胺浓度调整到10-12mg/mL，对小鼠的腹腔注射所述环磷酰胺，连续注射2天;24h后，收集处于对数生长期的Nalm-6细胞并进行离心，悬浮于无菌PBS液中，调整Nalm-6细胞密度至2.5 X 1MVmL，对小鼠进行尾静脉注射，制备白血病动物模型，并进行放疗处理;放疗处理之后辅助以造血干细胞治疗，4-5个月之后统计小鼠的存活率。
【专利摘要】本发明公开一种基于集落刺激因子1对干细胞的活化方法，本发明利用CSF1对干细胞动员、增殖以及激活，CSF1不仅可以促进干细胞的体外增殖，还可促进体内干细胞的动员、增殖与活化，有望在细胞培养、疾病治疗以及抗衰老保健中发挥重要作用。
【IPC分类】C12N5/077, A61K49/00, C12N5/074, C12N5/0775, C12N5/0789
【公开号】CN105713870
【申请号】CN201610122921
【发明人】刘小青
【申请人】佰通生物技术(苏州)有限公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年3月4日